Name: convection enhanced delivery of optogenetic adeno-associated viral vector to the cortex of rhesus macaque under guidance of online mri images
Uploaded: 2019-05-23T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Convection Enhanced Delivery of Optogenetic Adeno-associated Viral Vector to the Cortex of Rhesus Macaque Under Guidance of Online MRI Images at JoVE.com

이 작품은 미국 심장 협회 박사 후 펠로우십에 의해 지원되었다 (AY), 국방 고급 연구 프로젝트 기관 (DARPA) 구조 조정 및 가소성 부상 복구를 가속화하기 위해 (수리; N66001-10-C-2010), R01. NS073940, UCSF 신경 과학 이미징 센터에 의해. 이 작품은 또한 수상 번호 K12HD073945, 워싱턴 국립 영장류 연구 센터 (WaNPCR, P51 OD010425)에 따라 국립 보건원의 유니스 케네디 시버 국립 연구소및 인간 개발에 의해 지원되었다 신경 기술 센터 (CNT, 그랜트 EEC-1028725에서 국립 과학 재단 공학 연구 센터). 카밀로 디아즈 보티아, 팀 핸슨, 빅토르 카라지아, 다니엘 실버스미스, 카렌 J. 맥클리오드, 줄리아나 밀라니, 블레이클리 앤드류스가 실험과 난 티안, 지웨이 허, 피터 레도쇼이치, 미셸 마하르비즈, 토니 하운의 도움을 받아 준 것에 대해 감사드립니다.

모든 절차는 캘리포니아 대학, 샌프란시스코 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었으며 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 가이드를 준수합니다. 다음 의 절차는 각각 17.5 kg 및 16.5 kg (원숭이 G 및 원숭이 J)의 무게, 8 및 7 세의 성인 남성 rhesus 원숭이 2 개를 사용하여 수행되었다.
참고: 모든 수술에 표준 무균 기술을 사용하십시오.
1. 기준선 ...

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	<li>Ruiz, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetics+through+windows+on+the+brain+in+the+nonhuman+primate.">Optogenetics through windows on the brain in the nonhuman primate.</a> Journal of Neurophysiology. 110 (6), 1455-1467 (2013).</li><li>Diester, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optogenetic+toolbox+designed+for+primates.">An optogenetic toolbox designed for primates.</a> Nature Neuroscience. 14 (3), 387-397 (2011).</li><li>Ohayon, S., Grimaldi, P., Schweers, N., Tsao, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saccade+modulation+by+optical+and+electrical+stimulation+in+the+macaque+frontal+eye+field.">Saccade modulation by optical and electrical stimulation in the macaque frontal eye field.</a> Journal of Neuroscience. 33 (42), 16684-16697 (2013).</li><li>Gerits, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetically+induced+behavioral+and+functional+network+changes+in+primates.">Optogenetically induced behavioral and functional network changes in primates.</a> Current Biology. 22 (18), 1722-1726 (2012).</li><li>Jazayeri, M., Lindbloom-Brown, Z., Horwitz, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saccadic+eye+movements+evoked+by+optogenetic+activation+of+primate+V1.">Saccadic eye movements evoked by optogenetic activation of primate V1.</a> Nature Neuroscience. 15 (10), 1368-1370 (2012).</li><li>Dai, J., Brooks, D. I., Sheinberg, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+and+electrical+microstimulation+systematically+bias+visuospatial+choice+in+primates.">Optogenetic and electrical microstimulation systematically bias visuospatial choice in primates.</a> Current Biology. 24 (1), 63-69 (2014).</li><li>Afraz, A., Boyden, E. S., DiCarlo, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+and+pharmacological+suppression+of+spatial+clusters+of+face+neurons+reveal+their+causal+role+in+face+gender+discrimination.">Optogenetic and pharmacological suppression of spatial clusters of face neurons reveal their causal role in face gender discrimination.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (21), 6730-6735 (2015).</li><li>Ledochowitsch, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+optical+control+and+simultaneous+electrical+readout+of+extended+cortical+circuits.">Strategies for optical control and simultaneous electrical readout of extended cortical circuits.</a> Journal of Neuroscience Methods. 256, 220-231 (2015).</li><li>Yazdan-Shahmorad, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Large-Scale+Interface+for+Optogenetic+Stimulation+and+Recording+in+Nonhuman+Primates.">A Large-Scale Interface for Optogenetic Stimulation and Recording in Nonhuman Primates.</a> Neuron. 89 (5), 927-939 (2016).</li><li>Ju, N., Jiang, R., Macknik, S. L., Martinez-Conde, S., Tang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+all-optical+interrogation+of+cortical+neurons+in+awake-behaving+nonhuman+primates.">Long-term all-optical interrogation of cortical neurons in awake-behaving nonhuman primates.</a> PLoS Biology. 16 (8), e2005839 (2018).</li><li>Bankiewicz, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convection-enhanced+delivery+of+AAV+vector+in+parkinsonian+monkeys;+in+vivo+detection+of+gene+expression+and+restoration+of+dopaminergic+function+using+pro-drug+approach.">Convection-enhanced delivery of AAV vector in parkinsonian monkeys; in vivo detection of gene expression and restoration of dopaminergic function using pro-drug approach.</a> Experimental Neurology. 164 (1), 2-14 (2000).</li><li>Kells, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+therapy-based+method+for+the+delivery+of+therapeutics+to+primate+cortex.">Efficient gene therapy-based method for the delivery of therapeutics to primate cortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (7), 2407-2411 (2009).</li><li>Krauze, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reflux-free+cannula+for+convection-enhanced+high-speed+delivery+of+therapeutic+agents.">Reflux-free cannula for convection-enhanced high-speed delivery of therapeutic agents.</a> Journal of Neurosurgery. 103 (5), 923-929 (2005).</li><li>Yazdan-Shahmorad, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+optogenetic+expression+in+macaque+cortex+obtained+with+MR-guided,+convection+enhanced+delivery+(CED)+of+AAV+vector+to+the+thalamus.">Widespread optogenetic expression in macaque cortex obtained with MR-guided, convection enhanced delivery (CED) of AAV vector to the thalamus.</a> Journal of Neuroscience Methods. 293, 347-358 (2018).</li><li>Yazdan-Shahmorad, A., Silversmith, D. B., Kharazia, V., Sabes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+cortical+reorganization+using+optogenetics+in+non-human+primates.">Targeted cortical reorganization using optogenetics in non-human primates.</a> Elife. 7, (2018).</li><li>Yazdan-Shahmorad, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demonstration+of+a+setup+for+chronic+optogenetic+stimulation+and+recording+across+cortical+areas+in+non-human+primates.">Demonstration of a setup for chronic optogenetic stimulation and recording across cortical areas in non-human primates.</a> SPIE BiOS. , (2015).</li><li>Lerchner, W., Corgiat, B., Der Minassian, V., Saunders, R. C., Richmond, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injection+parameters+and+virus+dependent+choice+of+promoters+to+improve+neuron+targeting+in+the+nonhuman+primate+brain.">Injection parameters and virus dependent choice of promoters to improve neuron targeting in the nonhuman primate brain.</a> Gene Therapy. 21 (3), 233-241 (2014).</li><li>Acker, L., Pino, E. N., Boyden, E. S., Desimone, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FEF+inactivation+with+improved+optogenetic+methods.">FEF inactivation with improved optogenetic methods.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (46), (2016).</li><li>Bobo, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convection-enhanced+delivery+of+macromolecules+in+the+brain.">Convection-enhanced delivery of macromolecules in the brain.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (6), 2076-2080 (1994).</li><li>Lieberman, D. M., Laske, D. W., Morrison, P. F., Bankiewicz, K. S., Oldfield, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convection-enhanced+distribution+of+large+molecules+in+gray+matter+during+interstitial+drug+infusion.">Convection-enhanced distribution of large molecules in gray matter during interstitial drug infusion.</a> Journal of Neurosurgery. 82 (6), 1021-1029 (1995).</li><li>Lonser, R. R., Gogate, N., Morrison, P. F., Wood, J. D., Oldfield, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+convective+delivery+of+macromolecules+to+the+spinal+cord.">Direct convective delivery of macromolecules to the spinal cord.</a> Journal of Neurosurgery. 89 (4), 616-622 (1998).</li><li>Szerlip, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+of+convection-enhanced+delivery+of+viruses+and+virus-sized+particles.">Real-time imaging of convection-enhanced delivery of viruses and virus-sized particles.</a> Journal of Neurosurgery. 107 (3), 560-567 (2007).</li></ol>

여기에서, 우리는 MR 유도된 CED에 의하여 NHP 1 차 체감각 및 모터 피질에 있는 대규모 광유전학 표현을 달성하기위한 실행 가능하고 능률적인 기술을 개략적으로 설명합니다. MR 유도 CED의 사용은 NHP 두뇌에 있는 바이러스성 주입의 전통적인 방법에 비해 중요한 이점을 제시합니다. 이러한 장점 중 하나는 필요한 주입이 적은 넓은 영역에 대한 발현을 달성할 수 있다는 것입니다. 예를 들어, 종래의 ...

광유전학은 신경 활동의 조작과 뇌의 네트워크 연결 연구를 허용하는 강력한 도구입니다. 비 인간 영장류에서이 기술을 구현 (NHPs) 대규모 신경 계산의 우리의 이해를 향상 시킬 가능성이 있다, 인식, 그리고 영장류 두뇌에 행동. 광유전학이 최근 몇 년 동안 NHP에서성공적으로 구현되었지만 1, 2,3,4,5,6,7, 연구원 얼굴은 이 동물에 있는 큰 두뇌 지역에 걸쳐 표현의 상부를 달성하고 있습니다. 여기에서, 우리는 원숭이에 있는 피질의 넓은 지역에 걸쳐 광유전학 표현의 상부를 달성하기 위하여 능률적이고 간단한 접근을 제공하고 있습니다. 이 기술은 최첨단 기록8,9 및 광학 자극10 기술과 함께 이러한 동물의 현재 광유전학 연구를 향상시킬 수있는 큰 잠재력을 가지고있다.
대류 강화 전달(CED)은 바이러스 벡터를 포함하는 약리작용제 및 기타 큰 분자를 중추신경계(11,12,13)로전달하는 확립된 방법이다. 기존의 전달 방법은 뇌의 작은 영역에 분산 된 여러 낮은 볼륨 주입을 포함하는 반면, CED는 적은 주입으로 더 광범위하고 균일 한 에이전트 분포를 달성 할 수 있습니다. 주입 중 압력 구동 벌크 유체 흐름 (대류)은 CED를 가진 바이러스 성 벡터를 전달할 때 표적 조직의 보다 광범위하고 균일하게 분포된 전달을 허용합니다. 최근 연구에서, 우리는 자기 공명 (MR) 유도 CED를 사용하여 1 차 모터 (M1) 및 체감각 (S1) 코르티즘9 및 시상14의 넓은 영역의 형질 전환 및 후속 광유전학 적 발현을 입증했다.
여기에서, 우리는 단지 몇몇 피질 주사를 가진 큰 피질 지역에 걸쳐 광유전학적인 표현을 달성하기 위하여 CED의 사용을 설명합니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 mL High Pressure IV Tubing</td>
			<td>Smiths Medical Inc., Dublin, OH, USA</td>
			<td>533640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.32 mm ID, 0.43 mm OD Silica Tubing</td>
			<td>Polymicro Technologies</td>
			<td>1068150027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 mm ID, 0.76 mm OD Silica Tubing</td>
			<td>Polymicro Technologies</td>
			<td>1068150625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV2.5-CamKII-C1V1-EYFP</td>
			<td>Penn Vector Core, University of Pennsylvania</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABS plastic</td>
			<td>Stratasys, MN, USA</td>
			<td>ABSplus-P430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimicrobial incise drape</td>
			<td>3M</td>
			<td>6650EZ</td>
			<td>Ioban Drape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental Acrylic</td>
			<td>Henry Schein, Inc.</td>
			<td>1013117</td>
			<td>Acrylic Bonding Agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elevators</td>
			<td>VWR International, LLC.</td>
			<td>10196-564</td>
			<td>Langenbeck Elevator, Wide Tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine suture</td>
			<td>McKesson Medical-Surgical Inc.</td>
			<td>1034505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gadoteridol</td>
			<td>Prohance, Bracco Diagnostics, Princeton, NJ</td>
			<td>0270-1111-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser for light stimulation</td>
			<td>Omicron-Laserage, Germany</td>
			<td>PhoxX 488-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MR compatible 3cc syringe</td>
			<td>Harvard apparatus, Holliston, MA, USA</td>
			<td>59-8377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MR Imaging Software</td>
			<td>Pixmeo</td>
			<td>OsiriX MD 10.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MR-Compatible Pump</td>
			<td>Harvard apparatus, Holliston, MA, USA</td>
			<td>Harvard PHD 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MR-compatible stereotaxic frame</td>
			<td>KOPF</td>
			<td>1430M MRI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perifix Clamp Style Catheter Connector</td>
			<td>B-Braun, Bethlehem, PA, USA</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Screws</td>
			<td>Plastics 1</td>
			<td>0-80 x 1/8N</td>
			<td>Nylon screws</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titanium screws</td>
			<td>Crist Instrument Co., Inc.</td>
			<td>6-YCX-0312</td>
			<td>Self-tapping bone screws</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trephine</td>
			<td>GerMedUSA Inc,</td>
			<td>SKU:GV70-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>uPrinter SE 3D printer</td>
			<td>Stratasys, MN, USA</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin E Capsule</td>
			<td>Pure Encapsulations, LLC.</td>
			<td>DE1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wet sterile absorbable gelatin</td>
			<td>Pfizer Inc.</td>
			<td>AZL0009034201</td>
			<td>Gelfoam</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

convection enhanced delivery of optogenetic adeno-associated viral vector to the cortex of rhesus macaque under guidance of online mri images

비 인간 영장류 (NHP) 광유전학에서, 바이러스 성 벡터로 큰 피질 영역을 감염하는 것은 종종 어렵고 시간이 많이 걸리는 작업입니다. 여기에서, 우리는 1 차적인 체감각 (S1) 및 모터 (M1) 원숭이의 피질 피질 로 광유전학 적 바이러스 벡터의 자기 공명 (MR) 유도 대류 강화 전달 (CED)의 사용을 입증하여 효율적이고 광범위한 피질 발현을 얻습니다. 빛에 민감한 이온 채널. 황색 형광 단백질(EYFP)에 융합된 적색 이동 opsin C1V1을 코딩하는 아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터는 MR-유도 CED 하에서 코막강 마카크의 피질내로 주입되었다. 3개월 후 주입 후, 에피인광 이미징은 2개의 원숭이에서 M1 및S1에서 광유전학적 발현(>130 mm2)의 큰 영역을 확인하였다. 또한, 마이크로 전기 코르티코그래피 어레이를 사용하여 표현 영역에서 신뢰할 수 있는 빛을 불러일으킨 전기 생리학적 반응을 기록할 수 있었습니다. 나중에 리포터에 대한 조직학적 분석 및 면역 염색은 후피광성 이미징에 의해 지시된 분포에 대응하는 M1 및 S1에서 광범위하고 조밀한 광유전학적 발현을 밝혀냈다. 이 기술은 우리가 전통적인 기술에 비해 최소한의 손상으로 시간의 짧은 기간 내에 피질의 넓은 영역에 걸쳐 발현을 얻을 수 있게 하고 NHPs와 같은 큰 동물에 있는 광유전학 바이러스성 납품을 위한 최적 접근일 수 있습니다. 이 접근법은 인간과 진화적으로 가까운 동물 모델에서 세포 유형 특이성을 가진 신경 회로의 네트워크 수준 조작에 대한 큰 잠재력을 보여줍니다.

MRI 지침에 따라 대류 향상된 전달 (CED)
바이러스 벡터의 확산은 온라인 MR 이미지의 지도하에 CED 주입동안 모니터링되었다(도 3A). 본 연구에서는, 두 마리의 원숭이의 S1및 M1을 표적으로 하였다(도 3B). 3차원 분포량은 Yazdan-Shahmorad 등 에서 설명한 바와 같이 MR 이미지(그림...

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Convection Enhanced Delivery of Optogenetic Adeno-associated Viral Vector to the Cortex of Rhesus Macaque Under Guidance of Online MRI Images

여기에서, 우리는 마카크 두뇌에 있는 큰 피질 지역에 걸쳐 광유전학적 표현을 달성하기 위한 효율적이고 간단한 접근으로 피질로 바이러스 벡터의 자기 공명 (MR) 유도된 대류 강화한 납품 (CED)를 보여줍니다.

대류 온라인 MRI 이미지의 지도하에 Rhesus Macaque의 피질에 광유전학 아데노 관련 바이러스 벡터의 향상된 납품

In non-human primate (NHP) optogenetics, infecting large cortical areas with viral vectors is often a difficult and time-consuming task. Here, we ...

비 인간 영장류에 있는 광유전학 바이러스 벡터의 대류 향상한 납품, 또는 CED는 연구원이 복잡한 신경 계산 및 행동을 이해하기 위하여 대규모로 신경 활동을 조작하는 것을 가능하게 할 것입니다. CED를 사용하면 전통적인 방법에 비해 짧은 시간에 몇 번의 주사만으로 영장류 뇌의 큰 영역에 걸쳐 높은 광유전학 적 발현을 달성 할 수 있습니다. 자기 공명 또는 MR 호환 챔버 이식은 비 인간 영장류 수술에서 표준 관행을 사용하여 수행되며, 절차는 텍스트 프로토콜에 자세히 설명되어 있으며 이 비디오에서 간략하게 설명된다.텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 동물 진정, 위치 지정 및 초기 절개에 따라, 트레핀을 사용하여 주사에 대한 미리 계획된 궤적을 커버하는 원형 두개통절제술을 생성한다. 트레핀의 조절 가능한 중심점을 사용하여 트레핀을 고정하기 위해 두개골 깊숙이 계획된 두개골 절제술의 중심에 들여쓰기를 만듭니다. 센터가 만들어지면 트레핀을 두개골에 내리고 트레핀을 시계 반대 방향으로 회전시키면서 골격 캡을 집게로 제거할 수 있을 때까지 하방 압력을 가합니다.텍스트 프로토콜에 자세히 설명된 대로 두라를 들어 올린 후 두라를 중앙에서 두개골 절제술의 가장자리로 자르고 미세한 안과 가위로 가장자리를 따라 계속합니다. 원통형 관습을 탑재하여 두개골 위에 있는 두개골에 전달 MR 호환 챔버를 강화하여 챔버 플랜지의 곡률이 두개골곡과 잘 정렬되는 주입은 주포 중에 캐뉼라 지원을 제공합니다. 플라스틱 나사와 치과 아크릴 또는 몇 티타늄 나사를 사용하여 두개골에 임플란트를 고정하십시오.MR 호환 챔버를 이식하고 챔버에 캐뉼라 주입 그리드를 삽입한 직후, MR 해부학 적 이미지를 통해 주입 위치를 시각화하기위한 0.9 % 식염수로 그리드를 채웁니다. 또한 뇌의 수분을 유지하기 위해 젖은 멸균 흡수성 젤 폼으로 챔버 구멍을 채웁니다. 수송 및 MR 주입 시 실린더의 멸균성을 유지하기 위해 멸균 항균 절개 드레이프로 피부와 실린더를 덮습니다.비타민 E 캡슐을 배치하여 주사 그리드의 상단을 표시하여 긍정적인 식별을 합니다. 동물이 삽관된 상태로 남아 있는 동안 마취 회로에서 내트라큐리 튜브를 분리하고 휴대용 MR 호환 이소플루란 기계에 다시 부착합니다. 동물을 MRI 스캐너로 운반합니다.T1 이미지를 획득하여 사출 그리드와 피질 표면의 상단에서의 거리를 계산합니다. 비타민 E 캡슐은 T1 이미지에서 명확하게 볼 수 있으며 사출 그리드의 상단에 대한 마커로 사용해야합니다. T2 이미지를 획득하여 주입 대상 부위를 기반으로 각 부위에 대한 최적의 캐뉼라 가이드를 결정합니다.캐뉼라 그리드는 T2 이미지에서 가장 잘 볼 수 있는 식염수로 채워져 있습니다. MR 이미징 소프트웨어를 사용하여 관상 및 좌활 평면을 스크롤하여 주입의 대상 위치를 찾습니다. 실온에서 몇 시간 동안 바이러스 벡터를 해동한 후, 피펫 또는 소용돌이 혼합에 의해 MR 조영제 가도테돌과 바이러스 벡터를 혼합한다.혼합 바이러스를 0.2 밀리리터 고압 IV 튜브에 적재합니다. 고압 IV 튜브를 사용하여 긴 연장 라인을 MR 호환 3 밀리리터 주사기에 연결하고 식염수와 프라임하십시오. 바이러스가로드 된 0.2 밀리리터 IV 튜브에 긴 확장 튜브의 다른 쪽 끝을 연결합니다.그런 다음 1 밀리리터 스노단 팁으로 역류 저항 캐뉼라를 클램프 스타일 카테터 커넥터로 이 어셈블리의 단부 끝에 부착합니다. 마지막으로 MR 호환 펌프에 주사기를 설정합니다. 얻어진 기준선 해부학 MR 이미지를 사용하여 대상 주입 부위에 도달하는 데 필요한 캐뉼라 사출 그리드 위치 및 삽입 깊이를 선택합니다.멸균 테이프를 사용하여 캐뉼라의 삽입 깊이를 표시합니다. 분당 1마이크로리터의 속도로 주입을 시작하고 캐뉼라 팁에서 유체의 배출을 관찰하여 주입 라인에서 유체의 흐름을 시각적으로 검증합니다. 주입 라인의 흐름을 유지하면서 주입 그리드를 통해 수동으로 캐뉼라를 삽입하여 삽입 중에 침투된 조직이 캐뉼라를 막히는 것을 방지할 수 있습니다.이제 바이러스 벡터 주입의 온라인 모니터링을위한 빠른 플래시 T1 가중 이미지를 습득. MR 스캐너에서 검출하기에 충분한 바이러스가 주입되는 벡터의 약 10 마이크로리터를 주입한 후, 관찰된 바이러스 확산에 의해 명백한 정확한 캐뉼라 배치를 확인하기 위해 MR 이미지를 얻습니다. 삽입된 캐뉼라의 깊이가 올바르지 않으면 깊이를 적절히 조정하거나 캐뉼라를 천천히 제거하고 삽입을 다시 시도합니다.온라인 MR 이미지의 지침을 통해 주입을 모니터링합니다. 분당 마이크로리터를 분당 1단계로 분당 5마이크로리터로 늘리는 데 몇 분마다 주입 속도를 높입니다. 주입 속도를 천천히 높이고 높은 주입 속도가 조직 손상을 일으킬 수 있으므로 분당 5 마이크로 리터를 초과하지 않는 것이 중요합니다.바이러스 벡터의 약 40 마이크로리터를 주입한 후 분당 1마이크로리터로 주입 속도를 감소시키기 시작합니다. 약 50 마이크로리터가 주입된 후 주입을 중단하십시오. 캐뉼라를 10분 동안 제자리에 둡니다.천천히 뇌에서 캐뉼라를 제거하고 다음 위치로 이동합니다. 동물 수송 전에 주사의 끝에 멸균 커튼으로 실린더를 덮고, 수술실로 다시 동물을 수송합니다. 직렬 관상 학문 섹션에 대한 조직학적 분석은 주입 부위 의 주위에 대규모 광유전학 적 발현을 드러낸다.여기에 표시된 기준관상 MR 이미지와 동일한 MR 코로나 슬라이스에 대한 주입 후 조영제의 확산이 도시되어 있다. 관상 조직 섹션은 거의 동일한 에서 표시됩니다. 과록시다제 염색은 황색 형광 단백질 또는 EYFP 리포터의 발현을 반영한다.좋은 정렬은 EYFP 발현의 영역 사이 관찰되며, 표면 에피플루오레스향과 조직학적 염색으로 측정됩니다. 여기에는 MR 이미지에서 추정된 벡터 스프레드 영역이 포함됩니다. 흰색 점은 주입 부위를 나타내고 전체 검은 색 영역은 두개골 절제술에 의해 노출 된 영역을 나타냅니다.여기에 도시된 관상부 단면도의 낮은 배율 이미지는 색소 감각 피질에서 YFP 발현의 내측 측면 측면을 나타내는 항GFP 항체로 염색된다. 검은색 화살표헤드는 캐뉼라 트랙의 위치를 나타냅니다. 인접한 조직은 YFP 양성 세포의 라미나르 분포를 보여주기 위해 더 큰 배율로 나타난다.YFP 양성 세포의 인구 밀도가 높은 영역은 주로 2~3층과 5층에서 6층으로 위치하고 있다. 추가 확대는 2층에서 3층, 층 5층 및 층 6층에서 전형적인 피라미드 세포를 드러낸다. 흐름이 중지된 후 10분 동안 캐뉼라를 제자리에 두는 것이 중요합니다.이것은 바이러스가 주변 표적 신경 조직으로 침투했다는 것을 보장할 것입니다. CED는 포유류의 큰 뇌 영역에서 균일하게 높은 발현 수준을 달성하기 위한 효율적인 접근법입니다. 그것은 신경 회로와 연결에 대한 우리의 이해를 확장 할 수있는 잠재력을 가지고.CED에 의한 바이러스 성 트랜스듀션 후, 후속 광유전학 자극 실험은 전기 기록 및 행동 에세이와 결합하여 뇌 내의 복잡한 회로 역학을 드러낼 수 있습니다. 이 기술은 이전에 야즈단 샤모라드와 동료에 의해 사용되었습니다 2018 있는 광유전학 신경 변조는 감각 모터 피질에 있는 네트워크 넓은 연결 변경을 유도하기 위하여 이용되었습니다.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors

Adeno - 관련 바이러스성 벡터의 Intracranial 분사

Intracranial injection of viral vectors engineered to express a fluorescent protein is a versatile labeling technique for visualization of specific ...

연구

신경과학

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

만성에 대한 성인 태어나 강한 뉴런의 선택 바이러스성 전달 생체내에 Optogenetic의 자극

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells ...

Simultaneous Electroencephalography, Real-time Measurement of Lactate Concentration and Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity in the Rodent Cerebral Cortex

동시 Electroencephalography, 설치류 대뇌 피질의 젖산 농도와 Neuronal 활동 Optogenetic 조작의 실시간 측정

Although the brain represents less than 5% of the body  by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body  at rest1. The ...

Optogenetic Functional MRI

Optogenetic 기능 MRI

The investigation of the functional connectivity of precise neural circuits across the entire intact brain can be achieved through optogenetic functional ...

Subpial Adeno-associated Virus 9 (AAV9) Vector Delivery in Adult Mice

Subpial Adeno-associated Virus 9 AAV9 Vector Delivery in Adult Mice

성인 쥐의 Subpial Adeno-associated Virus 9 (AAV9) 벡터 전달

The successful development of a subpial adeno-associated virus 9 (AAV9) vector delivery technique in adult rats and pigs has been reported on previously. ...

Effects of Transcranial Alternating Current Stimulation on the Primary Motor Cortex by Online Combined Approach with Transcranial Magnetic Stimulation

Transcranial Alternating Current Stimulation (tACS) is a neuromodulatory technique able to act through sinusoidal electrical waveforms in a specific ...

Adeno-associated Virus-mediated Transgene Expression in Genetically Defined Neurons of the Spinal Cord

척수의 유전으로 정의 된 신경에 있는 Adeno 관련 바이러스 중재 Transgene 식

Selective manipulation of spinal neuronal subpopulations has mainly been achieved by two different methods: 1) Intersectional genetics, whereby double or ...

Automated Segmentation of Cortical Grey Matter from T1-Weighted MRI Images

T1-가중치 MRI 이미지에서 외피 회색 물질의 자동된 분할

Within neuroimaging research, a number of recent studies have discussed the impact of between-study differences in volumetric findings that are thought to ...

Direct Intrathecal Injection of Recombinant Adeno-associated Viruses in Adult Mice

성인 쥐에 있는 재조합 형 Adeno 관련 바이러스의 직접 Intrathecal 주입

Intrathecal (IT) injection of adeno-associated virus (AAV) has drawn considerable interest in CNS gene therapy by virtue of its safety, noninvasiveness, ...

Delivery of Antibodies into the Murine Brain via Convection-enhanced Delivery

대류 강화 전달을 통해 뮤린 뇌로 항체 전달

Convection-enhanced delivery (CED) is a neurosurgical technique enabling effective perfusion of large brain volumes using a catheter system. Such an ...