Name: convection enhanced delivery of optogenetic adeno-associated viral vector to the cortex of rhesus macaque under guidance of online mri images
Uploaded: 2019-05-23T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Convection Enhanced Delivery of Optogenetic Adeno-associated Viral Vector to the Cortex of Rhesus Macaque Under Guidance of Online MRI Images at JoVE.com

עבודה זו נתמכת על ידי האגודה האמריקנית למחקר בתר-דוקטורט (AY), הגנה מתקדמים מחקר פרויקטים הסוכנות (DARPA) התארגנות ופלסטיות כדי להאיץ שחזור פציעה (תיקון; N66001-10-C-2010), R01. NS073940, ועל ידי המרכז לדימות מדעי המוח. עבודה זו נתמכת גם על ידי המכון הלאומי של יוניס קנדי רעד של בריאות הילד & התפתחות האדם של המכון הלאומי לבריאות תחת הפרס מספר K12HD073945, המרכז הלאומי לחקר הפרימטים של וושינגטון (WaNPCR, וסטנג p51 OD010425), ו המרכז למדעי המוח (CNT, מרכז המדע הלאומי לחקר הנדסת בסיס במסגרת גרנט EEC-1028725). אנו מודים לקאמילו דיאז-בוטיה, טים הנסון, ויקטור ח'אזייה, דניאל סילברסמית ', קארן ג'יי מקלאוד, ג'וליאנה, ובלייקלי אנדרוס על עזרתם בניסויים ובנאן טיאן, ג'יווי הוא, פיטר לדוצ'ניש, מישל מהריביז, וטוני האון לעזרה טכנית.

כל ההליכים אושרו על ידי אוניברסיטת קליפורניה, סן פרנסיסקו מוסדיים טיפול בעלי חיים הוועדה השימוש (IACUC) והם תואמים את המדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה. ההליך הבא נעשה באמצעות שני רזוס קופי מבוגר הזכר של 8 ו 7 שנים של גיל, במשקל 17.5 ק"ג ו 16.5 ק"ג (קוף G ו-J קוף), בהתאמה.
הערה: השתמש בטכני?...

<ol>
	<li>Ruiz, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetics+through+windows+on+the+brain+in+the+nonhuman+primate.">Optogenetics through windows on the brain in the nonhuman primate.</a> Journal of Neurophysiology. 110 (6), 1455-1467 (2013).</li><li>Diester, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optogenetic+toolbox+designed+for+primates.">An optogenetic toolbox designed for primates.</a> Nature Neuroscience. 14 (3), 387-397 (2011).</li><li>Ohayon, S., Grimaldi, P., Schweers, N., Tsao, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saccade+modulation+by+optical+and+electrical+stimulation+in+the+macaque+frontal+eye+field.">Saccade modulation by optical and electrical stimulation in the macaque frontal eye field.</a> Journal of Neuroscience. 33 (42), 16684-16697 (2013).</li><li>Gerits, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetically+induced+behavioral+and+functional+network+changes+in+primates.">Optogenetically induced behavioral and functional network changes in primates.</a> Current Biology. 22 (18), 1722-1726 (2012).</li><li>Jazayeri, M., Lindbloom-Brown, Z., Horwitz, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saccadic+eye+movements+evoked+by+optogenetic+activation+of+primate+V1.">Saccadic eye movements evoked by optogenetic activation of primate V1.</a> Nature Neuroscience. 15 (10), 1368-1370 (2012).</li><li>Dai, J., Brooks, D. I., Sheinberg, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+and+electrical+microstimulation+systematically+bias+visuospatial+choice+in+primates.">Optogenetic and electrical microstimulation systematically bias visuospatial choice in primates.</a> Current Biology. 24 (1), 63-69 (2014).</li><li>Afraz, A., Boyden, E. S., DiCarlo, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+and+pharmacological+suppression+of+spatial+clusters+of+face+neurons+reveal+their+causal+role+in+face+gender+discrimination.">Optogenetic and pharmacological suppression of spatial clusters of face neurons reveal their causal role in face gender discrimination.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (21), 6730-6735 (2015).</li><li>Ledochowitsch, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+optical+control+and+simultaneous+electrical+readout+of+extended+cortical+circuits.">Strategies for optical control and simultaneous electrical readout of extended cortical circuits.</a> Journal of Neuroscience Methods. 256, 220-231 (2015).</li><li>Yazdan-Shahmorad, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Large-Scale+Interface+for+Optogenetic+Stimulation+and+Recording+in+Nonhuman+Primates.">A Large-Scale Interface for Optogenetic Stimulation and Recording in Nonhuman Primates.</a> Neuron. 89 (5), 927-939 (2016).</li><li>Ju, N., Jiang, R., Macknik, S. L., Martinez-Conde, S., Tang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+all-optical+interrogation+of+cortical+neurons+in+awake-behaving+nonhuman+primates.">Long-term all-optical interrogation of cortical neurons in awake-behaving nonhuman primates.</a> PLoS Biology. 16 (8), e2005839 (2018).</li><li>Bankiewicz, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convection-enhanced+delivery+of+AAV+vector+in+parkinsonian+monkeys;+in+vivo+detection+of+gene+expression+and+restoration+of+dopaminergic+function+using+pro-drug+approach.">Convection-enhanced delivery of AAV vector in parkinsonian monkeys; in vivo detection of gene expression and restoration of dopaminergic function using pro-drug approach.</a> Experimental Neurology. 164 (1), 2-14 (2000).</li><li>Kells, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+therapy-based+method+for+the+delivery+of+therapeutics+to+primate+cortex.">Efficient gene therapy-based method for the delivery of therapeutics to primate cortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (7), 2407-2411 (2009).</li><li>Krauze, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reflux-free+cannula+for+convection-enhanced+high-speed+delivery+of+therapeutic+agents.">Reflux-free cannula for convection-enhanced high-speed delivery of therapeutic agents.</a> Journal of Neurosurgery. 103 (5), 923-929 (2005).</li><li>Yazdan-Shahmorad, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+optogenetic+expression+in+macaque+cortex+obtained+with+MR-guided,+convection+enhanced+delivery+(CED)+of+AAV+vector+to+the+thalamus.">Widespread optogenetic expression in macaque cortex obtained with MR-guided, convection enhanced delivery (CED) of AAV vector to the thalamus.</a> Journal of Neuroscience Methods. 293, 347-358 (2018).</li><li>Yazdan-Shahmorad, A., Silversmith, D. B., Kharazia, V., Sabes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+cortical+reorganization+using+optogenetics+in+non-human+primates.">Targeted cortical reorganization using optogenetics in non-human primates.</a> Elife. 7, (2018).</li><li>Yazdan-Shahmorad, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demonstration+of+a+setup+for+chronic+optogenetic+stimulation+and+recording+across+cortical+areas+in+non-human+primates.">Demonstration of a setup for chronic optogenetic stimulation and recording across cortical areas in non-human primates.</a> SPIE BiOS. , (2015).</li><li>Lerchner, W., Corgiat, B., Der Minassian, V., Saunders, R. C., Richmond, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injection+parameters+and+virus+dependent+choice+of+promoters+to+improve+neuron+targeting+in+the+nonhuman+primate+brain.">Injection parameters and virus dependent choice of promoters to improve neuron targeting in the nonhuman primate brain.</a> Gene Therapy. 21 (3), 233-241 (2014).</li><li>Acker, L., Pino, E. N., Boyden, E. S., Desimone, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FEF+inactivation+with+improved+optogenetic+methods.">FEF inactivation with improved optogenetic methods.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (46), (2016).</li><li>Bobo, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convection-enhanced+delivery+of+macromolecules+in+the+brain.">Convection-enhanced delivery of macromolecules in the brain.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (6), 2076-2080 (1994).</li><li>Lieberman, D. M., Laske, D. W., Morrison, P. F., Bankiewicz, K. S., Oldfield, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convection-enhanced+distribution+of+large+molecules+in+gray+matter+during+interstitial+drug+infusion.">Convection-enhanced distribution of large molecules in gray matter during interstitial drug infusion.</a> Journal of Neurosurgery. 82 (6), 1021-1029 (1995).</li><li>Lonser, R. R., Gogate, N., Morrison, P. F., Wood, J. D., Oldfield, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+convective+delivery+of+macromolecules+to+the+spinal+cord.">Direct convective delivery of macromolecules to the spinal cord.</a> Journal of Neurosurgery. 89 (4), 616-622 (1998).</li><li>Szerlip, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+of+convection-enhanced+delivery+of+viruses+and+virus-sized+particles.">Real-time imaging of convection-enhanced delivery of viruses and virus-sized particles.</a> Journal of Neurosurgery. 107 (3), 560-567 (2007).</li></ol>

כאן, אנו מתווה טכניקה אפשרית ויעילה להשגת ביטוי האופגנטי בקנה מידה גדול ב-NHP המוח העיקרי של התפקוד המוטורי וקליפת המנוע של MR-מונחה. השימוש MR-מונחה מציג יתרונות משמעותיים על שיטות מסורתיות של עירוי ויראלי במוח NHP. יתרון אחד כזה הוא היכולת להשיג ביטוי על פני אזורים גדולים ובעלי חליטות פחות נד?...

אלקטרואופטיקה היא כלי רב עוצמה המאפשר מניפולציה של פעילות עצבית וחקר חיבורי הרשת במוח. יישום טכניקה זו בפרימטים לא אנושיים (NHPs) יש את הפוטנציאל לשפר את הבנתנו את ההבנה שלנו של חישוביות עצבית בקנה מידה גדול, קוגניציה והתנהגות במוח הפרימטים. למרות אלקטרואופטיקה יושמה בהצלחה nhps בשנים האחרונות1,2,3,4,5,6,7, אתגר כי פנים החוקרים משיג רמות גבוהות של ביטוי על פני אזורי מוח גדולים בבעלי חיים אלה. כאן, אנו מספקים גישה יעילה ופשוטה כדי להשיג רמות גבוהות של ביטוי אלקטרואופטיקה על פני אזורים גדולים של קליפת המוח בקופי. טכניקה זו יש פוטנציאל גדול לשפר את המחקרים אלקטרואופטיקה הנוכחי בבעלי חיים אלה בשילוב עם הקלטת המדינה האמנות8,9 ו גירוי אופטי10 טכנולוגיות.
הסעה משופרת משלוח (למעלה) היא שיטה הוקמה של משלוח של סוכני תרופתי ומולקולות גדולות אחרות, כולל וקטורים ויראלי, למערכת העצבים המרכזית11,12,13. בעוד שיטות המסירה המקובלת כרוכות במספר חליטות של נפח נמוך מספר מפוזרים על פני אזורים קטנים במוח, משרד הרישוי יכול להשיג הפצה רחבה יותר ואפילו יותר של הסוכן עם פחות חליטות. זרימת נוזל בצובר מונחה לחץ (הסעה) במהלך האינפוזיה מאפשר התמרה נרחבת יותר ואחידה מופץ של רקמת היעד בעת אספקת וקטורים ויראלי עם לח. במחקרים שנעשו לאחרונה, הדגמנו את התמרה ואת הביטוי האופגנטי העוקב של אזורים גדולים של מנוע ראשי (M1) והסוחושי (S1) הקורמיתיים9 ו תלמוס14 באמצעות תהודה מגנטית (MR)-מונחה.
כאן, אנו מתווה את השימוש ב-, כדי להשיג ביטוי אלקטרואופטיקה על פני אזורים קורטיקליים גדולים עם רק כמה זריקות קורטיקלית.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 mL High Pressure IV Tubing</td>
			<td>Smiths Medical Inc., Dublin, OH, USA</td>
			<td>533640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.32 mm ID, 0.43 mm OD Silica Tubing</td>
			<td>Polymicro Technologies</td>
			<td>1068150027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 mm ID, 0.76 mm OD Silica Tubing</td>
			<td>Polymicro Technologies</td>
			<td>1068150625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV2.5-CamKII-C1V1-EYFP</td>
			<td>Penn Vector Core, University of Pennsylvania</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABS plastic</td>
			<td>Stratasys, MN, USA</td>
			<td>ABSplus-P430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimicrobial incise drape</td>
			<td>3M</td>
			<td>6650EZ</td>
			<td>Ioban Drape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental Acrylic</td>
			<td>Henry Schein, Inc.</td>
			<td>1013117</td>
			<td>Acrylic Bonding Agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elevators</td>
			<td>VWR International, LLC.</td>
			<td>10196-564</td>
			<td>Langenbeck Elevator, Wide Tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine suture</td>
			<td>McKesson Medical-Surgical Inc.</td>
			<td>1034505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gadoteridol</td>
			<td>Prohance, Bracco Diagnostics, Princeton, NJ</td>
			<td>0270-1111-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser for light stimulation</td>
			<td>Omicron-Laserage, Germany</td>
			<td>PhoxX 488-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MR compatible 3cc syringe</td>
			<td>Harvard apparatus, Holliston, MA, USA</td>
			<td>59-8377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MR Imaging Software</td>
			<td>Pixmeo</td>
			<td>OsiriX MD 10.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MR-Compatible Pump</td>
			<td>Harvard apparatus, Holliston, MA, USA</td>
			<td>Harvard PHD 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MR-compatible stereotaxic frame</td>
			<td>KOPF</td>
			<td>1430M MRI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perifix Clamp Style Catheter Connector</td>
			<td>B-Braun, Bethlehem, PA, USA</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Screws</td>
			<td>Plastics 1</td>
			<td>0-80 x 1/8N</td>
			<td>Nylon screws</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titanium screws</td>
			<td>Crist Instrument Co., Inc.</td>
			<td>6-YCX-0312</td>
			<td>Self-tapping bone screws</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trephine</td>
			<td>GerMedUSA Inc,</td>
			<td>SKU:GV70-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>uPrinter SE 3D printer</td>
			<td>Stratasys, MN, USA</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin E Capsule</td>
			<td>Pure Encapsulations, LLC.</td>
			<td>DE1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wet sterile absorbable gelatin</td>
			<td>Pfizer Inc.</td>
			<td>AZL0009034201</td>
			<td>Gelfoam</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

convection enhanced delivery of optogenetic adeno-associated viral vector to the cortex of rhesus macaque under guidance of online mri images

בפרימטים שאינם אנושיים (NHP) אלקטרואופטיקה, הדבקת אזורים קורטיקליים גדולים עם וקטורים ויראליות היא לעתים קרובות משימה קשה זמן רב. כאן, אנו מדגימים את השימוש של תהודה מגנטית (MR)-הסעה מודרך משופר משלוח (למעלה) של אלקטרואופטיקה וקטורים ויראלי לתוך המגע הראשוני (S1) ו מנוע (M1) ממדקים של קופי לקבל יעיל, ביטוי קליפת המין הנרחב של ערוצי יונים רגישים לאור. Adeno-הקשורים ויראלי (aav) וקטורים קידוד האדום העביר אופסין C1V1 התמזגו חלבון פלורסנט צהוב (eyfp) הוזרקו לתוך קליפת התוכי רזוס ques תחת MR-מונחה על. שלושה חודשים פוסט אינפוזיה, הדמיה אפיפלורנטית אישר אזורים גדולים של ביטוי אלקטרואופטיקה (> 130 מ"מ2) ב M1 ו S1 בשני מקופי. יתר על כן, הצלחנו להקליט אמין אור מעורר התגובות האלקטרופיזיולוגיה מאזורי הביטוי באמצעות מיקרו-electrocorticographic מערכים. ניתוח היסטולוגית מאוחר יותר וכנגד העיתונאי חשף ביטוי אופגנטי נרחב וצפוף ב-M1 ו-S1 המתאימים להפצה המצוינת על ידי הדמיה אפיפלורנטית. טכניקה זו מאפשרת לנו להשיג ביטוי על פני אזורים גדולים של קליפת המוח בתוך תקופה קצרה יותר של זמן עם נזק מינימלי לעומת טכניקות מסורתיות והוא יכול להיות גישה אופטימלית עבור אלקטרואופטיקה משלוח נגיפי בעלי חיים גדולים כגון NHPs. גישה זו ממחישה פוטנציאל רב לתפעול ברמת הרשת של מעגלים עצביים עם ספציפיות לסוג התא במודלים של בעלי חיים הקרובים ביותר לבני אדם.

הסעה משופרת משלוח (לח) תחת הדרכה MRI
התפשטות של וקטור ויראלי היה מפוקח במהלך עירוי מתחת להדרכה של תמונות MR באינטרנט (איור 3A). במחקר זה, S1 ו M1 של שני קופים היו ממוקדות (איור 3B). אמצעי ההפצה התלת-ממדיים הו...

Watch this Scientific Journal Video about Convection Enhanced Delivery of Optogenetic Adeno-associated Viral Vector to the Cortex of Rhesus Macaque Under Guidance of Online MRI Images at JoVE.com

Convection Enhanced Delivery of Optogenetic Adeno-associated Viral Vector to the Cortex of Rhesus Macaque Under Guidance of Online MRI Images

כאן, אנו מדגימים תהודה מגנטית (MR)-הסעה מודרך משופרת משלוח (משופר) של וקטורים ויראלי לתוך קליפת המוח כגישה יעילה ומפושטת להשגת ביטוי אלקטרואופטיקה על פני אזורים קורטיקליים גדולים במוחו של מקוק.

הסעה משופר משלוח אלקטרואופטיקה Adeno-וקטור ויראלי הקשורים לקליפת מקוק רזוס תחת הדרכה של תמונות MRI מקוונות

In non-human primate (NHP) optogenetics, infecting large cortical areas with viral vectors is often a difficult and time-consuming task. Here, we ...

משלוח משופר הסעה, או CED, של וקטורים ויראליים אופטוגנטיים אצל פרימטים שאינם אנושיים יאפשר לחוקרים לתפעל פעילות עצבית בקנה מידה גדול כדי להבין חישובים עצביים מורכבים והתנהגויות. עם CED אנו יכולים להשיג ביטוי אופטוגנטי גבוה על פני אזורים גדולים של המוח הפרימט עם רק כמה זריקות בזמן קצר לעומת שיטות מסורתיות. תהודה מגנטית או השתלת תא תואמת MR מבוצעת באמצעות תרגול סטנדרטי בניתוחי פרימטים שאינם אנושיים, ההליך מתואר בפירוט בפרוטוקול הטקסט ומתואר בקצרה בסרטון זה.לאחר הרדמה, מיקום וחתך ראשוני של בעלי חיים כמתואר בפרוטוקול הטקסט, צור גולגולת מעגלית כדי לכסות את המסלולים התצורתיים מראש לזריקות באמצעות טרפין. צור חריץ במרכז הגולגולת המתוכננת עמוק מספיק בגולגולת כדי לעגן את הטרפין באמצעות נקודת מרכוזה מתכווננת של הטרפין. לאחר המרכז נעשה, להוריד את trephine על הגולגולת ולסובב את trephine בכיוון השעון נגד כיוון השעון תוך הפעלת לחץ כלפי מטה עד מכסה העצם ניתן להסיר עם מלקחים.לאחר הרמת דורה כמפורט בפרוטוקול הטקסט, חותכים את הדורא מהמרכז לקצה הגולגולת וממשיכים לאורך הקצה עם מספריים עיניים עדין. הר את מותאם אישית גלילי עשה הסעה משופרת משלוח MR תא תואם לגולגולת על גבי craniotomy כדי לספק תמיכה קנולה במהלך עירוי, כך העקמומיות של אוגן התא מתיישר היטב עם העקמומיות של הגולגולת. אבטחו את השתלים לגולגולת באמצעות ברגים מפלסטיק ואקריליק דנטלי או כמה ברגים של טיטניום.זמן קצר לאחר השתלת התא תואם MR והכנסת רשת הזרקת cannula לתוך התא, למלא את הרשת עם 0.9% מלוחים להדמיית מיקומי ההזרקה באמצעות תמונות אנטומיות MR. גם למלא את חללי התא עם קצף ג'ל סטרילי רטוב לספוג כדי לשמור על הלחות של המוח. מכסים את העור ואת הצילינדר עם וילון חרוט מיקרוביאלי סטרילי כדי לשמור על סטריליות של הצילינדרים במהלך הובלה וחליטות MR.מניחים כמוסה ויטמין E כדי לסמן את החלק העליון של רשת ההזרקה לזיהוי חיובי. בעוד החיה נשארת צנרר, לנתק את הצינור האנדוטראצ'י ממעגל ההרדמה ולצרף אותו מחדש למכונת isoflurane תואמת MR ניידת. להעביר את החיה לסורק MRI.לרכוש תמונות T1 כדי לחשב את המרחק מהחלק העליון של רשת ההזרקה ואת פני השטח קליפת המוח. כמוסת ויטמין E נראית בבירור בתמונות T1 ויש להשתמש בה כסמן לראש רשת ההזרקה. לרכוש תמונות T2 כדי לקבוע את המדריכים cannula אופטימלית עבור כל אתר מבוסס על האתר הממוקד של עירוי.רשת ה Cannula מלאה מלוחים אשר נראה הכי טוב בתמונות T2. באמצעות תוכנת ההדמיה MR, גללו במישורי קורונדל וסגיטל כדי למצוא את מיקום היעד של העירוי. לאחר הפשרת וקטור ויראלי במשך כמה שעות בטמפרטורת החדר, מערבבים את הווקטור ויראלי עם סוכן ניגוד MR gadoteridol על ידי פיפלט או ערבוב מערבולת.לטעון את הנגיף המעורב לתוך צינורות IV בלחץ גבוה 0.2 מיליליטר. באמצעות צינורות IV בלחץ גבוה, לחבר קו הארכה ארוך למזרק MR תואם שלושה מיליליטר וראש עם מלוחים. חבר את הקצה השני של צינורות הארכה ארוכה צינורות 0.2 מיליליטר IV טעון עם הנגיף.לאחר מכן חבר את ה cannula עמיד ריפלוקס עם קצה צעד מיליליטר אחד לקצה הדיסטלי של הרכבה זו עם מחבר קטטר בסגנון מהדק. לבסוף להגדיר את המזרק במשאבה תואמת MR. באמצעות תמונות MR אנטומיות בסיסיות שהושגו, בחר את מיקום רשת הזרקת הקנולה ואת עומק ההכנסה הדרושים כדי להגיע לאתר עירוי היעד.סמן את עומק הכניסה על ה Cannula באמצעות סרט סטרילי. התחל את עירוי בקצב של microliter אחד לדקה חזותית לאמת את זרימת הנוזל בקו עירוי על ידי התבוננות פליטת נוזל מן קצה cannula. הכנס את cannula באופן ידני דרך רשת ההזרקה לעומק היעד תוך שמירה על זרימה בקו עירוי כמו זה ימנע את הרקמה חדרה סתימת cannula במהלך הכניסה.עכשיו לרכוש פלאש מהיר T1 משוקלל תמונות לניטור מקוון של עירוי וקטור ויראלי. לאחר החדרת כ 10 microliters של הווקטור כך וירוס מספיק הוא חדורים כדי לזהות בסורק MR, להשיג תמונות MR כדי לאמת את מיקום cannula הנכון כפי שניתן לראות על ידי התפשטות שנצפו של הנגיף. אם עומק ה cannula שנוסף שגוי, להתאים את העומק בהתאם או לאט להסיר את cannula מחדש את הכניסה.לפקח על עירוי באמצעות הדרכה של תמונות MR באינטרנט. הגדל את קצב העירוי לחמישה מיקרוליטרים לדקה במיקרוליטר אחד לדקה כל כמה דקות. חשוב להגדיל את קצב העירוי לאט ולא יעלה על חמישה microliters לדקה כמו שיעורי עירוי גבוהים עלולים לגרום נזק לרקמות.לאחר החדרת כ 40 microliters של וקטור ויראלי, להתחיל להפחית את קצב העירוי על ידי מיקרוליטר אחד לדקה צעדים. לעצור את עירוי לאחר כ 50 microliters מוזרק. השאירו את ה Cannula במקום במשך עשר דקות.מוציאים לאט את ה cannula מהמוח וע עוברים למקום הבא. מכסים את הצילינדר עם וילון סטרילי בסוף הזריקות לפני הובלת בעלי חיים, ואז להעביר את החיה בחזרה לחדר הניתוח. ניתוחים היסטולוגיים על קטעי קורונדל סדרתיים חושפים ביטוי אופטוגנטי בקנה מידה גדול סביב אתרי העירוי.מוצגת כאן תמונת MR קורונטל בסיסית והתפשטות סוכן הניגוד לאחר העירוי לאותה פרוסת MR coronal. קטע רקמת קורל מוצג בערך מאותו הדבר. כתמי פרוקסידאז משקפים ביטוי של חלבון פלואורסצנטי צהוב או כתב EYFP.יישור טוב נצפתה בין האזור של ביטוי EYFP, נמדד עם epifluorescense פני השטח עם כתמים היסטולוגיים. אלה כוללים את האזור של התפשטות וקטור מוערך מתמונות MR. נקודות לבנות מציינות אתרי הזרקה וכל האזור השחור מייצג את האזור שנחשף על ידי הגולגולת.מוצגת כאן תמונת הגדלה נמוכה של חלקי coronal מוכתמים בנוגדן אנטי GFP המציג את ההיבט הרוחבי המדיאלי של ביטוי YFP בקליפת המוח הסומטוסנסית. ראש החץ השחור מציין את מיקום מסלול הקנה. הרקמה הסמוכה מוצגת בהגדלה גדולה יותר כדי להראות התפלגות למינארית של התאים החיוביים של YFP.אזורים מאוכלסים בצפיפות של תאים חיוביים YFP ממוקמים בעיקר בשכבות 2 עד 3 ו 5 עד 6. הגדלה נוספת חושפת תאים פירמידליים טיפוסיים בשכבות 2 עד 3, שכבה 5 ושכבה 6. חשוב להשאיר את ה Cannula במקום במשך 10 דקות לאחר הזרימה נעצרה.זה יבטיח כי הנגיף חלחל לתוך הרקמה העצבית הממוקדת שמסביב. CED היא גישה יעילה להשגת רמות ביטוי גבוהות באופן אחיד על פני אזורי מוח גדולים ביונקים. יש לו פוטנציאל להרחיב את ההבנה שלנו של מעגלים עצביים וקישוריות.לאחר התמרה ויראלית על ידי CED, ניסויי גירוי אופטוגנטיים הבאים ניתן לזווג עם הקלטה חשמלית ומסות התנהגותיות כדי לחשוף את הדינמיקה מעגל מורכב בתוך המוח. טכניקה זו הועסקה בעבר על ידי יזדן-Shahmorad ועמיתיו בשנת 2018 שבו אפנון עצבי אופטוגנטי שימש כדי לגרום לשינויים קישוריות רחבה ברשת בקליפת המוח המוטורית החושית.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors

הזרקה תוך גולגולתי של Adeno הקשורים וקטורים ויראליים

Intracranial injection of viral vectors engineered to express a fluorescent protein is a versatile labeling technique for visualization of specific ...

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

התמרה ויראלי סלקטיבי של נוירונים בוגרים יליד חוש הריח של כרוני In vivo Optogenetic גירוי

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells ...

Simultaneous Electroencephalography, Real-time Measurement of Lactate Concentration and Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity in the Rodent Cerebral Cortex

Electroencephalography סימולטני, מדידה בזמן אמת של הריכוז לקטט ומניפולצית Optogenetic של פעילות עצבית בקליפת המוח המכרסמת

Although the brain represents less than 5% of the body  by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body  at rest1. The ...

Optogenetic Functional MRI

MRI פונקציונלי optogenetic

The investigation of the functional connectivity of precise neural circuits across the entire intact brain can be achieved through optogenetic functional ...

Subpial Adeno-associated Virus 9 (AAV9) Vector Delivery in Adult Mice

Subpial Adeno-associated Virus 9 AAV9 Vector Delivery in Adult Mice

Subnial Adeno הקשורים וירוסים 9 (AAV9) וקטור משלוח ב עכברים למבוגרים

The successful development of a subpial adeno-associated virus 9 (AAV9) vector delivery technique in adult rats and pigs has been reported on previously. ...

Effects of Transcranial Alternating Current Stimulation on the Primary Motor Cortex by Online Combined Approach with Transcranial Magnetic Stimulation

ההשפעות של גירוי זרם חילופין טראנס על קליפת המוח המוטורית הראשי על-ידי גישה משולבת מקוון עם גירוי מגנטי טראנס

Transcranial Alternating Current Stimulation (tACS) is a neuromodulatory technique able to act through sinusoidal electrical waveforms in a specific ...

Adeno-associated Virus-mediated Transgene Expression in Genetically Defined Neurons of the Spinal Cord

הביטוי Adeno-הקשורים Transgene וירוס בתיווך בנוירונים מבחינה גנטית מוגדרים של חוט השדרה

Selective manipulation of spinal neuronal subpopulations has mainly been achieved by two different methods: 1) Intersectional genetics, whereby double or ...

Automated Segmentation of Cortical Grey Matter from T1-Weighted MRI Images

פילוח אוטומטיות של החומר האפור קורטיקלית מתמונות MRI T1 משוקלל

Within neuroimaging research, a number of recent studies have discussed the impact of between-study differences in volumetric findings that are thought to ...

Direct Intrathecal Injection of Recombinant Adeno-associated Viruses in Adult Mice

במחלה ישירה הזרקה של וירוסים Adeno-הקשורים רקומביננטי בעכברים מבוגרים

Intrathecal (IT) injection of adeno-associated virus (AAV) has drawn considerable interest in CNS gene therapy by virtue of its safety, noninvasiveness, ...

Delivery of Antibodies into the Murine Brain via Convection-enhanced Delivery

מסירת נוגדנים למוח מורנה באמצעות הסעה-משלוח משופר

Convection-enhanced delivery (CED) is a neurosurgical technique enabling effective perfusion of large brain volumes using a catheter system. Such an ...