Name: convection enhanced delivery of optogenetic adeno-associated viral vector to the cortex of rhesus macaque under guidance of online mri images
Uploaded: 2019-05-23T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Convection Enhanced Delivery of Optogenetic Adeno-associated Viral Vector to the Cortex of Rhesus Macaque Under Guidance of Online MRI Images at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado pela American Heart Association pós-doutorado Fellowship (AY), defesa avançada pesquisa projetos agência (DARPA) reorganização e plasticidade para acelerar a recuperação de lesões (REPAIR; N66001-10-C-2010), R01. NS073940, e pelo centro de imagiologia da neurociência UCSF. Este trabalho também foi apoiado pelo Instituto Nacional de saúde infantil Eunice Kennedy Shiver & desenvolvimento humano dos institutos nacionais de saúde o prêmio número K12HD073945, o Washington National Primate Research Center (WaNPCR, P51 OD010425), e o centro de Neurotecnologia (CNT, um centro nacional de ciência da Fundação de engenharia de pesquisa a subvenção CEE-1028725). Agradecemos a Camilo Diaz-Botia, Tim Hanson, Viktor Kharazia, Daniel Silversmith, Karen J. MacLeod, Juliana Milani e Blakely Andrews por sua ajuda com os experimentos e NaN Tian, Jiwei He, Peter Ledochowitsch, Michel Maharbiz e Toni Haun para obter ajuda técnica.

Todos os procedimentos foram aprovados pela Universidade da Califórnia, San Francisco institucional de cuidados e uso de animais do Comitê (IACUC) e estão em conformidade com o guia para o cuidado e uso de animais de laboratório. O procedimento a seguir foi realizado com dois macacos machos adultos de 8 e 7 anos de idade, pesando 17,5 kg e 16,5 kg (macaco G e macaco J), respectivamente.
Nota: Use técnicas assépticas padrão para todos os procedimentos cirúrgicos.
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	<li>Ruiz, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetics+through+windows+on+the+brain+in+the+nonhuman+primate.">Optogenetics through windows on the brain in the nonhuman primate.</a> Journal of Neurophysiology. 110 (6), 1455-1467 (2013).</li><li>Diester, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optogenetic+toolbox+designed+for+primates.">An optogenetic toolbox designed for primates.</a> Nature Neuroscience. 14 (3), 387-397 (2011).</li><li>Ohayon, S., Grimaldi, P., Schweers, N., Tsao, D. 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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saccadic+eye+movements+evoked+by+optogenetic+activation+of+primate+V1.">Saccadic eye movements evoked by optogenetic activation of primate V1.</a> Nature Neuroscience. 15 (10), 1368-1370 (2012).</li><li>Dai, J., Brooks, D. I., Sheinberg, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+and+electrical+microstimulation+systematically+bias+visuospatial+choice+in+primates.">Optogenetic and electrical microstimulation systematically bias visuospatial choice in primates.</a> Current Biology. 24 (1), 63-69 (2014).</li><li>Afraz, A., Boyden, E. S., DiCarlo, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+and+pharmacological+suppression+of+spatial+clusters+of+face+neurons+reveal+their+causal+role+in+face+gender+discrimination.">Optogenetic and pharmacological suppression of spatial clusters of face neurons reveal their causal role in face gender discrimination.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (21), 6730-6735 (2015).</li><li>Ledochowitsch, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+optical+control+and+simultaneous+electrical+readout+of+extended+cortical+circuits.">Strategies for optical control and simultaneous electrical readout of extended cortical circuits.</a> Journal of Neuroscience Methods. 256, 220-231 (2015).</li><li>Yazdan-Shahmorad, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Large-Scale+Interface+for+Optogenetic+Stimulation+and+Recording+in+Nonhuman+Primates.">A Large-Scale Interface for Optogenetic Stimulation and Recording in Nonhuman Primates.</a> Neuron. 89 (5), 927-939 (2016).</li><li>Ju, N., Jiang, R., Macknik, S. 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P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+therapy-based+method+for+the+delivery+of+therapeutics+to+primate+cortex.">Efficient gene therapy-based method for the delivery of therapeutics to primate cortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (7), 2407-2411 (2009).</li><li>Krauze, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reflux-free+cannula+for+convection-enhanced+high-speed+delivery+of+therapeutic+agents.">Reflux-free cannula for convection-enhanced high-speed delivery of therapeutic agents.</a> Journal of Neurosurgery. 103 (5), 923-929 (2005).</li><li>Yazdan-Shahmorad, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+optogenetic+expression+in+macaque+cortex+obtained+with+MR-guided,+convection+enhanced+delivery+(CED)+of+AAV+vector+to+the+thalamus.">Widespread optogenetic expression in macaque cortex obtained with MR-guided, convection enhanced delivery (CED) of AAV vector to the thalamus.</a> Journal of Neuroscience Methods. 293, 347-358 (2018).</li><li>Yazdan-Shahmorad, A., Silversmith, D. B., Kharazia, V., Sabes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+cortical+reorganization+using+optogenetics+in+non-human+primates.">Targeted cortical reorganization using optogenetics in non-human primates.</a> Elife. 7, (2018).</li><li>Yazdan-Shahmorad, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demonstration+of+a+setup+for+chronic+optogenetic+stimulation+and+recording+across+cortical+areas+in+non-human+primates.">Demonstration of a setup for chronic optogenetic stimulation and recording across cortical areas in non-human primates.</a> SPIE BiOS. , (2015).</li><li>Lerchner, W., Corgiat, B., Der Minassian, V., Saunders, R. C., Richmond, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injection+parameters+and+virus+dependent+choice+of+promoters+to+improve+neuron+targeting+in+the+nonhuman+primate+brain.">Injection parameters and virus dependent choice of promoters to improve neuron targeting in the nonhuman primate brain.</a> Gene Therapy. 21 (3), 233-241 (2014).</li><li>Acker, L., Pino, E. N., Boyden, E. S., Desimone, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FEF+inactivation+with+improved+optogenetic+methods.">FEF inactivation with improved optogenetic methods.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (46), (2016).</li><li>Bobo, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convection-enhanced+delivery+of+macromolecules+in+the+brain.">Convection-enhanced delivery of macromolecules in the brain.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (6), 2076-2080 (1994).</li><li>Lieberman, D. M., Laske, D. W., Morrison, P. F., Bankiewicz, K. S., Oldfield, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convection-enhanced+distribution+of+large+molecules+in+gray+matter+during+interstitial+drug+infusion.">Convection-enhanced distribution of large molecules in gray matter during interstitial drug infusion.</a> Journal of Neurosurgery. 82 (6), 1021-1029 (1995).</li><li>Lonser, R. R., Gogate, N., Morrison, P. F., Wood, J. D., Oldfield, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+convective+delivery+of+macromolecules+to+the+spinal+cord.">Direct convective delivery of macromolecules to the spinal cord.</a> Journal of Neurosurgery. 89 (4), 616-622 (1998).</li><li>Szerlip, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+of+convection-enhanced+delivery+of+viruses+and+virus-sized+particles.">Real-time imaging of convection-enhanced delivery of viruses and virus-sized particles.</a> Journal of Neurosurgery. 107 (3), 560-567 (2007).</li></ol>

Aqui, nós esboçamos uma técnica viável e eficiente para conseguir a expressão optogenética em grande escala no córtice somatosensory e do motor preliminar de NHP pelo Sr.-guiado CED. O uso da CED guiada por MR apresenta vantagens significativas sobre os métodos tradicionais de infusão viral no cérebro de NHP. Uma dessas vantagens é a capacidade de atingir a expressão em grandes áreas com menos infusões necessárias. Por exemplo, com métodos convencionais, múltiplas injeções de 1-2 μl da expressão de r...

Optogenetics é uma ferramenta poderosa que permite a manipulação da atividade neural e o estudo das conexões de rede no cérebro. A implementação desta técnica em primatas não humanos (NHPs) tem o potencial de melhorar a nossa compreensão da computação neural em grande escala, cognição e comportamento no cérebro do primata. Embora a optogenética tenha sido implementada com sucesso em nhps nos últimos anos1,2,3,4,5,6,7, um desafio que pesquisadores enfrentam está alcançando altos níveis de expressão em grandes áreas cerebrais nesses animais. Aqui, nós estamos fornecendo uma aproximação eficiente e simplificada para conseguir níveis elevados de expressão optogenética através das grandes áreas do córtice nos macaques. Esta técnica tem um grande potencial para melhorar a atual estudos optogenéticos nestes animais em combinação com o estado-da-arte de gravação8,9 e estimulação óptica10 tecnologias.
O fornecimento aprimorado de convecção (CED) é um método estabelecido de entrega de agentes farmacológicos e outras grandes moléculas, incluindo vetores virais, para o sistema nervoso central11,12,13. Considerando que os métodos convencionais de parto envolvem múltiplas infusões de baixo volume distribuídas em pequenas regiões do cérebro, a CED pode alcançar uma distribuição mais ampla e uniforme do agente com menos infusões. O fluxo de fluido a granel acionado por pressão (convecção) durante a infusão permite transdução mais ampla e uniformemente distribuída do tecido alvo ao entregar vetores virais com CED. Em estudos recentes, nós Demonstramos a transdução e a expressão optogenética subseqüente de grandes áreas do motor preliminar (M1) e dos córtices somatosensory (S1)9 e do tálamo14 usando a ressonância magnética (Sr.)-guiada CED.
Aqui, nós esboçamos o uso de CED para conseguir a expressão optogenética através das grandes áreas corticais com somente algumas injeções corticais.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 mL High Pressure IV Tubing</td>
			<td>Smiths Medical Inc., Dublin, OH, USA</td>
			<td>533640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.32 mm ID, 0.43 mm OD Silica Tubing</td>
			<td>Polymicro Technologies</td>
			<td>1068150027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 mm ID, 0.76 mm OD Silica Tubing</td>
			<td>Polymicro Technologies</td>
			<td>1068150625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV2.5-CamKII-C1V1-EYFP</td>
			<td>Penn Vector Core, University of Pennsylvania</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABS plastic</td>
			<td>Stratasys, MN, USA</td>
			<td>ABSplus-P430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimicrobial incise drape</td>
			<td>3M</td>
			<td>6650EZ</td>
			<td>Ioban Drape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental Acrylic</td>
			<td>Henry Schein, Inc.</td>
			<td>1013117</td>
			<td>Acrylic Bonding Agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elevators</td>
			<td>VWR International, LLC.</td>
			<td>10196-564</td>
			<td>Langenbeck Elevator, Wide Tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine suture</td>
			<td>McKesson Medical-Surgical Inc.</td>
			<td>1034505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gadoteridol</td>
			<td>Prohance, Bracco Diagnostics, Princeton, NJ</td>
			<td>0270-1111-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser for light stimulation</td>
			<td>Omicron-Laserage, Germany</td>
			<td>PhoxX 488-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MR compatible 3cc syringe</td>
			<td>Harvard apparatus, Holliston, MA, USA</td>
			<td>59-8377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MR Imaging Software</td>
			<td>Pixmeo</td>
			<td>OsiriX MD 10.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MR-Compatible Pump</td>
			<td>Harvard apparatus, Holliston, MA, USA</td>
			<td>Harvard PHD 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MR-compatible stereotaxic frame</td>
			<td>KOPF</td>
			<td>1430M MRI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perifix Clamp Style Catheter Connector</td>
			<td>B-Braun, Bethlehem, PA, USA</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Screws</td>
			<td>Plastics 1</td>
			<td>0-80 x 1/8N</td>
			<td>Nylon screws</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titanium screws</td>
			<td>Crist Instrument Co., Inc.</td>
			<td>6-YCX-0312</td>
			<td>Self-tapping bone screws</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trephine</td>
			<td>GerMedUSA Inc,</td>
			<td>SKU:GV70-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>uPrinter SE 3D printer</td>
			<td>Stratasys, MN, USA</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin E Capsule</td>
			<td>Pure Encapsulations, LLC.</td>
			<td>DE1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wet sterile absorbable gelatin</td>
			<td>Pfizer Inc.</td>
			<td>AZL0009034201</td>
			<td>Gelfoam</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

convection enhanced delivery of optogenetic adeno-associated viral vector to the cortex of rhesus macaque under guidance of online mri images

No primata não-humano (NHP) optogenética, infectando grandes áreas corticais com vetores virais é muitas vezes uma tarefa difícil e demorada. Aqui, Nós demonstramos o uso de ressonância magnética (RM)-guiada por convecção reforçada de entrega (CED) de vetores virais optogenéticos em córtices primários somatosensorial (S1) e motor (M1) de macacos para obter uma expressão cortical eficiente e generalizada de canais iônicos sensíveis à luz. Os vetores virais adeno-associados (AAV) que codificam o opsina vermelho-deslocado C1V1 fundidos à proteína fluorescente amarela (EYFP) foram injetados no córtice de macacos do rhesus o Sr.-guiado CED. Três meses após a infusão, a imagem latente epifluorescente confirmou grandes regiões da expressão optogenética (> 130 milímetros2) em M1 e em S1 em dois macaques. Além disso, nós pudemos gravar respostas luz-evocadas confiáveis da electrofisiologia das áreas expressando usando matrizes micro-electrocorticographic. A análise histológica mais atrasada e a imunomarcação de encontro ao repórter revelaram a expressão optogenética difundida e densa em M1 e em S1 que correspondem à distribuição indicada pela imagem latente epifluorescente. Esta técnica permite-nos obter a expressão através das grandes áreas do córtice dentro de um período de tempo mais curto com dano mínimo comparado às técnicas tradicionais e pode ser uma aproximação óptima para a entrega viral optogenética em grandes animais tais como nhps. Esta aproximação demonstra o grande potencial para a manipulação do rede-nível de circuitos neural com célula-tipo especificidade em modelos animais evolutionarmente perto dos seres humanos.

Fornecimento aprimorado de convecção (CED) orientação de RM
A disseminação do vetor viral foi monitorada durante a infusão de CED a orientação de imagens de MR on-line (Figura 3a). Neste estudo, S1 e M1 de dois macacos foram direcionados (Figura 3B). Os volumes de distribuição tridimensional foram estimados em uma análise post-hoc das imagen...

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Convection Enhanced Delivery of Optogenetic Adeno-associated Viral Vector to the Cortex of Rhesus Macaque Under Guidance of Online MRI Images

Aqui, nós Demonstramos a ressonância magnética (Sr.)-a entrega aumentada da convecção guiada (CED) de vetores virais no córtice como uma aproximação eficiente e simplificada para conseguir a expressão optogenética através das grandes áreas corticais no cérebro do macaque.

A convecção aumentou a entrega do vetor viral adeno-associado Optogenetic ao córtice de Rhesus macaque a orientação de imagens em linha de MRI

In non-human primate (NHP) optogenetics, infecting large cortical areas with viral vectors is often a difficult and time-consuming task. Here, we ...

A convecção aprimorada da entrega, ou CED, de vetores virais optogenéticos em primatas não humanos permitirá que os pesquisadores manipulem a atividade neural em larga escala para entender computaçãos e comportamentos neurais complexos. Com CED podemos alcançar alta expressão optogenética em grandes regiões do cérebro primata com apenas algumas injeções em um curto espaço de tempo em comparação com os métodos tradicionais. A ressonância magnética ou implantação de câmara compatível com Mr é realizada utilizando-se a prática padrão em cirurgias de primatas não humanos, o procedimento é descrito detalhadamente no protocolo de texto e delineado brevemente neste vídeo.Após sedação animal, posicionamento e incisão inicial, conforme descrito no protocolo de texto, crie uma craniotomia circular para cobrir as trajetórias pré-planejadas para injeções usando uma trefina. Crie um recuo no centro da craniotomia planejada suficientemente profunda no crânio para ancorar a trefina usando o ponto de centro ajustável da trefina. Uma vez feito o centro, abaixe a trefina sobre o crânio e gire a trefina no sentido horário e anti-horário, aplicando pressão para baixo até que a tampa óssea possa ser removida com fórceps.Depois de levantar a dura como detalhado no protocolo de texto, corte a dura do centro até a borda da craniotomia e continue ao longo da borda com uma tesoura oftálmica fina. Monte a convecção cilíndrica feita sob medida de entrega de câmara compatível com MR ao crânio em cima da craniotomia para fornecer suporte à cânula durante a infusão de tal forma que a curvatura da flange da câmara se alinha bem com a curvatura do crânio. Fixar os implantes no crânio usando parafusos plásticos e acrílicos dentários ou alguns parafusos de titânio.Logo após implantar a câmara compatível com Mr e inserir a grade de injeção de cânula na câmara, encha a grade com soro fisiológico de 0,9% para visualizar os locais de injeção através de imagens anatômicas mr. Preencha também as cavidades da câmara com espuma de gel absorvível estéril úmida para manter a umidade do cérebro. Cubra a pele e o cilindro com uma cortina de incisão antimicrobiana estéril para manter a esterilidade dos cilindros durante o transporte e as infusões de MR.Coloque uma cápsula de vitamina E para marcar o topo da rede de injeção para identificação positiva. Enquanto o animal permanece entubado, retire o tubo endotraqueal do circuito de anestesia e recoloque-o em uma máquina de isoflurane compatível com MR portátil. Transporte o animal para o scanner de ressonância magnética.Adquira imagens T1 para calcular a distância do topo da grade de injeção e da superfície cortical. A cápsula de vitamina E é claramente visível em imagens T1 e deve ser usada como um marcador para o topo da grade de injeção. Adquira imagens T2 para determinar os guias de cânula ideal para cada local com base no local alvo da infusão.A grade da cânula é preenchida com soro fisiológico que é melhor visível em imagens T2. Usando o software de imagem MR, percorria os planos coronal e sagital para encontrar o local alvo da infusão. Depois de descongelar o vetor viral por algumas horas à temperatura ambiente, misture o vetor viral com o agente de contraste MR gadoteridol por pipeta ou mistura de vórtice.Carregue o vírus misto em tubos iv de alta pressão de 0,2 mililitro. Utilizando tubos IV de alta pressão, conecte uma longa linha de extensão a uma seringa de três mililitros compatível com MR e prime com soro fisiológico. Conecte a outra extremidade da tubulação de extensão longa ao tubo iv de 0,2 mililitro carregado com o vírus.Em seguida, conecte a cânula resistente ao refluxo com uma ponta pisada de um mililitro na extremidade distal deste conjunto com um conector de cateter estilo grampo. Por fim, coloque a seringa em uma bomba compatível com MR. Utilizando as imagens mr anatômicas da linha de base obtidas, selecione o local da grade de injeção de cânula e a profundidade de inserção necessária para chegar ao local de infusão de destino.Marque a profundidade de inserção na cânula usando fita estéril. Inicie a infusão a uma taxa de um microliter por minuto e valide visualmente o fluxo do fluido na linha de infusão observando a ejeção de fluido da ponta da cânula. Insira a cânula manualmente através da grade de injeção até a profundidade do alvo, mantendo o fluxo na linha de infusão, pois isso impedirá que o tecido penetrado entupida a cânula durante a inserção.Agora, adquira imagens rápidas de flash T1 para monitoramento on-line da infusão de vetor viral. Depois de infundir aproximadamente 10 microliters do vetor de tal forma que o vírus suficiente é infundido para detectar no scanner mr, obtenha imagens de MR para verificar a colocação correta da cânula, conforme evidente pela propagação observada do vírus. Se a profundidade da cânula inserida estiver incorreta, ajuste a profundidade de acordo ou lentamente remova a cânula e ressarca a inserção.Monitore a infusão através de orientação de imagens de MR on-line. Aumente a taxa de infusão para cinco microliters por minuto por um microliter por minuto a cada poucos minutos. É importante aumentar a taxa de infusão lentamente e não exceder cinco microliters por minuto, pois altas taxas de infusão podem causar danos teciduais.Depois de infundir aproximadamente 40 microliters do vetor viral, comece a reduzir a taxa de infusão em um microliter por minuto. Pare a infusão depois que aproximadamente 50 microliters são injetados. Deixe a cânula no lugar por dez minutos.Remova lentamente a cânula do cérebro e vá para o próximo local. Cubra o cilindro com uma cortina estéril no final das injeções antes do transporte animal e, em seguida, transporte o animal de volta para a sala de cirurgia. Análises histológicas em seções coronárias seriais revelam expressão optogenética em larga escala ao redor dos locais de infusão.Aqui está a imagem de MR coronal da linha de base e a disseminação do agente de contraste após a infusão para a mesma fatia coronal mr. Uma seção de tecido coronal é mostrada aproximadamente a mesma. A coloração de peroxidase reflete a expressão da proteína fluorescente amarela ou repórter da EYFP.Observa-se bom alinhamento entre a área de expressão EYFP, medida com epifluorescência superficial e com coloração histológica. Estes incluem a região de difusão vetorial estimada a partir de imagens mr. Pontos brancos indicam locais de injeção e toda a região negra representa a área exposta pela craniotomia.Aqui mostrada está uma imagem de baixa ampliação das seções coronais manchadas com anticorpo anti GFP mostrando o aspecto lateral medial da expressão YFP no córtex somatosensorial. A ponta da flecha preta indica a localização da faixa da cânula. O tecido adjacente é mostrado em maior ampliação para mostrar distribuição laminar das células positivas YFP.Regiões densamente povoadas de células positivas YFP estão localizadas predominantemente em camadas de dois a três e cinco a seis. O alargamento adicional revela células piramipúneis típicas nas camadas dois a três, camada cinco e camada seis. É importante deixar a cânula no lugar por 10 minutos após o fluxo parar.Isso garantirá que o vírus tenha percolado no tecido neural alvo circundante. CED é uma abordagem eficiente para alcançar níveis de expressão uniformemente altos em grandes regiões cerebrais em mamíferos. Tem o potencial de expandir nossa compreensão de circuitos neurais e conectividade.Após a transdução viral por CED, experimentos subsequentes de estimulação optogenética podem ser emparelhados com gravação elétrica e ensaios comportamentais para revelar a dinâmica complexa do circuito dentro do cérebro. Esta técnica foi anteriormente empregada por Yazdan-Shahmorad e colegas em 2018, na qual a modulação neural optogenética foi usada para induzir mudanças de conectividade amplas na rede no córtex motor sensorial.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors

Injeção intracraniana da adeno-associado vetores virais

Intracranial injection of viral vectors engineered to express a fluorescent protein is a versatile labeling technique for visualization of specific ...

Neurociência

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Transdução Viral seletiva de Adultos-nascido neurônios olfativos de crônica In vivo Estímulo Optogenetic

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells ...

Simultaneous Electroencephalography, Real-time Measurement of Lactate Concentration and Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity in the Rodent Cerebral Cortex

Eletroencefalografia simultânea, em tempo real de medição da concentração de lactato e Manipulação optogenética da atividade neuronal do córtex cerebral de roedores

Although the brain represents less than 5% of the body  by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body  at rest1. The ...

Optogenetic Functional MRI

Ressonância magnética funcional optogenética

The investigation of the functional connectivity of precise neural circuits across the entire intact brain can be achieved through optogenetic functional ...

Subpial Adeno-associated Virus 9 (AAV9) Vector Delivery in Adult Mice

Subpial Adeno-associated Virus 9 AAV9 Vector Delivery in Adult Mice

Vedação subjugada Adeno-associada do vírus 9 (AAV9) em ratos adultos

The successful development of a subpial adeno-associated virus 9 (AAV9) vector delivery technique in adult rats and pigs has been reported on previously. ...

Effects of Transcranial Alternating Current Stimulation on the Primary Motor Cortex by Online Combined Approach with Transcranial Magnetic Stimulation

Efeitos da estimulação da corrente alternada transcraniana no córtex Motor primário por on-line abordagem combinada com estimulação magnética transcraniana

Transcranial Alternating Current Stimulation (tACS) is a neuromodulatory technique able to act through sinusoidal electrical waveforms in a specific ...

Adeno-associated Virus-mediated Transgene Expression in Genetically Defined Neurons of the Spinal Cord

Expressão do Transgene de mediada por vírus adeno-associado em geneticamente definidos neurônios da medula espinhal

Selective manipulation of spinal neuronal subpopulations has mainly been achieved by two different methods: 1) Intersectional genetics, whereby double or ...

Automated Segmentation of Cortical Grey Matter from T1-Weighted MRI Images

Segmentação automática de matéria cinzenta Cortical de imagens de T1-Weighted MRI

Within neuroimaging research, a number of recent studies have discussed the impact of between-study differences in volumetric findings that are thought to ...

Direct Intrathecal Injection of Recombinant Adeno-associated Viruses in Adult Mice

Injeção intratecal de vírus Adeno-associado recombinantes em ratos adultos

Intrathecal (IT) injection of adeno-associated virus (AAV) has drawn considerable interest in CNS gene therapy by virtue of its safety, noninvasiveness, ...

Delivery of Antibodies into the Murine Brain via Convection-enhanced Delivery

Entrega de anticorpos para o cérebro murino via convecção-fornecimento aprimorado

Convection-enhanced delivery (CED) is a neurosurgical technique enabling effective perfusion of large brain volumes using a catheter system. Such an ...