Name: convection enhanced delivery of optogenetic adeno-associated viral vector to the cortex of rhesus macaque under guidance of online mri images
Uploaded: 2019-05-23T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Convection Enhanced Delivery of Optogenetic Adeno-associated Viral Vector to the Cortex of Rhesus Macaque Under Guidance of Online MRI Images at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av American Heart Association postdoktor fellesskap (AY), Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA) omorganisering og plastisitet å akselerere skade utvinning (REPAIR; N66001-10-C-2010), R01. NS073940, og av UCSF nevrovitenskap Imaging Center. Dette arbeidet ble også støttet av Eunice Kennedy skjelve National Institute of Child Health & Human utvikling av National Institutes of Health under Award Number K12HD073945, Washington National primater Research Center (WaNPCR, P51 OD010425), og Center for Neurotechnology (CNT, en National Science Foundation engineering Research Center under Grant EØF-1028725). Vi takker Camilo Diaz-Botia, Tim Hanson, Viktor Kharazia, Daniel sølvsmed, Karen J. MacLeod, Juliana Milani, og Blakely Andrews for deres hjelp med eksperimenter og Nan Tian, Jiwei he, Peter Ledochowitsch, Michel Maharbiz, og Toni Haun for teknisk hjelp.

Alle prosedyrer er godkjent av University of California, San Francisco institusjonelle Animal Care og use Committee (IACUC) og er i samsvar med guide for Stell og bruk av Laboratoriedyr. Følgende prosedyre ble utført med to voksne mannlige rhesus aper på 8 og 7 år, som veier 17,5 kg og 16,5 kg (ape G og ape J), henholdsvis.
Merk: Bruk standard aseptisk teknikk for alle kirurgiske prosedyrer.
1. Baseline Imaging
<ol><li>Sedate og intubere dyret og opprettholde ...

<ol>
	<li>Ruiz, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetics+through+windows+on+the+brain+in+the+nonhuman+primate.">Optogenetics through windows on the brain in the nonhuman primate.</a> Journal of Neurophysiology. 110 (6), 1455-1467 (2013).</li><li>Diester, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optogenetic+toolbox+designed+for+primates.">An optogenetic toolbox designed for primates.</a> Nature Neuroscience. 14 (3), 387-397 (2011).</li><li>Ohayon, S., Grimaldi, P., Schweers, N., Tsao, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saccade+modulation+by+optical+and+electrical+stimulation+in+the+macaque+frontal+eye+field.">Saccade modulation by optical and electrical stimulation in the macaque frontal eye field.</a> Journal of Neuroscience. 33 (42), 16684-16697 (2013).</li><li>Gerits, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetically+induced+behavioral+and+functional+network+changes+in+primates.">Optogenetically induced behavioral and functional network changes in primates.</a> Current Biology. 22 (18), 1722-1726 (2012).</li><li>Jazayeri, M., Lindbloom-Brown, Z., Horwitz, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saccadic+eye+movements+evoked+by+optogenetic+activation+of+primate+V1.">Saccadic eye movements evoked by optogenetic activation of primate V1.</a> Nature Neuroscience. 15 (10), 1368-1370 (2012).</li><li>Dai, J., Brooks, D. I., Sheinberg, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+and+electrical+microstimulation+systematically+bias+visuospatial+choice+in+primates.">Optogenetic and electrical microstimulation systematically bias visuospatial choice in primates.</a> Current Biology. 24 (1), 63-69 (2014).</li><li>Afraz, A., Boyden, E. S., DiCarlo, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+and+pharmacological+suppression+of+spatial+clusters+of+face+neurons+reveal+their+causal+role+in+face+gender+discrimination.">Optogenetic and pharmacological suppression of spatial clusters of face neurons reveal their causal role in face gender discrimination.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (21), 6730-6735 (2015).</li><li>Ledochowitsch, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+optical+control+and+simultaneous+electrical+readout+of+extended+cortical+circuits.">Strategies for optical control and simultaneous electrical readout of extended cortical circuits.</a> Journal of Neuroscience Methods. 256, 220-231 (2015).</li><li>Yazdan-Shahmorad, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Large-Scale+Interface+for+Optogenetic+Stimulation+and+Recording+in+Nonhuman+Primates.">A Large-Scale Interface for Optogenetic Stimulation and Recording in Nonhuman Primates.</a> Neuron. 89 (5), 927-939 (2016).</li><li>Ju, N., Jiang, R., Macknik, S. L., Martinez-Conde, S., Tang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+all-optical+interrogation+of+cortical+neurons+in+awake-behaving+nonhuman+primates.">Long-term all-optical interrogation of cortical neurons in awake-behaving nonhuman primates.</a> PLoS Biology. 16 (8), e2005839 (2018).</li><li>Bankiewicz, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convection-enhanced+delivery+of+AAV+vector+in+parkinsonian+monkeys;+in+vivo+detection+of+gene+expression+and+restoration+of+dopaminergic+function+using+pro-drug+approach.">Convection-enhanced delivery of AAV vector in parkinsonian monkeys; in vivo detection of gene expression and restoration of dopaminergic function using pro-drug approach.</a> Experimental Neurology. 164 (1), 2-14 (2000).</li><li>Kells, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+therapy-based+method+for+the+delivery+of+therapeutics+to+primate+cortex.">Efficient gene therapy-based method for the delivery of therapeutics to primate cortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (7), 2407-2411 (2009).</li><li>Krauze, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reflux-free+cannula+for+convection-enhanced+high-speed+delivery+of+therapeutic+agents.">Reflux-free cannula for convection-enhanced high-speed delivery of therapeutic agents.</a> Journal of Neurosurgery. 103 (5), 923-929 (2005).</li><li>Yazdan-Shahmorad, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+optogenetic+expression+in+macaque+cortex+obtained+with+MR-guided,+convection+enhanced+delivery+(CED)+of+AAV+vector+to+the+thalamus.">Widespread optogenetic expression in macaque cortex obtained with MR-guided, convection enhanced delivery (CED) of AAV vector to the thalamus.</a> Journal of Neuroscience Methods. 293, 347-358 (2018).</li><li>Yazdan-Shahmorad, A., Silversmith, D. B., Kharazia, V., Sabes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+cortical+reorganization+using+optogenetics+in+non-human+primates.">Targeted cortical reorganization using optogenetics in non-human primates.</a> Elife. 7, (2018).</li><li>Yazdan-Shahmorad, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demonstration+of+a+setup+for+chronic+optogenetic+stimulation+and+recording+across+cortical+areas+in+non-human+primates.">Demonstration of a setup for chronic optogenetic stimulation and recording across cortical areas in non-human primates.</a> SPIE BiOS. , (2015).</li><li>Lerchner, W., Corgiat, B., Der Minassian, V., Saunders, R. C., Richmond, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injection+parameters+and+virus+dependent+choice+of+promoters+to+improve+neuron+targeting+in+the+nonhuman+primate+brain.">Injection parameters and virus dependent choice of promoters to improve neuron targeting in the nonhuman primate brain.</a> Gene Therapy. 21 (3), 233-241 (2014).</li><li>Acker, L., Pino, E. N., Boyden, E. S., Desimone, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FEF+inactivation+with+improved+optogenetic+methods.">FEF inactivation with improved optogenetic methods.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (46), (2016).</li><li>Bobo, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convection-enhanced+delivery+of+macromolecules+in+the+brain.">Convection-enhanced delivery of macromolecules in the brain.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (6), 2076-2080 (1994).</li><li>Lieberman, D. M., Laske, D. W., Morrison, P. F., Bankiewicz, K. S., Oldfield, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convection-enhanced+distribution+of+large+molecules+in+gray+matter+during+interstitial+drug+infusion.">Convection-enhanced distribution of large molecules in gray matter during interstitial drug infusion.</a> Journal of Neurosurgery. 82 (6), 1021-1029 (1995).</li><li>Lonser, R. R., Gogate, N., Morrison, P. F., Wood, J. D., Oldfield, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+convective+delivery+of+macromolecules+to+the+spinal+cord.">Direct convective delivery of macromolecules to the spinal cord.</a> Journal of Neurosurgery. 89 (4), 616-622 (1998).</li><li>Szerlip, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+of+convection-enhanced+delivery+of+viruses+and+virus-sized+particles.">Real-time imaging of convection-enhanced delivery of viruses and virus-sized particles.</a> Journal of Neurosurgery. 107 (3), 560-567 (2007).</li></ol>

Her skisserer vi en gjennomførbar og effektiv teknikk for å oppnå stor skala optogenetic uttrykk i NHP primære somatosensory og motor cortex av MR-guidet CED. Bruken av MR-guidede CED presenterer betydelige fordeler fremfor tradisjonelle metoder for viral infusjon i NHP hjernen. En slik fordel er evnen til å oppnå uttrykk over store områder med færre nødvendige infusjoner. For eksempel, med konvensjonelle metoder, flere injeksjoner av 1-2 μL av vektoren yield uttrykk i en 2-3 mm diameter region<sup class="xref"...

Optogenetics er et kraftig verktøy som gjør det mulig for manipulering av nevrale aktivitet og studiet av nettverkstilkoblinger i hjernen. Implementering av denne teknikken i ikke-menneskelige primater (NHPs) har potensial til å forbedre vår forståelse av storstilt nevrale beregning, kognisjon, og atferd i primater hjernen. Selv om optogenetics har blitt implementert i NHPs de siste årene1,2,3,4,5,6,7, en utfordring som Forskerne står overfor er å oppnå høye nivåer av uttrykk på tvers av store hjerneområder i disse dyrene. Her gir vi en effektiv og forenklet tilnærming for å oppnå høye nivåer av optogenetic uttrykk på tvers av store områder av cortex i aper. Denne teknikken har stort potensial for å forbedre dagens optogenetic studier i disse dyrene i kombinasjon med State-of-the-art innspillingen8,9 og optisk stimulering10 Technologies.
Konveksjon forbedret levering (CED) er en etablert metode for levering av farmakologiske midler og andre store molekyler, inkludert viral vektorer, til sentrale nervesystemet11,12,13. Mens konvensjonelle leveringsmetoder involverer flere infusjoner med lavt volum fordelt på små områder i hjernen, kan CED oppnå bredere og jevnere agent fordeling med færre infusjoner. Trykk drevet bulkvæske strømning (konveksjon) under infusjon gjør det mulig for mer utbredt og jevnt fordelt Transduction av målet vev når levere viral vektorer med CED. I nyere studier, demonstrerte vi Transduction og påfølgende optogenetic uttrykk for store områder av primær motor (M1) og somatosensory (S1) barken9 og thalamus14 ved hjelp av magnetisk resonans (Mr)-guidet CED.
Her skisserer vi bruken av CED for å oppnå optogenetic uttrykk på tvers av store kortikale områder med bare noen få kortikale injeksjoner.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 mL High Pressure IV Tubing</td>
			<td>Smiths Medical Inc., Dublin, OH, USA</td>
			<td>533640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.32 mm ID, 0.43 mm OD Silica Tubing</td>
			<td>Polymicro Technologies</td>
			<td>1068150027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 mm ID, 0.76 mm OD Silica Tubing</td>
			<td>Polymicro Technologies</td>
			<td>1068150625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV2.5-CamKII-C1V1-EYFP</td>
			<td>Penn Vector Core, University of Pennsylvania</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABS plastic</td>
			<td>Stratasys, MN, USA</td>
			<td>ABSplus-P430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimicrobial incise drape</td>
			<td>3M</td>
			<td>6650EZ</td>
			<td>Ioban Drape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental Acrylic</td>
			<td>Henry Schein, Inc.</td>
			<td>1013117</td>
			<td>Acrylic Bonding Agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elevators</td>
			<td>VWR International, LLC.</td>
			<td>10196-564</td>
			<td>Langenbeck Elevator, Wide Tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine suture</td>
			<td>McKesson Medical-Surgical Inc.</td>
			<td>1034505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gadoteridol</td>
			<td>Prohance, Bracco Diagnostics, Princeton, NJ</td>
			<td>0270-1111-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser for light stimulation</td>
			<td>Omicron-Laserage, Germany</td>
			<td>PhoxX 488-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MR compatible 3cc syringe</td>
			<td>Harvard apparatus, Holliston, MA, USA</td>
			<td>59-8377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MR Imaging Software</td>
			<td>Pixmeo</td>
			<td>OsiriX MD 10.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MR-Compatible Pump</td>
			<td>Harvard apparatus, Holliston, MA, USA</td>
			<td>Harvard PHD 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MR-compatible stereotaxic frame</td>
			<td>KOPF</td>
			<td>1430M MRI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perifix Clamp Style Catheter Connector</td>
			<td>B-Braun, Bethlehem, PA, USA</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Screws</td>
			<td>Plastics 1</td>
			<td>0-80 x 1/8N</td>
			<td>Nylon screws</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titanium screws</td>
			<td>Crist Instrument Co., Inc.</td>
			<td>6-YCX-0312</td>
			<td>Self-tapping bone screws</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trephine</td>
			<td>GerMedUSA Inc,</td>
			<td>SKU:GV70-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>uPrinter SE 3D printer</td>
			<td>Stratasys, MN, USA</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin E Capsule</td>
			<td>Pure Encapsulations, LLC.</td>
			<td>DE1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wet sterile absorbable gelatin</td>
			<td>Pfizer Inc.</td>
			<td>AZL0009034201</td>
			<td>Gelfoam</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

convection enhanced delivery of optogenetic adeno-associated viral vector to the cortex of rhesus macaque under guidance of online mri images

I ikke-menneskelige primater (NHP) optogenetics, infiserer store kortikale områder med viral vektorer er ofte en vanskelig og tidkrevende oppgave. Her viser vi bruken av magnetisk resonans (MR)-guidet konveksjon forbedret levering (CED) av optogenetic viral vektorer i primær somatosensory (S1) og motor (M1) Barken av aper å få effektiv, utbredt kortikale uttrykk for lysfølsomme ion-kanaler. Adeno-Associated viral (AAV) vektorer koding av rød-forskjøvet opsin C1V1 smeltet til gult fluorescerende protein (EYFP) ble injisert i cortex på rhesus aper under MR-guidet CED. Tre måneders etter infusjon bekreftet epifluorescent Imaging store områder av optogenetic uttrykk (> 130 mm2) i M1 og S1 i to aper. Videre var vi i stand til å spille inn pålitelige lys-fremkalt elektrofysiologi svar fra uttrykker områder ved hjelp av mikro-electrocorticographic arrays. Senere histologiske analyse og immunostaining mot reporteren avdekket utbredt og tett optogenetic uttrykk i M1 og S1 tilsvarende fordelingen indikert av epifluorescent Imaging. Denne teknikken gjør det mulig for oss å få uttrykk på tvers av store områder av cortex i løpet av en kortere periode med minimal skade i forhold til de tradisjonelle teknikkene og kan være en optimal tilnærming for optogenetic viral levering i store dyr som NHPs. Denne tilnærmingen demonstrerer stort potensial for nettverk-nivå manipulering av nevrale kretser med celle-type spesifisitet i dyremodeller evolutionarily nær mennesker.

Konveksjon forbedret levering (CED) under Mr-veiledning
Spredningen av viral vektoren ble overvåket under CED infusjon under veiledning av online MR bilder (figur 3a). I denne studien var S1 og M1 av to aper målrettet (figur 3b). De tre-dimensjonale distribusjons volumene ble anslått i en post-hoc-analyse av MR-bildene (figur 3c<...

Watch this Scientific Journal Video about Convection Enhanced Delivery of Optogenetic Adeno-associated Viral Vector to the Cortex of Rhesus Macaque Under Guidance of Online MRI Images at JoVE.com

Convection Enhanced Delivery of Optogenetic Adeno-associated Viral Vector to the Cortex of Rhesus Macaque Under Guidance of Online MRI Images

Her viser vi magnetisk resonans (MR)-guidet konveksjon forbedret levering (CED) av viral vektorer i cortex som en effektiv og forenklet tilnærming for å oppnå optogenetic uttrykk på tvers av store kortikale områder i macaque hjernen.

Konveksjon Enhanced levering av Optogenetic Adeno-Associated viral Vector til cortex på rhesus macaque under veiledning av online MRI bilder

In non-human primate (NHP) optogenetics, infecting large cortical areas with viral vectors is often a difficult and time-consuming task. Here, we ...

Konveksjon forbedret levering, eller CED, av optogenetiske virale vektorer i ikke-menneskelige primater vil gjøre det mulig for forskere å manipulere nevrale aktivitet i stor skala for å forstå komplekse nevrale beregninger og atferd. Med CED kan vi oppnå høyt optogenetisk uttrykk på tvers av store regioner av primathjernen med bare noen få injeksjoner på kort tid sammenlignet med tradisjonelle metoder. Magnetisk resonans eller MR-kompatibel kammerimplantasjon utføres ved hjelp av standard praksis i ikke-menneskelige primatoperasjoner, prosedyren er beskrevet i detalj i tekstprotokollen og skissert kort i denne videoen.Etter dyr sedasjon, posisjonering, og innledende snitt som beskrevet i tekstprotokollen, opprette en sirkulær kraniotomi for å dekke de planlagte baner for injeksjoner ved hjelp av en trephine. Lag en innrykk i midten av den planlagte kraniotomien tilstrekkelig dypt i skallen for å forankre trefinen ved hjelp av det justerbare sentreringspunktet til trefinen. Når midten er gjort, senk trefinen på skallen og roter trefinen med klokken og mot klokken mens du bruker nedadgående trykk til benhetten kan fjernes med tang.Etter å ha løftet duraen som beskrevet i tekstprotokollen, kutt duraen fra midten til kanten av kraniotomien og fortsett langs kanten med fin oftalmisk saks. Monter den sylindriske skreddersydde konveksjon forbedret levering MR kompatibelt kammer til skallen på toppen av kraniotomi for å gi kanyler støtte under infusjon slik at krumningen av kammerflensen justerer godt med krumningen av skallen. Fest implantatene til skallen ved hjelp av enten plastskruer og tannakryl eller noen titanskruer.Kort tid etter implantering av MR-kompatibelt kammer og sette kanyleinjeksjonsgitteret inn i kammeret, fyll rutenettet med 0,9% saltvann for å visualisere injeksjonsstedene via MR anatomiske bilder. Fyll også kammerhulene med vått sterilt absorberbart gelskum for å opprettholde hjernens fuktighet. Dekk huden og sylinderen med en steril antimikrobiell incise drap for å opprettholde steriliteten til sylinderne under transport og MR infusjoner.Plasser en vitamin E-kapsel for å markere toppen av injeksjonsgitteret for positiv identifikasjon. Mens dyret forblir intubert, løsner du det endotrakeale røret fra anestesikretsen og feste det til en bærbar MR-kompatibel isofluranmaskin. Transporter dyret til MR-skanneren.Hent T1-bilder for å beregne avstanden fra toppen av injeksjonsgitteret og den kortikale overflaten. Vitamin E kapselen er godt synlig i T1 bilder og bør brukes som en markør for toppen av injeksjon rutenettet. Hent T2-bilder for å bestemme de optimale kanyleveiledningene for hvert nettsted basert på det målrettede infusjonsstedet.Kanylen rutenettet er fylt med saltvann som er best synlig i T2 bilder. Ved hjelp av MR-bildebehandlingsprogramvaren blar du gjennom koronar- og sagittalplanene for å finne infusjonsstedet. Etter tining av den virale vektoren i noen timer ved romtemperatur, bland den virale vektoren med MR-kontrastmiddelet gadoteridol med pipette eller vortexblanding.Last det blandede viruset i 0,2 milliliter høytrykk IV-rør. Bruk høytrykks-IV-rør, koble en lang forlengelseslinje til en MR-kompatibel tre milliliter sprøyte og prime med saltvann. Koble den andre enden av den lange forlengelsesslangen til 0,2 milliliter IV-slangen lastet med viruset.Fest deretter den refluksbestandige kanylen med en ett milliliters tråkket tupp til den distale enden av denne enheten med en klemmestil kateterkontakt. Til slutt setter du sprøyten i en MR-kompatibel pumpe. Bruk de oppnådde anatomiske MR-bildene ved baseline, velg plasseringen av kanyleninjeksjonsgitter og innsettingsdybde som trengs for å nå infusjonsstedet for målet.Merk innsettingsdybden på kanylen ved hjelp av steril tape. Begynn infusjonen med en hastighet på en mikroliter per minutt og valider væskestrømmen visuelt i infusjonslinjen ved å observere utstøting av væske fra kanylespissen. Sett kanylen manuelt gjennom injeksjonsgitteret til måldybden samtidig som strømmen opprettholdes i infusjonslinjen, da dette vil hindre at det trengende vevet tetter kanylen under innsetting.Nå skaffe rask flash T1-vektede bilder for online overvåking av viral vektor infusjon. Etter å ha infundert ca 10 mikroliter av vektoren slik at nok virus er infundert til å oppdage i MR-skanneren, få MR-bilder for å verifisere riktig kanyleplassering som tydelig ved den observerte spredningen av viruset. Hvis dybden på den innsatte kanylen er feil, justerer du dybden tilsvarende eller fjerner kanylen langsomt og setter innsettingen på igjen.Overvåk infusjonen via veiledning av online MR-bilder. Øk infusjonshastigheten til fem mikroliter per minutt med ett mikroliter per minutt trinn med noen få minutter. Det er viktig å øke infusjonshastigheten langsomt og ikke overstige fem mikroliter per minutt, da høye infusjonshastigheter kan forårsake vevsskade.Etter å ha infusert ca. 40 mikroliter av virusvektoren, begynner du å redusere infusjonshastigheten med ett mikroliter per minutt trinn. Stopp infusjonen etter at ca. 50 mikroliter er injisert. La kanylen være på plass i ti minutter.Fjern kanylen langsomt fra hjernen og flytt til neste sted. Dekk sylinderen med en steril drapering på slutten av injeksjoner før dyretransport, og transport deretter dyret tilbake til operasjonssalen. Histologiske analyser på serielle koronarseksjoner avslører storskala optogenetisk uttrykk rundt infusjonsstedene.Vist her er baseline koronar MR bilde og spredning av kontrastmiddelet etter infusjonen for samme MR koronar skive. En koronal vevseksjon er vist fra omtrent det samme. Peroxidasefarging reflekterer uttrykk for det gule fluorescerende proteinet eller EYFP-reporteren.God justering observeres mellom området av EYFP uttrykk, målt med overflate epifluorescense og med histologisk farging. Disse inkluderer området av vektor spredning anslått fra MR-bilder. Hvite prikker indikerer injeksjonssteder, og hele den svarte regionen representerer området som eksponeres av kraniotomien.Vist her er et lavt forstørrelsesbilde av koronale seksjoner farget med anti GFP antistoff som viser det mediale laterale aspektet av YFP-uttrykket i somatosensorisk cortex. Det svarte pilhodet angir plasseringen av kanylesporet. Det tilstøtende vevet er vist ved større forstørrelse for å vise laminær fordeling av YFP-positive celler.Tett befolkede områder av YFP positive celler ligger hovedsakelig i lag to til tre og fem til seks. Ytterligere utvidelse avslører typiske pyramideceller i lag to til tre, lag fem og lag seks. Det er viktig å la kanylen være på plass i 10 minutter etter at strømmen har stoppet.Dette vil sikre at viruset har percolated inn i det omkringliggende målrettede nevrale vevet. CED er en effektiv tilnærming for å oppnå jevnt høye uttrykksnivåer på tvers av store hjerneregioner hos pattedyr. Den har potensial til å utvide vår forståelse av nevrale kretser og tilkobling.Etter viral transduksjon av CED, kan påfølgende optogenetiske stimuleringseksperimenter kombineres med elektrisk opptak og atferdsessays for å avsløre den komplekse kretsdynamikken i hjernen. Denne teknikken har tidligere vært ansatt av Yazdan-Shahmorad og kolleger i 2018 der optogenetisk neural modulasjon ble brukt til å indusere nettverksomfattende tilkoblingsendringer i sensorisk motorcortex.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors

Intracranial injection of viral vectors engineered to express a fluorescent protein is a versatile labeling technique for visualization of specific ...

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Selektiv Viral Transduksjon of Adult-fødte olfactory Neurons for Chronic In vivo Optogenetic Stimulering

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells ...

Simultaneous Electroencephalography, Real-time Measurement of Lactate Concentration and Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity in the Rodent Cerebral Cortex

Samtidig Electroencephalography, Real-time Måling av laktat Konsentrasjon og Optogenetic Manipulering av neuronal aktivitet i Rodent Cerebral Cortex

Although the brain represents less than 5% of the body  by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body  at rest1. The ...

Optogenetic Functional MRI

Optogenetic Funksjonell MRI

The investigation of the functional connectivity of precise neural circuits across the entire intact brain can be achieved through optogenetic functional ...

Subpial Adeno-associated Virus 9 (AAV9) Vector Delivery in Adult Mice

Subpial Adeno-associated Virus 9 AAV9 Vector Delivery in Adult Mice

Subpial Adeno-assosiert Virus 9 (AAV9) Vector Levering i voksne mus

The successful development of a subpial adeno-associated virus 9 (AAV9) vector delivery technique in adult rats and pigs has been reported on previously. ...

Effects of Transcranial Alternating Current Stimulation on the Primary Motor Cortex by Online Combined Approach with Transcranial Magnetic Stimulation

Effekter av Transkraniell vekselstrøm stimulering på primære motorisk Cortex av Online kombinert tilnærming med Transkraniell magnetisk stimulering

Transcranial Alternating Current Stimulation (tACS) is a neuromodulatory technique able to act through sinusoidal electrical waveforms in a specific ...

Adeno-associated Virus-mediated Transgene Expression in Genetically Defined Neurons of the Spinal Cord

Adeno-assosiert Virus-mediert Transgene uttrykk i genetisk definerte nerveceller i ryggmargen

Selective manipulation of spinal neuronal subpopulations has mainly been achieved by two different methods: 1) Intersectional genetics, whereby double or ...

Automated Segmentation of Cortical Grey Matter from T1-Weighted MRI Images

Automatisert segmentering av kortikale grå materie fra T1-vektet MRI bilder

Within neuroimaging research, a number of recent studies have discussed the impact of between-study differences in volumetric findings that are thought to ...

Direct Intrathecal Injection of Recombinant Adeno-associated Viruses in Adult Mice

Direkte intratekal injeksjon av rekombinant Adeno-assosiert virus i voksen mus

Intrathecal (IT) injection of adeno-associated virus (AAV) has drawn considerable interest in CNS gene therapy by virtue of its safety, noninvasiveness, ...

Delivery of Antibodies into the Murine Brain via Convection-enhanced Delivery

Levering av antistoffer inn i murine Brain via konveksjon-forbedret levering

Convection-enhanced delivery (CED) is a neurosurgical technique enabling effective perfusion of large brain volumes using a catheter system. Such an ...