Name: convection enhanced delivery of optogenetic adeno-associated viral vector to the cortex of rhesus macaque under guidance of online mri images
Uploaded: 2019-05-23T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Convection Enhanced Delivery of Optogenetic Adeno-associated Viral Vector to the Cortex of Rhesus Macaque Under Guidance of Online MRI Images at JoVE.com

Diese Arbeit wurde von American Heart Association Postdoctoral fellowship (AY), Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA) Reorganization and Plasticity to Accelerate Injury Recovery (REPAIR; N66001-10-C-2010), R01. NS073940 und vom UCSF Neuroscience Imaging Center. Diese Arbeit wurde auch vom Eunice Kennedy Shiver National Institute of Child Health & Human Development der National Institutes of Health unter der Award-Nummer K12HD073945, dem Washington National Primate Research Center (WaNPCR, P51 OD010425) und das Center for Neurotechnology (CNT, ein Forschungszentrum der National Science Foundation Engineering Research Center unter Grant EEC-1028725). Wir danken Camilo Diaz-Botia, Tim Hanson, Viktor Kharazia, Daniel Silversmith, Karen J. MacLeod, Juliana Milani und Blakely Andrews für ihre Hilfe bei den Experimenten und Nan Tian, Jiwei He, Peter Ledochowitsch, Michel Maharbiz und Toni Haun für die technische Hilfe.

Alle Verfahren wurden von der University of California, San Francisco Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigt und entsprechen dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren. Das folgende Verfahren wurde mit zwei erwachsenen männlichen Rhesusmakaken im Alter von 8 und 7 Jahren mit einem Gewicht von 17,5 kg bzw. 16,5 kg (Affe G und Affe J) durchgeführt.
HINWEIS: Verwenden Sie standardmäßige aseptische Techniken für alle chirurgischen Eingriffe.
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	<li>Ruiz, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetics+through+windows+on+the+brain+in+the+nonhuman+primate.">Optogenetics through windows on the brain in the nonhuman primate.</a> Journal of Neurophysiology. 110 (6), 1455-1467 (2013).</li><li>Diester, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optogenetic+toolbox+designed+for+primates.">An optogenetic toolbox designed for primates.</a> Nature Neuroscience. 14 (3), 387-397 (2011).</li><li>Ohayon, S., Grimaldi, P., Schweers, N., Tsao, D. 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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saccadic+eye+movements+evoked+by+optogenetic+activation+of+primate+V1.">Saccadic eye movements evoked by optogenetic activation of primate V1.</a> Nature Neuroscience. 15 (10), 1368-1370 (2012).</li><li>Dai, J., Brooks, D. I., Sheinberg, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+and+electrical+microstimulation+systematically+bias+visuospatial+choice+in+primates.">Optogenetic and electrical microstimulation systematically bias visuospatial choice in primates.</a> Current Biology. 24 (1), 63-69 (2014).</li><li>Afraz, A., Boyden, E. S., DiCarlo, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+and+pharmacological+suppression+of+spatial+clusters+of+face+neurons+reveal+their+causal+role+in+face+gender+discrimination.">Optogenetic and pharmacological suppression of spatial clusters of face neurons reveal their causal role in face gender discrimination.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (21), 6730-6735 (2015).</li><li>Ledochowitsch, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+optical+control+and+simultaneous+electrical+readout+of+extended+cortical+circuits.">Strategies for optical control and simultaneous electrical readout of extended cortical circuits.</a> Journal of Neuroscience Methods. 256, 220-231 (2015).</li><li>Yazdan-Shahmorad, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Large-Scale+Interface+for+Optogenetic+Stimulation+and+Recording+in+Nonhuman+Primates.">A Large-Scale Interface for Optogenetic Stimulation and Recording in Nonhuman Primates.</a> Neuron. 89 (5), 927-939 (2016).</li><li>Ju, N., Jiang, R., Macknik, S. L., Martinez-Conde, S., Tang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+all-optical+interrogation+of+cortical+neurons+in+awake-behaving+nonhuman+primates.">Long-term all-optical interrogation of cortical neurons in awake-behaving nonhuman primates.</a> PLoS Biology. 16 (8), e2005839 (2018).</li><li>Bankiewicz, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convection-enhanced+delivery+of+AAV+vector+in+parkinsonian+monkeys;+in+vivo+detection+of+gene+expression+and+restoration+of+dopaminergic+function+using+pro-drug+approach.">Convection-enhanced delivery of AAV vector in parkinsonian monkeys; in vivo detection of gene expression and restoration of dopaminergic function using pro-drug approach.</a> Experimental Neurology. 164 (1), 2-14 (2000).</li><li>Kells, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+therapy-based+method+for+the+delivery+of+therapeutics+to+primate+cortex.">Efficient gene therapy-based method for the delivery of therapeutics to primate cortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (7), 2407-2411 (2009).</li><li>Krauze, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reflux-free+cannula+for+convection-enhanced+high-speed+delivery+of+therapeutic+agents.">Reflux-free cannula for convection-enhanced high-speed delivery of therapeutic agents.</a> Journal of Neurosurgery. 103 (5), 923-929 (2005).</li><li>Yazdan-Shahmorad, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+optogenetic+expression+in+macaque+cortex+obtained+with+MR-guided,+convection+enhanced+delivery+(CED)+of+AAV+vector+to+the+thalamus.">Widespread optogenetic expression in macaque cortex obtained with MR-guided, convection enhanced delivery (CED) of AAV vector to the thalamus.</a> Journal of Neuroscience Methods. 293, 347-358 (2018).</li><li>Yazdan-Shahmorad, A., Silversmith, D. B., Kharazia, V., Sabes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+cortical+reorganization+using+optogenetics+in+non-human+primates.">Targeted cortical reorganization using optogenetics in non-human primates.</a> Elife. 7, (2018).</li><li>Yazdan-Shahmorad, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demonstration+of+a+setup+for+chronic+optogenetic+stimulation+and+recording+across+cortical+areas+in+non-human+primates.">Demonstration of a setup for chronic optogenetic stimulation and recording across cortical areas in non-human primates.</a> SPIE BiOS. , (2015).</li><li>Lerchner, W., Corgiat, B., Der Minassian, V., Saunders, R. C., Richmond, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injection+parameters+and+virus+dependent+choice+of+promoters+to+improve+neuron+targeting+in+the+nonhuman+primate+brain.">Injection parameters and virus dependent choice of promoters to improve neuron targeting in the nonhuman primate brain.</a> Gene Therapy. 21 (3), 233-241 (2014).</li><li>Acker, L., Pino, E. N., Boyden, E. S., Desimone, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FEF+inactivation+with+improved+optogenetic+methods.">FEF inactivation with improved optogenetic methods.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (46), (2016).</li><li>Bobo, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convection-enhanced+delivery+of+macromolecules+in+the+brain.">Convection-enhanced delivery of macromolecules in the brain.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (6), 2076-2080 (1994).</li><li>Lieberman, D. M., Laske, D. W., Morrison, P. F., Bankiewicz, K. S., Oldfield, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convection-enhanced+distribution+of+large+molecules+in+gray+matter+during+interstitial+drug+infusion.">Convection-enhanced distribution of large molecules in gray matter during interstitial drug infusion.</a> Journal of Neurosurgery. 82 (6), 1021-1029 (1995).</li><li>Lonser, R. R., Gogate, N., Morrison, P. F., Wood, J. D., Oldfield, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+convective+delivery+of+macromolecules+to+the+spinal+cord.">Direct convective delivery of macromolecules to the spinal cord.</a> Journal of Neurosurgery. 89 (4), 616-622 (1998).</li><li>Szerlip, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+of+convection-enhanced+delivery+of+viruses+and+virus-sized+particles.">Real-time imaging of convection-enhanced delivery of viruses and virus-sized particles.</a> Journal of Neurosurgery. 107 (3), 560-567 (2007).</li></ol>

Hier skizzieren wir eine praktikable und effiziente Technik zur Erzielung einer großflächigen optogenetischen Expression in NHP primärssomatosensorischer und motorischer Kortex durch MR-geführte CED. Die Verwendung von MR-geführtem CED bietet erhebliche Vorteile gegenüber herkömmlichen Methoden der viralen Infusion im NHP-Gehirn. Ein solcher Vorteil ist die Fähigkeit, Expression über große Gebiete mit weniger erforderlichen Infusionen zu erreichen. Zum Beispiel, mit herkömmlichen Methoden, Mehrfachinjektionen ...

Optogenetik ist ein leistungsfähiges Werkzeug, das die Manipulation der neuronalen Aktivität und die Untersuchung von Netzwerkverbindungen im Gehirn ermöglicht. Die Implementierung dieser Technik bei nicht-menschlichen Primaten (NHPs) hat das Potenzial, unser Verständnis von groß angelegter neuronaler Berechnung, Kognition und Verhalten im Primatengehirn zu verbessern. Obwohl die Optogenetik in den letzten Jahren erfolgreich in NHPs implementiert wurde1,2,3,4,5,6,eine Herausforderung, die Forscher gesicht endiebe hohe Ausdrucksniveaus über große Hirnbereiche bei diesen Tieren. Hier bieten wir einen effizienten und vereinfachten Ansatz, um ein hohes Maß an optogenetischer Expression über große Bereiche des Kortex in Makaken zu erreichen. Diese Technik hat großes Potenzial, aktuelle optogenetische Studien an diesen Tieren inKombination mit modernsten Aufnahmen 8,9 und optischestimulation10 Technologien zu verbessern.
Konvektionsverstärkte Abgabe (CED) ist eine etablierte Methode der Lieferung von pharmakologischen Wirkstoffen und anderen großen Molekülen, einschließlich viraler Vektoren, an das zentrale Nervensystem11,12,13. Während herkömmliche Verabreichungsmethoden mehrere Infusionen mit geringem Volumen beinhalten, die über kleine Regionen des Gehirns verteilt sind, kann CED eine breitere und gleichmäßigere Agentenverteilung mit weniger Infusionen erreichen. Druckgetriebene Massenflüssigkeitsströme (Konvektion) während der Infusion ermöglichen eine breitere und gleichmäßig verteilte Transduktion des Zielgewebes bei der Bereitstellung viraler Vektoren mit CED. In neueren Studien haben wir die Transduktion und anschließende optogenetische Expression großer Bereiche der Primärmotor (M1) und somatosensorischen (S1) Kortika9 und Thalamus14 mit Magnetresonanz (MR)-geführtem CED nachgewiesen.
Hier skizzieren wir die Verwendung von CED, um eine optogenetische Expression über große kortikale Bereiche mit nur wenigen kortikalen Injektionen zu erreichen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 mL High Pressure IV Tubing</td>
			<td>Smiths Medical Inc., Dublin, OH, USA</td>
			<td>533640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.32 mm ID, 0.43 mm OD Silica Tubing</td>
			<td>Polymicro Technologies</td>
			<td>1068150027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 mm ID, 0.76 mm OD Silica Tubing</td>
			<td>Polymicro Technologies</td>
			<td>1068150625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV2.5-CamKII-C1V1-EYFP</td>
			<td>Penn Vector Core, University of Pennsylvania</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABS plastic</td>
			<td>Stratasys, MN, USA</td>
			<td>ABSplus-P430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimicrobial incise drape</td>
			<td>3M</td>
			<td>6650EZ</td>
			<td>Ioban Drape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental Acrylic</td>
			<td>Henry Schein, Inc.</td>
			<td>1013117</td>
			<td>Acrylic Bonding Agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elevators</td>
			<td>VWR International, LLC.</td>
			<td>10196-564</td>
			<td>Langenbeck Elevator, Wide Tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine suture</td>
			<td>McKesson Medical-Surgical Inc.</td>
			<td>1034505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gadoteridol</td>
			<td>Prohance, Bracco Diagnostics, Princeton, NJ</td>
			<td>0270-1111-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser for light stimulation</td>
			<td>Omicron-Laserage, Germany</td>
			<td>PhoxX 488-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MR compatible 3cc syringe</td>
			<td>Harvard apparatus, Holliston, MA, USA</td>
			<td>59-8377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MR Imaging Software</td>
			<td>Pixmeo</td>
			<td>OsiriX MD 10.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MR-Compatible Pump</td>
			<td>Harvard apparatus, Holliston, MA, USA</td>
			<td>Harvard PHD 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MR-compatible stereotaxic frame</td>
			<td>KOPF</td>
			<td>1430M MRI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perifix Clamp Style Catheter Connector</td>
			<td>B-Braun, Bethlehem, PA, USA</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Screws</td>
			<td>Plastics 1</td>
			<td>0-80 x 1/8N</td>
			<td>Nylon screws</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titanium screws</td>
			<td>Crist Instrument Co., Inc.</td>
			<td>6-YCX-0312</td>
			<td>Self-tapping bone screws</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trephine</td>
			<td>GerMedUSA Inc,</td>
			<td>SKU:GV70-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>uPrinter SE 3D printer</td>
			<td>Stratasys, MN, USA</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin E Capsule</td>
			<td>Pure Encapsulations, LLC.</td>
			<td>DE1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wet sterile absorbable gelatin</td>
			<td>Pfizer Inc.</td>
			<td>AZL0009034201</td>
			<td>Gelfoam</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

convection enhanced delivery of optogenetic adeno-associated viral vector to the cortex of rhesus macaque under guidance of online mri images

In der Optogenetik von nicht-menschlichen Primaten (NHP) ist die Infektion großer kortikaler Bereiche mit viralen Vektoren oft eine schwierige und zeitaufwändige Aufgabe. Hier zeigen wir die Verwendung von Magnetresonanz (MR)-geführte Konvektions-verstärkte Abgabe (CED) optogenetischer viraler Vektoren in primäre somatosensorische (S1) und motorische (M1) Kortiken von Makaken, um eine effiziente, weitverbreitete kortikale Expression von lichtempfindliche Ionenkanäle. Adeno-assoziierte virale (AAV) Vektoren, die das rot verschobene Opsin C1V1 kodieren, das mit gelbem fluoreszierendem Protein (EYFP) verschmolzen ist, wurden unter MR-geführtem CED in den Kortex von Rhesusmakaken injiziert. Drei Monate nach der Infusion bestätigte die epifluoreszierende Bildgebung große Regionen optogenetischer Expression (>130 mm2) in M1 und S1 in zwei Makaken. Darüber hinaus konnten wir zuverlässige lichtevokierte elektrophysiologische Reaktionen aus den exzessierten Bereichen mit mikroelektrokortikographischen Arrays aufzeichnen. Spätere histologische Analysen und Immunflecken gegen den Reporter ergaben eine weit verbreitete und dichte optogenetische Expression in M1 und S1, die der Verteilung entspricht, die durch epifluoreszierende Bildgebung angezeigt wird. Diese Technik ermöglicht es uns, innerhalb eines kürzeren Zeitraums mit minimalen Schäden im Vergleich zu den herkömmlichen Techniken Expression über große Bereiche des Kortex zu erhalten und kann ein optimaler Ansatz für die optogenetische Virusabgabe bei großen Tieren wie NHPs sein. Dieser Ansatz zeigt ein großes Potenzial für die Manipulation neuronaler Schaltkreise auf Netzwerkebene mit Zelltyp-Spezifität in Tiermodellen, die evolutionär nah am Menschen sind.

Convection Enhanced Delivery (CED) unter MRT-Leitfaden
Die Ausbreitung des viralen Vektors wurde während der CED-Infusion unter Anleitung von Online-MR-Bildern überwacht (Abbildung 3A). In dieser Studie wurden S1 und M1 von zwei Affen ins Visier genommen (Abbildung 3B). Die dreidimensionalen Verteilungsvolumina wurden in einer Post-hoc-Analyse der MR-...

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Convection Enhanced Delivery of Optogenetic Adeno-associated Viral Vector to the Cortex of Rhesus Macaque Under Guidance of Online MRI Images

Hier zeigen wir Magnetresonanz (MR)-geführte Konvektions-verstärkte Abgabe (CED) von viralen Vektoren in den Kortex als effizienten und vereinfachten Ansatz zur Erzielung optogenetischer Expression über große kortikale Bereiche im Makakenhirn hinweg.

Konvektion Verbesserte Lieferung von optogenetischen Adeno-assoziierten Viral vektor an den Cortex von Rhesus Macaque unter Anleitung von Online-MRT-Bildern

In non-human primate (NHP) optogenetics, infecting large cortical areas with viral vectors is often a difficult and time-consuming task. Here, we ...

Konvektionsverbesserte Abgabe(CED) von optogenetischen Virusvektoren bei nichtmenschlichen Primaten wird es Forschern ermöglichen, neuronale Aktivität in großem Maßstab zu manipulieren, um komplexe neuronale Berechnungen und Verhaltensweisen zu verstehen. Mit CED können wir eine hohe optogenetische Expression über große Regionen des Primatenhirns mit nur wenigen Injektionen in kurzer Zeit im Vergleich zu traditionellen Methoden erreichen. Magnetresonanz oder MR-kompatible Kammerimplantation wird in DerRegel bei nichtmenschlichen Primatenoperationen durchgeführt, das Verfahren wird im Textprotokoll ausführlich beschrieben und in diesem Video kurz beschrieben.Nach der Sedierung, Positionierung und anfänglichen Einschnitte, wie im Textprotokoll beschrieben, erstellen Sie eine kreisförmige Kraniotomie, um die vorgeplanten Flugbahnen für Injektionen mit einem Trephin abzudecken. Erstellen Sie einen Einzug in der Mitte der geplanten Kraniotomie ausreichend tief im Schädel, um das Trephin mit dem einstellbaren Mittelpunkt des Trephins zu verankern. Sobald die Mitte gemacht ist, senken Sie das Trephin auf den Schädel und drehen Sie das Trephin im Uhrzeigersinn und gegen den Uhrzeigersinn, während Sie Abwärtsdruck ausüben, bis die Knochenkappe mit Zangen entfernt werden kann.Nach dem Anheben der Dura, wie im Textprotokoll beschrieben, schneiden Sie die Dura von der Mitte bis zum Rand der Kraniotomie und fahren Sie entlang der Kante mit feiner ophthalmologischer Schere fort. Montieren Sie die zylindrische maßgeschneiderte Konvektion verbesserte Lieferung MR-kompatible Kammer auf den Schädel auf der Oberseite der Kraniotomie, um Kanülenunterstützung während der Infusion zu bieten, so dass die Krümmung des Kammerflanschguts gut mit der Krümmung des Schädels ausgerichtet ist. Befestigen Sie die Implantate am Schädel entweder mit Kunststoffschrauben und Dental-Acryl oder ein paar Titanschrauben.Befüllen Sie das Gitter kurz nach dem Implantieren der MR-kompatiblen Kammer und dem Einsetzen des Kanüleninjektionsgitters mit 0,9% Saline zur Visualisierung der Injektionsstellen über MR-anatomische Bilder. Füllen Sie auch die Kammerhohlräume mit nasssterilem, resorbierbarem Gelschaum, um die Feuchtigkeit des Gehirns aufrechtzuerhalten. Bedecken Sie die Haut und den Zylinder mit einem sterilen antimikrobiellen Schneidvorschnitt, um die Sterilität der Zylinder während des Transports und MR-Infusionen aufrechtzuerhalten.Legen Sie eine Vitamin-E-Kapsel, um die Oberseite des Injektionsgitters für eine positive Identifizierung zu markieren. Während das Tier intubiert bleibt, lösen Sie das Endotrachealrohr aus dem Anästhesiekreislauf und befestigen Sie es wieder an einer tragbaren MR-kompatiblen Isofluran-Maschine. Transportieren Sie das Tier zum MRT-Scanner.Erfassen Sie T1-Bilder, um den Abstand vom oberen Rand des Injektionsgitters und der kortikalen Oberfläche zu berechnen. Die Vitamin-E-Kapsel ist in T1-Bildern deutlich sichtbar und sollte als Marker für die Oberseite des Injektionsgitters verwendet werden. Erfassen Sie T2-Bilder, um die optimalen Kanülenführungen für jeden Standort basierend auf dem Zielort der Infusion zu bestimmen.Das Kanülenraster ist mit Einer Saline gefüllt, die in T2-Bildern am besten sichtbar ist. Mit der MR-Bildgebungssoftware scrollen Sie durch die koronalen und sagittalen Ebenen, um den Zielort der Infusion zu finden. Nachdem Sie den viralen Vektor für ein paar Stunden bei Raumtemperatur auftauen, mischen Sie den viralen Vektor mit dem MR-Kontrastmittel Gadoteridol durch Pipetten- oder Wirbelmischung.Laden Sie das gemischte Virus in 0,2 Milliliter Hochdruck-IV-Schläuche. Mit Hochdruck-IV-Schläuchen eine lange Verlängerungsleitung an eine MR-kompatible Drei-Milliliter-Spritze anschließen und mit Kochsaline grundieren. Schließen Sie das andere Ende des langen Verlängerungsschlauchs an die 0,2 Milliliter IV-Schläuche an, die mit dem Virus beladen sind.Dann befestigen Sie die refluxbeständige Kanüle mit einer ein Milliliter gestuften Spitze mit einem Klemmen-Katheterstecker am distalen Ende dieser Baugruppe. Stellen Sie die Spritze schließlich in eine MR-kompatible Pumpe ein. Wählen Sie anhand der erhaltenen anatomischen MR-Basisbilder die Position des Kanüleninjektionsgitters und die Einfügetiefe aus, die erforderlich sind, um die Zielinfusionsstelle zu erreichen.Markieren Sie die Einfügetiefe auf der Kanüle mit sterilem Klebeband. Beginnen Sie die Infusion mit einer Rate von einem Mikroliter pro Minute und validieren Sie den Fluss der Flüssigkeit in der Infusionslinie visuell, indem Sie den Auswurf von Flüssigkeit aus der Kanülenspitze beobachten. Legen Sie die Kanüle manuell durch das Injektionsgitter in die Zieltiefe ein und halten Sie gleichzeitig den Durchfluss in der Infusionslinie aufrecht, da dies verhindert, dass das eingedrungene Gewebe die Kanüle während des Einsetzens verstopft.Erfassen Sie jetzt schnelle Flash-T1-gewichtete Bilder für die Online-Überwachung der viralen Vektorinfusion. Nach der Infundierung von ca. 10 Mikroliter des Vektors, so dass genügend Viren in den MR-Scanner infundiert werden, erhalten Sie MR-Bilder, um die korrekte Kanülenplatzierung zu überprüfen, wie die stagnierte Ausbreitung des Virus zeigt. Wenn die Tiefe der eingelegten Kanüle falsch ist, passen Sie die Tiefe entsprechend an oder entfernen Sie langsam die Kanüle, und versuchen Sie erneut, die Einfügung zu versuchen.Überwachen Sie die Infusion durch Anleitung von Online-MR-Bildern. Erhöhen Sie die Infusionsrate auf fünf Mikroliter pro Minute um einen Mikroliter pro Minute Schritte alle paar Minuten. Es ist wichtig, die Infusionsrate langsam zu erhöhen und nicht mehr als fünf Mikroliter pro Minute zu überschreiten, da hohe Infusionsraten Gewebeschäden verursachen könnten.Nachdem Sie etwa 40 Mikroliter des viralen Vektors infundiert haben, beginnen Sie, die Infusionsrate um einen Mikroliter pro Minute zu reduzieren. Beenden Sie die Infusion, nachdem ca. 50 Mikroliter injiziert wurden. Lassen Sie die Kanüle für zehn Minuten an Ort und Stelle.Entfernen Sie langsam die Kanüle aus dem Gehirn und bewegen Sie sich zum nächsten Ort. Den Zylinder vor dem Tiertransport mit einem sterilen Vorhang am Ende der Injektionen bedecken und das Tier dann zurück in den Operationssaal transportieren. Histologische Analysen an seriellen koronalen Abschnitten zeigen eine großangelegte optogenetische Expression um die Infusionsstellen.Hier sind das koronale Basisbild und die Ausbreitung des Kontrastmittels nach der Infusion für dieselbe MR-Koronascheibe zu sehen. Ein koronaler Gewebeabschnitt wird ungefähr gleich dargestellt. Peroxidase-Färbung spiegelt die Expression des gelben fluoreszierenden Proteins oder EYFP-Reporters wider.Eine gute Ausrichtung wird zwischen dem Bereich der EYFP-Expression beobachtet, gemessen mit Oberflächenepifluoreszense und mit histologischer Färbung. Dazu gehört die Region der Vektorausbreitung, die aus MR-Bildern geschätzt wird. Weiße Punkte zeigen Injektionsstellen an und der gesamte schwarze Bereich stellt den Bereich dar, der durch die Craniotomie exponiert wird.Hier ist ein Bild mit geringer Vergrößerung der koronalen Abschnitte zu sehen, die mit einem GfP-Antikörper mit Anti-GFP-Antikörpern befleckt sind und den medialen lateralen Aspekt der YFP-Expression im somatosensorischen Kortex zeigen. Die schwarze Pfeilspitze zeigt die Position der Kanülenspur an. Das benachbarte Gewebe wird bei größerer Vergrößerung gezeigt, um eine laminare Verteilung der YFP-positiven Zellen zu zeigen.Dicht besiedelte Regionen von YFP-positiven Zellen befinden sich überwiegend in den Schichten zwei bis drei und fünf bis sechs. Eine weitere Vergrößerung zeigt typische Pyramidenzellen in den Schichten zwei bis drei, Schicht fünf und Schicht sechs. Es ist wichtig, die Kanüle für 10 Minuten an Ort und Stelle zu lassen, nachdem der Fluss gestoppt wurde.Dadurch wird sichergestellt, dass das Virus in das umgebende zielgerichtete Neuronalgewebe gelangt ist. CED ist ein effizienter Ansatz, um gleichmäßig hohe Expressionsniveaus in großen Hirnregionen bei Säugetieren zu erreichen. Es hat das Potenzial, unser Verständnis von neuronalen Schaltkreisen und Konnektivität zu erweitern.Nach viraler Transduktion durch CED können nachfolgende optogenetische Stimulationsexperimente mit elektrischen Aufzeichnungs- und Verhaltens-Essays gepaart werden, um die komplexe Schaltungsdynamik im Gehirn zu enthüllen. Diese Technik wurde bereits 2018 von Yazdan-Shahmorad und Kollegen eingesetzt, bei der die optogenetische neuronale Modulation eingesetzt wurde, um netzwerkweite Konnektivitätsänderungen im sensorischen motorischen Kortex zu induzieren.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors

Intrakranielle Injektion von Adeno-assoziierte virale Vektoren

Intracranial injection of viral vectors engineered to express a fluorescent protein is a versatile labeling technique for visualization of specific ...

Forschung

Neurowissenschaften

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Selektive Viral Transduktion von Adult-geboren olfaktorischen Neuronen für chronische In vivo Optogenetische Stimulation

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells ...

Simultaneous Electroencephalography, Real-time Measurement of Lactate Concentration and Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity in the Rodent Cerebral Cortex

Gleichzeitige Elektroenzephalographie, Real-time Messung der Laktat-Konzentration und optogenetische Manipulation der neuronalen Aktivität in der Nagetier Cerebral Cortex

Although the brain represents less than 5% of the body  by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body  at rest1. The ...

Optogenetic Functional MRI

Optogenetische Functional MRI

The investigation of the functional connectivity of precise neural circuits across the entire intact brain can be achieved through optogenetic functional ...

Subpial Adeno-associated Virus 9 (AAV9) Vector Delivery in Adult Mice

Subpial Adeno-associated Virus 9 AAV9 Vector Delivery in Adult Mice

Subpial Adeno-assoziiertes Virus 9 (AAV9) Vektorlieferung in erwachsenen Mäusen

The successful development of a subpial adeno-associated virus 9 (AAV9) vector delivery technique in adult rats and pigs has been reported on previously. ...

Effects of Transcranial Alternating Current Stimulation on the Primary Motor Cortex by Online Combined Approach with Transcranial Magnetic Stimulation

Effekte der transkraniellen Wechselstrom Stimulation auf Primärbewegungsrinde durch Online-kombinierter Ansatz mit Transcranial magnetische Anregung

Transcranial Alternating Current Stimulation (tACS) is a neuromodulatory technique able to act through sinusoidal electrical waveforms in a specific ...

Adeno-associated Virus-mediated Transgene Expression in Genetically Defined Neurons of the Spinal Cord

Adeno-assoziierten Virus-vermittelten Transgene Ausdruck in genetisch definierten Nervenzellen des Rückenmarks

Selective manipulation of spinal neuronal subpopulations has mainly been achieved by two different methods: 1) Intersectional genetics, whereby double or ...

Automated Segmentation of Cortical Grey Matter from T1-Weighted MRI Images

Automatische Segmentierung der kortikalen grauen Zellen von T1-gewichteten MRT-Aufnahmen

Within neuroimaging research, a number of recent studies have discussed the impact of between-study differences in volumetric findings that are thought to ...

Direct Intrathecal Injection of Recombinant Adeno-associated Viruses in Adult Mice

Direkte intrathekale Injektion von Recombinant Adeno-assoziierten Viren bei Erwachsenen Mäusen

Intrathecal (IT) injection of adeno-associated virus (AAV) has drawn considerable interest in CNS gene therapy by virtue of its safety, noninvasiveness, ...

Delivery of Antibodies into the Murine Brain via Convection-enhanced Delivery

Lieferung von Antikörpern in das Murine Gehirn über Konvektionsverstärkte Lieferung

Convection-enhanced delivery (CED) is a neurosurgical technique enabling effective perfusion of large brain volumes using a catheter system. Such an ...