Name: convection enhanced delivery of optogenetic adeno-associated viral vector to the cortex of rhesus macaque under guidance of online mri images
Uploaded: 2019-05-23T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Convection Enhanced Delivery of Optogenetic Adeno-associated Viral Vector to the Cortex of Rhesus Macaque Under Guidance of Online MRI Images at JoVE.com

यह काम अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन postdoctoral फैलोशिप (AY), रक्षा उन्नत अनुसंधान परियोजनाओं एजेंसी (DARPA) पुनर्गठन और प्लास्टिक द्वारा समर्थित किया गया था चोट वसूली में तेजी लाने के लिए (REPAIR; N66001-10-सी-2010), R01. NS073940, और UCSF तंत्रिका विज्ञान इमेजिंग सेंटर द्वारा. यह काम भी यूनिस कैनेडी शिवर राष्ट्रीय बाल स्वास्थ्य और मानव विकास के राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के पुरस्कार संख्या K12HD073945, वाशिंगटन राष्ट्रीय प्राइमेट अनुसंधान केंद्र (WaNPCR, P51 OD010425) के तहत, और न्यूरोटेक्नोलॉजी के लिए केंद्र (CNT, अनुदान EEC-1028725) के तहत एक राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन इंजीनियरिंग अनुसंधान केंद्र. हम Camilo Diaz-Botia, टिम Hanson, विक्टर Kharazia, डैनियल Silvermith, करेन जे MacLeod, Juliana मिलानी, और ब्लेकली एंड्रयूज प्रयोगों और नान Tian, Jiwei वह, पीटर Ledochowitsch, मिशेल Mahrbiz, और टोनी Haun तकनीकी मदद के लिए उनकी मदद के लिए धन्यवाद.

सभी प्रक्रियाओं कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय, सैन फ्रांसिस्को संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया है और देखभाल और प्रयोगशाला जानवरों के उपयोग के लिए गाइड के अनुरूप हैं. निम...

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	<li>Ruiz, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetics+through+windows+on+the+brain+in+the+nonhuman+primate.">Optogenetics through windows on the brain in the nonhuman primate.</a> Journal of Neurophysiology. 110 (6), 1455-1467 (2013).</li><li>Diester, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optogenetic+toolbox+designed+for+primates.">An optogenetic toolbox designed for primates.</a> Nature Neuroscience. 14 (3), 387-397 (2011).</li><li>Ohayon, S., Grimaldi, P., Schweers, N., Tsao, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saccade+modulation+by+optical+and+electrical+stimulation+in+the+macaque+frontal+eye+field.">Saccade modulation by optical and electrical stimulation in the macaque frontal eye field.</a> Journal of Neuroscience. 33 (42), 16684-16697 (2013).</li><li>Gerits, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetically+induced+behavioral+and+functional+network+changes+in+primates.">Optogenetically induced behavioral and functional network changes in primates.</a> Current Biology. 22 (18), 1722-1726 (2012).</li><li>Jazayeri, M., Lindbloom-Brown, Z., Horwitz, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saccadic+eye+movements+evoked+by+optogenetic+activation+of+primate+V1.">Saccadic eye movements evoked by optogenetic activation of primate V1.</a> Nature Neuroscience. 15 (10), 1368-1370 (2012).</li><li>Dai, J., Brooks, D. I., Sheinberg, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+and+electrical+microstimulation+systematically+bias+visuospatial+choice+in+primates.">Optogenetic and electrical microstimulation systematically bias visuospatial choice in primates.</a> Current Biology. 24 (1), 63-69 (2014).</li><li>Afraz, A., Boyden, E. S., DiCarlo, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+and+pharmacological+suppression+of+spatial+clusters+of+face+neurons+reveal+their+causal+role+in+face+gender+discrimination.">Optogenetic and pharmacological suppression of spatial clusters of face neurons reveal their causal role in face gender discrimination.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (21), 6730-6735 (2015).</li><li>Ledochowitsch, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+optical+control+and+simultaneous+electrical+readout+of+extended+cortical+circuits.">Strategies for optical control and simultaneous electrical readout of extended cortical circuits.</a> Journal of Neuroscience Methods. 256, 220-231 (2015).</li><li>Yazdan-Shahmorad, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Large-Scale+Interface+for+Optogenetic+Stimulation+and+Recording+in+Nonhuman+Primates.">A Large-Scale Interface for Optogenetic Stimulation and Recording in Nonhuman Primates.</a> Neuron. 89 (5), 927-939 (2016).</li><li>Ju, N., Jiang, R., Macknik, S. L., Martinez-Conde, S., Tang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+all-optical+interrogation+of+cortical+neurons+in+awake-behaving+nonhuman+primates.">Long-term all-optical interrogation of cortical neurons in awake-behaving nonhuman primates.</a> PLoS Biology. 16 (8), e2005839 (2018).</li><li>Bankiewicz, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convection-enhanced+delivery+of+AAV+vector+in+parkinsonian+monkeys;+in+vivo+detection+of+gene+expression+and+restoration+of+dopaminergic+function+using+pro-drug+approach.">Convection-enhanced delivery of AAV vector in parkinsonian monkeys; in vivo detection of gene expression and restoration of dopaminergic function using pro-drug approach.</a> Experimental Neurology. 164 (1), 2-14 (2000).</li><li>Kells, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+therapy-based+method+for+the+delivery+of+therapeutics+to+primate+cortex.">Efficient gene therapy-based method for the delivery of therapeutics to primate cortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (7), 2407-2411 (2009).</li><li>Krauze, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reflux-free+cannula+for+convection-enhanced+high-speed+delivery+of+therapeutic+agents.">Reflux-free cannula for convection-enhanced high-speed delivery of therapeutic agents.</a> Journal of Neurosurgery. 103 (5), 923-929 (2005).</li><li>Yazdan-Shahmorad, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+optogenetic+expression+in+macaque+cortex+obtained+with+MR-guided,+convection+enhanced+delivery+(CED)+of+AAV+vector+to+the+thalamus.">Widespread optogenetic expression in macaque cortex obtained with MR-guided, convection enhanced delivery (CED) of AAV vector to the thalamus.</a> Journal of Neuroscience Methods. 293, 347-358 (2018).</li><li>Yazdan-Shahmorad, A., Silversmith, D. B., Kharazia, V., Sabes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+cortical+reorganization+using+optogenetics+in+non-human+primates.">Targeted cortical reorganization using optogenetics in non-human primates.</a> Elife. 7, (2018).</li><li>Yazdan-Shahmorad, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demonstration+of+a+setup+for+chronic+optogenetic+stimulation+and+recording+across+cortical+areas+in+non-human+primates.">Demonstration of a setup for chronic optogenetic stimulation and recording across cortical areas in non-human primates.</a> SPIE BiOS. , (2015).</li><li>Lerchner, W., Corgiat, B., Der Minassian, V., Saunders, R. C., Richmond, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injection+parameters+and+virus+dependent+choice+of+promoters+to+improve+neuron+targeting+in+the+nonhuman+primate+brain.">Injection parameters and virus dependent choice of promoters to improve neuron targeting in the nonhuman primate brain.</a> Gene Therapy. 21 (3), 233-241 (2014).</li><li>Acker, L., Pino, E. N., Boyden, E. S., Desimone, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FEF+inactivation+with+improved+optogenetic+methods.">FEF inactivation with improved optogenetic methods.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (46), (2016).</li><li>Bobo, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convection-enhanced+delivery+of+macromolecules+in+the+brain.">Convection-enhanced delivery of macromolecules in the brain.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (6), 2076-2080 (1994).</li><li>Lieberman, D. M., Laske, D. W., Morrison, P. F., Bankiewicz, K. S., Oldfield, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convection-enhanced+distribution+of+large+molecules+in+gray+matter+during+interstitial+drug+infusion.">Convection-enhanced distribution of large molecules in gray matter during interstitial drug infusion.</a> Journal of Neurosurgery. 82 (6), 1021-1029 (1995).</li><li>Lonser, R. R., Gogate, N., Morrison, P. F., Wood, J. D., Oldfield, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+convective+delivery+of+macromolecules+to+the+spinal+cord.">Direct convective delivery of macromolecules to the spinal cord.</a> Journal of Neurosurgery. 89 (4), 616-622 (1998).</li><li>Szerlip, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+of+convection-enhanced+delivery+of+viruses+and+virus-sized+particles.">Real-time imaging of convection-enhanced delivery of viruses and virus-sized particles.</a> Journal of Neurosurgery. 107 (3), 560-567 (2007).</li></ol>

यहाँ, हम MR निर्देशित सीईडी द्वारा एनएचपी प्राथमिक somatosensory और मोटर प्रांतस्था में बड़े पैमाने पर optogenetic अभिव्यक्ति को प्राप्त करने के लिए एक व्यावहारिक और कुशल तकनीक रूपरेखा. MR निर्देशित सीईडी का उपयोग एनएच...

Optogenetics एक शक्तिशाली उपकरण है कि तंत्रिका गतिविधि के हेरफेर और मस्तिष्क में नेटवर्क कनेक्शन के अध्ययन के लिए अनुमति देता है. गैर मानव primates में इस तकनीक को लागू करने (NHPs) प्राइमेट मस्तिष्क में बड़े पैमाने पर तंत्रिका गणना, अनुभूति, और व्यवहार की हमारी समझ को बढ़ाने की क्षमता है. यद्यपि हाल के वर्षों में एन एच पी में ओपीपी में ऑप्टोजेनेटिक्स को सफलतापूर्वक कार्यान्वित किया गया है1,2,3,4,5,6,7, एक चुनौती है कि शोधकर्ताओं का सामना इन जानवरों में बड़े मस्तिष्क क्षेत्रों में अभिव्यक्ति के उच्च स्तर को प्राप्त कर रहा है. यहाँ, हम एक कुशल और सरलीकृत दृष्टिकोण प्रदान कर रहे हैं macacues में प्रांतस्था के बड़े क्षेत्रों में optogenetic अभिव्यक्ति के उच्च स्तर को प्राप्त करने के लिए. इस तकनीक के राज्य के अत्याधुनिक रिकॉर्डिंग8,9 और ऑप्टिकल उत्तेजना10 प्रौद्योगिकियों के साथ संयोजन में इन जानवरों में वर्तमान optogenetic अध्ययन में सुधार करने के लिए महान क्षमता है।
Convection बढ़ाया वितरण (सीईडी) केंद्रीय तंत्रिका तंत्र11,12,13के लिए वायरल वैक्टर सहित औषधीय एजेंटों और अन्य बड़े अणुओं की डिलीवरी की एक स्थापित विधि है। जबकि पारंपरिक वितरण विधियों मस्तिष्क के छोटे क्षेत्रों में वितरित कई कम मात्रा अर्क शामिल, CED कम अर्क के साथ व्यापक और अधिक भी एजेंट वितरण प्राप्त कर सकते हैं. जलसेक के दौरान दबाव संचालित थोक तरल प्रवाह (संवहन) सीईडी के साथ वायरल वैक्टर पहुंचाने पर लक्ष्य ऊतक के अधिक व्यापक रूप से और समान रूप से वितरित ट्रांसडक्शन के लिए अनुमति देता है। हाल के अध्ययनों में, हम ट्रांसडक्शन और बाद में optogenetic प्राथमिक मोटर के बड़े क्षेत्रों की अभिव्यक्ति का प्रदर्शन (M1) और somatosensory (S1) cortices9 और thalamus14 चुंबकीय अनुनाद का उपयोग (एमआर) निर्देशित सी.डी.
यहाँ, हम केवल कुछ cortical इंजेक्शन के साथ बड़े cortical क्षेत्रों में optogenetic अभिव्यक्ति को प्राप्त करने के लिए सीईडी के उपयोग की रूपरेखा.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 mL High Pressure IV Tubing</td>
			<td>Smiths Medical Inc., Dublin, OH, USA</td>
			<td>533640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.32 mm ID, 0.43 mm OD Silica Tubing</td>
			<td>Polymicro Technologies</td>
			<td>1068150027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 mm ID, 0.76 mm OD Silica Tubing</td>
			<td>Polymicro Technologies</td>
			<td>1068150625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV2.5-CamKII-C1V1-EYFP</td>
			<td>Penn Vector Core, University of Pennsylvania</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABS plastic</td>
			<td>Stratasys, MN, USA</td>
			<td>ABSplus-P430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimicrobial incise drape</td>
			<td>3M</td>
			<td>6650EZ</td>
			<td>Ioban Drape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental Acrylic</td>
			<td>Henry Schein, Inc.</td>
			<td>1013117</td>
			<td>Acrylic Bonding Agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elevators</td>
			<td>VWR International, LLC.</td>
			<td>10196-564</td>
			<td>Langenbeck Elevator, Wide Tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine suture</td>
			<td>McKesson Medical-Surgical Inc.</td>
			<td>1034505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gadoteridol</td>
			<td>Prohance, Bracco Diagnostics, Princeton, NJ</td>
			<td>0270-1111-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser for light stimulation</td>
			<td>Omicron-Laserage, Germany</td>
			<td>PhoxX 488-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MR compatible 3cc syringe</td>
			<td>Harvard apparatus, Holliston, MA, USA</td>
			<td>59-8377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MR Imaging Software</td>
			<td>Pixmeo</td>
			<td>OsiriX MD 10.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MR-Compatible Pump</td>
			<td>Harvard apparatus, Holliston, MA, USA</td>
			<td>Harvard PHD 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MR-compatible stereotaxic frame</td>
			<td>KOPF</td>
			<td>1430M MRI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perifix Clamp Style Catheter Connector</td>
			<td>B-Braun, Bethlehem, PA, USA</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Screws</td>
			<td>Plastics 1</td>
			<td>0-80 x 1/8N</td>
			<td>Nylon screws</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titanium screws</td>
			<td>Crist Instrument Co., Inc.</td>
			<td>6-YCX-0312</td>
			<td>Self-tapping bone screws</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trephine</td>
			<td>GerMedUSA Inc,</td>
			<td>SKU:GV70-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>uPrinter SE 3D printer</td>
			<td>Stratasys, MN, USA</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin E Capsule</td>
			<td>Pure Encapsulations, LLC.</td>
			<td>DE1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wet sterile absorbable gelatin</td>
			<td>Pfizer Inc.</td>
			<td>AZL0009034201</td>
			<td>Gelfoam</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

convection enhanced delivery of optogenetic adeno-associated viral vector to the cortex of rhesus macaque under guidance of online mri images

गैर-मानव प्राइमेट (एनएचपी) ऑप्टोजेनेटिक्स में, वायरल वैक्टर के साथ बड़े cortical क्षेत्रों को संक्रमित करना अक्सर एक कठिन और समय लेने वाला कार्य होता है। यहाँ, हम चुंबकीय अनुनाद (एमआर) निर्देशित संवहन बढ़ाया वितरण (सीईडी) के प्राथमिक somatosensory में optogenetic वायरल वैक्टर के उपयोग का प्रदर्शन (S1) और मोटर (M1) macacues के cortices के कुशल प्राप्त करने के लिए, व्यापक cortical अभिव्यक्ति प्रकाश के प्रति संवेदनशील आयन चैनल. एडीनो-संबद्ध वायरल (एएवी) वेक्टर्स को लाल-स्थानांतरित ऑप्सिन सी1वी 1 को पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन (ईईएफपी) में शामिल किया गया था, एमआर-गाइडेड सीईडी के तहत रीसस मैकैक के प्रांतस्था में इंजेक्ट किया गया था। तीन महीने के बाद infusion, epifluorescent इमेजिंग optogenetic अभिव्यक्ति के बड़े क्षेत्रों की पुष्टि की (gt; 130 मिमी2) M1 में और S1 दो macacues में. इसके अलावा, हम माइक्रो-इलेक्ट्रोकोर्टिकोग्राफिक सरणियों का उपयोग कर व्यक्त क्षेत्रों से विश्वसनीय प्रकाश-evoked इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी प्रतिक्रियाओं को रिकॉर्ड करने में सक्षम थे। बाद में हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण और रिपोर्टर के खिलाफ इम्यूनोस्टेनिंग ने एम 1 और एस 1 में व्यापक और घने ऑप्टोजेनेटिक अभिव्यक्ति का खुलासा किया जो एपिफ्लोरेसेंट इमेजिंग द्वारा इंगित वितरण के अनुरूप था। इस तकनीक हमें पारंपरिक तकनीकों की तुलना में कम से कम नुकसान के साथ समय की एक छोटी अवधि के भीतर प्रांतस्था के बड़े क्षेत्रों में अभिव्यक्ति प्राप्त करने के लिए सक्षम बनाता है और ऐसे NHPs के रूप में बड़े जानवरों में optogenetic वायरल वितरण के लिए एक इष्टतम दृष्टिकोण हो सकता है. इस दृष्टिकोण पशु मॉडल developmentally मनुष्यों के करीब में सेल प्रकार विशिष्टता के साथ तंत्रिका सर्किट के नेटवर्क स्तर हेरफेर के लिए महान क्षमता को दर्शाता है.

एमआरआई मार्गदर्शन के तहत Convection बढ़ी हुई वितरण (सीईडी)
ऑनलाइन एमआर छवियों के मार्गदर्शन में सीईडी जलसेक के दौरान वायरल वेक्टर के प्रसार की निगरानी की गई थी (<strong class=...

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Convection Enhanced Delivery of Optogenetic Adeno-associated Viral Vector to the Cortex of Rhesus Macaque Under Guidance of Online MRI Images

यहाँ, हम चुंबकीय अनुनाद (एमआर) निर्देशित संवहन बढ़ाया वितरण (CED) कॉर्टेक्स में वायरल वैक्टर के एक कुशल और सरलीकृत दृष्टिकोण के रूप में प्रदर्शित करने के लिए बड़े cortical क्षेत्रों में macacue मस्तिष्क में optogenetic अभिव्यक्ति प्राप्त करने के लिए.

ऑनलाइन एमआरआई छवियों के मार्गदर्शन के तहत Rhesus Macakue के कोर्टेक्स के लिए Optogenetic Adeno-संबद्ध वायरल वेक्टर की Convection बढ़ी डिलीवरी

In non-human primate (NHP) optogenetics, infecting large cortical areas with viral vectors is often a difficult and time-consuming task. Here, we ...

संवहन बढ़ाया वितरण, या CED, ऑप्टोजेनेटिक वायरल वैक्टर के गैर मानव वानरों में शोधकर्ताओं को एक बड़े पैमाने पर तंत्रिका गतिविधि में हेरफेर करने के लिए जटिल तंत्रिका गणना और व्यवहार को समझने के लिए सक्षम हो जाएगा । सीईडी के साथ हम पारंपरिक तरीकों की तुलना में कम समय में केवल कुछ इंजेक्शन के साथ रहनुमा मस्तिष्क के बड़े क्षेत्रों में उच्च ऑप्टोजेनेटिक अभिव्यक्ति प्राप्त कर सकते हैं। चुंबकीय अनुनाद या एमआर संगत कक्ष प्रत्यारोपण गैर मानव रहनुमा सर्जरी में मानक अभ्यास का उपयोग कर किया जाता है, प्रक्रिया पाठ प्रोटोकॉल में विस्तार से वर्णित है और इस वीडियो में संक्षेप में उल्लिखित है ।पाठ प्रोटोकॉल में वर्णित पशु गति, स्थिति और प्रारंभिक चीरा के बाद, ट्रेफिन का उपयोग करके इंजेक्शन के लिए पूर्वनियोजित प्रक्षेप पथ को कवर करने के लिए एक परिपत्र क्रैनिओटॉमी बनाएं। ट्रेफिन के समायोज्य केंद्रित बिंदु का उपयोग करके ट्रेफिन को लंगर करने के लिए खोपड़ी में पर्याप्त रूप से गहरी योजनाबद्ध क्रैनियोटॉमी के केंद्र में एक इंडेंटेशन बनाएं। एक बार केंद्र बना दिया गया है, खोपड़ी पर ट्रेफिन कम और ट्रेफिन दक्षिणावर्त और वामावर्त घुमाने जब तक नीचे दबाव लागू जब तक हड्डी टोपी संदंश के साथ हटाया जा सकता है ।पाठ प्रोटोकॉल में विस्तृत के रूप में ड्यूरा उठाने के बाद, केंद्र से क्रैनियोटॉमी के किनारे तक ड्यूरा काटें और ठीक नेत्र कैंची के साथ किनारे के साथ जारी रखें। माउंट बेलनाकार कस्टम ने संवहन बढ़ाया वितरण एमआर संगत कक्ष को क्रैनियोटॉमी के शीर्ष पर खोपड़ी में जलसेक के दौरान कैनुला समर्थन प्रदान करने के लिए इस तरह से कि कक्ष फ्लैंज की वक्रता खोपड़ी की वक्रता के साथ अच्छी तरह से संरेखित होती है। प्लास्टिक शिकंजा और दंत ऐक्रेलिक या कुछ टाइटेनियम शिकंजा का उपयोग कर खोपड़ी के लिए प्रत्यारोपण सुरक्षित।एमआर संगत कक्ष प्रत्यारोपित करने और कक्ष में कैनुला इंजेक्शन ग्रिड डालने के तुरंत बाद, एमआर शारीरिक छवियों के माध्यम से इंजेक्शन स्थानों की कल्पना के लिए ग्रिड को 0.9% नमकीन के साथ भरें। मस्तिष्क की नमी बनाए रखने के लिए गीले बाँझ अवशोषित जेल फोम के साथ कक्ष गुहाओं को भी भरें। परिवहन और एमआर इन्फ्यूजन के दौरान सिलेंडरों की बाँझ प्रतिरोधीता बनाए रखने के लिए एक बाँझ एंटीमाइक्रोबियल इंसाइल ड्रेप के साथ त्वचा और सिलेंडर को कवर करें।सकारात्मक पहचान के लिए इंजेक्शन ग्रिड के शीर्ष को चिह्नित करने के लिए एक विटामिन ई कैप्सूल रखें। जबकि जानवर intubated रहता है, संज्ञाहरण सर्किट से एंडोट्रेक्ल ट्यूब अलग और यह एक पोर्टेबल एमआर संगत आइसोफलुने मशीन को फिर से संलग्न । एमआरआई स्कैनर के लिए पशु परिवहन।इंजेक्शन ग्रिड और कॉर्टिकल सतह के शीर्ष से दूरी की गणना करने के लिए T1 छवियों का अधिग्रहण करें। विटामिन ई कैप्सूल T1 छवियों में स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहा है और इंजेक्शन ग्रिड के शीर्ष के लिए एक मार्कर के रूप में इस्तेमाल किया जाना चाहिए। जलसेक की लक्षित साइट के आधार पर प्रत्येक साइट के लिए इष्टतम कैनुला गाइड निर्धारित करने के लिए टी 2 छवियों का अधिग्रहण करें।कैनुला ग्रिड खारा से भरा हुआ है जो टी 2 छवियों में सबसे अच्छा दिखाई देता है। एमआर इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करना, जलसेक के लक्ष्य स्थान को खोजने के लिए कोरोनल और धनु विमानों के माध्यम से स्क्रॉल करें। कमरे के तापमान पर कुछ घंटों के लिए वायरल वेक्टर को विगलन करने के बाद, वायरल वेक्टर को एमआर कंट्रास्ट एजेंट गडोटेरिडोल के साथ पिपेट या भंवर मिश्रण द्वारा मिलाएं।मिश्रित वायरस को 0.2 मिलीलीटर उच्च दबाव चतुर्थ टयूबिंग में लोड करें। उच्च दबाव चतुर्थ टयूबिंग का उपयोग करना, एक एमआर संगत तीन मिलीलीटर सिरिंज और खारा के साथ प्रधानमंत्री के लिए एक लंबी विस्तार लाइन कनेक्ट । वायरस से भरे 0.2 मिलीलीटर चतुर्थ ट्यूबिंग के लिए लंबे विस्तार टयूबिंग के दूसरे छोर को कनेक्ट करें।फिर एक मिलीलीटर के साथ भाटा प्रतिरोधी कैनुला संलग्न एक क्लैंप शैली कैथेटर कनेक्टर के साथ इस विधानसभा के डिस्टल अंत करने के लिए टिप कदम रखा। अंत में एक एमआर संगत पंप में सिरिंज सेट करें। प्राप्त बेसलाइन शारीरिक एमआर छवियों का उपयोग करके, लक्ष्य जलसेक साइट तक पहुंचने के लिए आवश्यक कैनुला इंजेक्शन ग्रिड स्थान और प्रविष्टि गहराई का चयन करें।बाँझ टेप का उपयोग कर कैनुला पर प्रविष्टि गहराई चिह्नित करें। प्रति मिनट एक माइक्रोलिटर की दर से जलसेक शुरू करें और कैनुला टिप से तरल पदार्थ के इंजेक्शन को देखकर जलसेक रेखा में तरल पदार्थ के प्रवाह को नेत्रहीन रूप से मान्य करें। जलसेक लाइन में प्रवाह को बनाए रखते हुए इंजेक्शन ग्रिड के माध्यम से मैन्युअल रूप से कैनुला डालें क्योंकि यह प्रवेश ति ऊतक को प्रविष्टि के दौरान कैनुला को बंद करने से रोकेगा।अब वायरल वेक्टर जलसेक की ऑनलाइन निगरानी के लिए तेजी से फ्लैश T1-भारित छवियों का अधिग्रहण करें। वेक्टर के लगभग 10 माइक्रोलीटर को इन्फ्यूज करने के बाद जैसे कि एमआर स्कैनर में पता लगाने के लिए पर्याप्त वायरस का संचार किया जाता है, वायरस के अवलोकन प्रसार से स्पष्ट रूप से सही कैनुला प्लेसमेंट को सत्यापित करने के लिए एमआर छवियां प्राप्त करें। यदि डाला कैनुला की गहराई गलत है, तो तदनुसार गहराई को समायोजित करें या धीरे-धीरे कैनुला को हटा दें और प्रविष्टि को फिर से लागू करें।ऑनलाइन एमआर छवियों के मार्गदर्शन के माध्यम से जलसेक की निगरानी करें। हर कुछ मिनटों में एक माइक्रोलीटर प्रति मिनट के कदम से प्रति मिनट पांच माइक्रोलीटर तक जलसेक दर बढ़ाएं। जलसेक दर को धीरे-धीरे बढ़ाना महत्वपूर्ण है और प्रति मिनट पांच माइक्रोलीटर से अधिक नहीं होना महत्वपूर्ण है क्योंकि उच्च जलसेक दर ऊतक क्षति का कारण बन सकती है।वायरल वेक्टर के लगभग 40 माइक्रोलीटर को इन्फ्यूज करने के बाद, प्रति मिनट चरणों में एक माइक्रोलीटर द्वारा जलसेक दर को कम करना शुरू करें। लगभग 50 माइक्रोलीटर इंजेक्ट होने के बाद जलसेक को रोकें। कैनुला को दस मिनट के लिए जगह में छोड़ दें।धीरे-धीरे मस्तिष्क से कैनुला निकालें और अगले स्थान पर चले जाएं। पशु परिवहन से पहले इंजेक्शन के अंत में एक बाँझ कपड़ा के साथ सिलेंडर को कवर करें, फिर जानवर को ऑपरेटिंग रूम में वापस परिवहन करें। धारावाहिक कोरोनल वर्गों पर हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण जलसेक साइटों के आसपास बड़े पैमाने पर ऑप्टोजेनेटिक अभिव्यक्ति प्रकट करते हैं।यहां दिखाया गया बेसलाइन कोरोनल एमआर छवि और एक ही एमआर कोरोनल स्लाइस के लिए जलसेक के बाद इसके विपरीत एजेंट का प्रसार है। एक कोरोनल ऊतक अनुभाग लगभग उसी से दिखाया गया है। पेरोक्सिडास धुंधला पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन या EYFP रिपोर्टर की अभिव्यक्ति को दर्शाता है।ईवाईएफपी अभिव्यक्ति के क्षेत्र के बीच अच्छा संरेखण मनाया जाता है, जो सतह एपिफ्लोरेसेंस के साथ और हिस्टोलॉजिकल धुंधला के साथ मापा जाता है। इनमें एमआर छवियों से अनुमानित वेक्टर स्प्रेड का क्षेत्र शामिल है। सफेद डॉट्स इंजेक्शन साइटों का संकेत देते हैं और पूरे काले क्षेत्र क्रैनियोटॉमी द्वारा उजागर क्षेत्र का प्रतिनिधित्व करता है।यहां दिखाया गया है कि एंटी जीएफपी एंटीबॉडी के साथ दाग रहे कोरोनल वर्गों की एक कम आवर्धन छवि है जो सोमाटोसेंसरी कॉर्टेक्स में वाईएफपी अभिव्यक्ति के मध्यीय पार्श्व पहलू को दिखा रही है। काला तीर सिर कैनुला ट्रैक के स्थान को इंगित करता है। आसन्न ऊतक को वाईएफपी सकारात्मक कोशिकाओं के लैमिनार वितरण को दिखाने के लिए अधिक आवर्धन पर दिखाया गया है।YFP सकारात्मक कोशिकाओं के घनी आबादी वाले क्षेत्रों में मुख्य रूप से तीन और पांच के माध्यम से दो परतों में छह के माध्यम से स्थित हैं । इसके अलावा वृद्धि तीन, परत पांच, और परत छह के माध्यम से दो परतों में ठेठ पिरामिड कोशिकाओं से पता चलता है । प्रवाह रुकने के बाद 10 मिनट के लिए कैनुला को जगह में छोड़ना महत्वपूर्ण है।यह सुनिश्चित करेगा कि वायरस आसपास के लक्षित तंत्रिका ऊतक में व्याप्त है । सीईडी स्तनधारियों में बड़े मस्तिष्क क्षेत्रों में समान रूप से उच्च अभिव्यक्ति के स्तर को प्राप्त करने के लिए एक कुशल दृष्टिकोण है। इसमें तंत्रिका सर्किट और कनेक्टिविटी के बारे में हमारी समझ का विस्तार करने की क्षमता है।सीईडी द्वारा वायरल ट्रांसडक्शन के बाद, बाद में ऑप्टोजेनेटिक उत्तेजना प्रयोगों को मस्तिष्क के भीतर जटिल सर्किट गतिशीलता को प्रकट करने के लिए विद्युत रिकॉर्डिंग और व्यवहार निबंधों के साथ जोड़ा जा सकता है। इस तकनीक को पहले 2018 में याज़दान-शाहमोराड और सहयोगियों द्वारा नियोजित किया गया है जिसमें संवेदी मोटर कॉर्टेक्स में नेटवर्क व्यापक कनेक्टिविटी परिवर्तनों को प्रेरित करने के लिए ऑप्टोजेनेटिक न्यूरल मॉड्यूलेशन का उपयोग किया गया था।

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors

एडिनो - जुड़े वायरल vectors के intracranial इंजेक्शन

Intracranial injection of viral vectors engineered to express a fluorescent protein is a versatile labeling technique for visualization of specific ...

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

जीर्ण के लिए वयस्क जन्म घ्राण न्यूरॉन्स के चयनात्मक वायरल transduction Vivo में Optogenetic उत्तेजना

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells ...

Simultaneous Electroencephalography, Real-time Measurement of Lactate Concentration and Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity in the Rodent Cerebral Cortex

युगपत Electroencephalography, लैक्टेट एकाग्रता और neuronal गतिविधि के Optogenetic हेरफेर के कृंतक प्रमस्तिष्क प्रांतस्था में वास्तविक समय मापन

Although the brain represents less than 5% of the body  by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body  at rest1. The ...

Optogenetic Functional MRI

Optogenetic कार्यात्मक एमआरआई

The investigation of the functional connectivity of precise neural circuits across the entire intact brain can be achieved through optogenetic functional ...

Subpial Adeno-associated Virus 9 (AAV9) Vector Delivery in Adult Mice

Subpial Adeno-associated Virus 9 AAV9 Vector Delivery in Adult Mice

उपशोषक एडोनो-संबंधित वायरस 9 (एएवी 9) वयस्क चूहे में वेक्टर डिलिवरी

The successful development of a subpial adeno-associated virus 9 (AAV9) vector delivery technique in adult rats and pigs has been reported on previously. ...

Effects of Transcranial Alternating Current Stimulation on the Primary Motor Cortex by Online Combined Approach with Transcranial Magnetic Stimulation

Transcranial के प्रभाव बारी वर्तमान उत्तेजना प्राथमिक मोटर प्रांतस्था पर ऑनलाइन संयुक्त दृष्टिकोण द्वारा Transcranial चुंबकीय उत्तेजना के साथ

Transcranial Alternating Current Stimulation (tACS) is a neuromodulatory technique able to act through sinusoidal electrical waveforms in a specific ...

Adeno-associated Virus-mediated Transgene Expression in Genetically Defined Neurons of the Spinal Cord

Adeno-संबद्ध वायरस-रीढ़ की हड्डी की आनुवंशिक रूप से परिभाषित न्यूरॉन्स में मध्यस्थता Transgene अभिव्यक्ति

Selective manipulation of spinal neuronal subpopulations has mainly been achieved by two different methods: 1) Intersectional genetics, whereby double or ...

Automated Segmentation of Cortical Grey Matter from T1-Weighted MRI Images

T1-भारित एमआरआई छवियों से Cortical ग्रे मैटर के स्वचालित विभाजन

Within neuroimaging research, a number of recent studies have discussed the impact of between-study differences in volumetric findings that are thought to ...

Direct Intrathecal Injection of Recombinant Adeno-associated Viruses in Adult Mice

रिकॉमबिनेंट Adeno-वयस्क चूहों में जुड़े वायरस के प्रत्यक्ष Intrathecal इंजेक्शन

Intrathecal (IT) injection of adeno-associated virus (AAV) has drawn considerable interest in CNS gene therapy by virtue of its safety, noninvasiveness, ...

Delivery of Antibodies into the Murine Brain via Convection-enhanced Delivery

Convection-एन्हांस्ड डिलिवरी के माध्यम से Murine मस्तिष्क में एंटीबॉडी की डिलीवरी

Convection-enhanced delivery (CED) is a neurosurgical technique enabling effective perfusion of large brain volumes using a catheter system. Such an ...