Name: convection enhanced delivery of optogenetic adeno-associated viral vector to the cortex of rhesus macaque under guidance of online mri images
Uploaded: 2019-05-23T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Convection Enhanced Delivery of Optogenetic Adeno-associated Viral Vector to the Cortex of Rhesus Macaque Under Guidance of Online MRI Images at JoVE.com

Эта работа была поддержана Американской ассоциации сердца постдокторской стипендий (AY), обороны Расширенные исследовательские проекты агентства (DARPA) Реорганизация и пластичность для ускорения восстановления травматизма (REPAIR; N66001-10-C-2010), R01. NS073940, и UCSF неврологии Imaging центр. Эта работа была также поддержана Национальным институтом здоровья детей и человеческого потенциала Национальных институтов здравоохранения имени Эунис Кеннеди-Шивер по премии K12HD073945, Вашингтонским национальным исследовательским центром приматов (WaNPCR, P51 OD010425) и Центр нейротехнологий (CNT, Научно-исследовательский центр Инженерного исследовательского центра Национального научного фонда при Гранте EEC-1028725). Мы благодарим Камило Диас-Ботия, Тима Хэнсона, Виктора Харазия, Даниэля Сильверсмита, Карен Маклеод, Джулиану Милани и Блейкли Эндрюса за помощь в проведении экспериментов и Нан Тянь, Цзивэй Хэ, Питера Ледоховича, Мишеля Махарбиза и Тони Хауна за техническую помощь.

Все процедуры были одобрены Калифорнийским университетом, Сан-Франциско Институциональный комитет по уходу за животными и использованию (IACUC) и соответствуют Руководству по уходу и использованию лабораторных животных. Следующая процедура была проведена с использованием двух взрослы...

<ol>
	<li>Ruiz, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetics+through+windows+on+the+brain+in+the+nonhuman+primate.">Optogenetics through windows on the brain in the nonhuman primate.</a> Journal of Neurophysiology. 110 (6), 1455-1467 (2013).</li><li>Diester, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optogenetic+toolbox+designed+for+primates.">An optogenetic toolbox designed for primates.</a> Nature Neuroscience. 14 (3), 387-397 (2011).</li><li>Ohayon, S., Grimaldi, P., Schweers, N., Tsao, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saccade+modulation+by+optical+and+electrical+stimulation+in+the+macaque+frontal+eye+field.">Saccade modulation by optical and electrical stimulation in the macaque frontal eye field.</a> Journal of Neuroscience. 33 (42), 16684-16697 (2013).</li><li>Gerits, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetically+induced+behavioral+and+functional+network+changes+in+primates.">Optogenetically induced behavioral and functional network changes in primates.</a> Current Biology. 22 (18), 1722-1726 (2012).</li><li>Jazayeri, M., Lindbloom-Brown, Z., Horwitz, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saccadic+eye+movements+evoked+by+optogenetic+activation+of+primate+V1.">Saccadic eye movements evoked by optogenetic activation of primate V1.</a> Nature Neuroscience. 15 (10), 1368-1370 (2012).</li><li>Dai, J., Brooks, D. I., Sheinberg, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+and+electrical+microstimulation+systematically+bias+visuospatial+choice+in+primates.">Optogenetic and electrical microstimulation systematically bias visuospatial choice in primates.</a> Current Biology. 24 (1), 63-69 (2014).</li><li>Afraz, A., Boyden, E. S., DiCarlo, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+and+pharmacological+suppression+of+spatial+clusters+of+face+neurons+reveal+their+causal+role+in+face+gender+discrimination.">Optogenetic and pharmacological suppression of spatial clusters of face neurons reveal their causal role in face gender discrimination.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (21), 6730-6735 (2015).</li><li>Ledochowitsch, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+optical+control+and+simultaneous+electrical+readout+of+extended+cortical+circuits.">Strategies for optical control and simultaneous electrical readout of extended cortical circuits.</a> Journal of Neuroscience Methods. 256, 220-231 (2015).</li><li>Yazdan-Shahmorad, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Large-Scale+Interface+for+Optogenetic+Stimulation+and+Recording+in+Nonhuman+Primates.">A Large-Scale Interface for Optogenetic Stimulation and Recording in Nonhuman Primates.</a> Neuron. 89 (5), 927-939 (2016).</li><li>Ju, N., Jiang, R., Macknik, S. L., Martinez-Conde, S., Tang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+all-optical+interrogation+of+cortical+neurons+in+awake-behaving+nonhuman+primates.">Long-term all-optical interrogation of cortical neurons in awake-behaving nonhuman primates.</a> PLoS Biology. 16 (8), e2005839 (2018).</li><li>Bankiewicz, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convection-enhanced+delivery+of+AAV+vector+in+parkinsonian+monkeys;+in+vivo+detection+of+gene+expression+and+restoration+of+dopaminergic+function+using+pro-drug+approach.">Convection-enhanced delivery of AAV vector in parkinsonian monkeys; in vivo detection of gene expression and restoration of dopaminergic function using pro-drug approach.</a> Experimental Neurology. 164 (1), 2-14 (2000).</li><li>Kells, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+therapy-based+method+for+the+delivery+of+therapeutics+to+primate+cortex.">Efficient gene therapy-based method for the delivery of therapeutics to primate cortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (7), 2407-2411 (2009).</li><li>Krauze, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reflux-free+cannula+for+convection-enhanced+high-speed+delivery+of+therapeutic+agents.">Reflux-free cannula for convection-enhanced high-speed delivery of therapeutic agents.</a> Journal of Neurosurgery. 103 (5), 923-929 (2005).</li><li>Yazdan-Shahmorad, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+optogenetic+expression+in+macaque+cortex+obtained+with+MR-guided,+convection+enhanced+delivery+(CED)+of+AAV+vector+to+the+thalamus.">Widespread optogenetic expression in macaque cortex obtained with MR-guided, convection enhanced delivery (CED) of AAV vector to the thalamus.</a> Journal of Neuroscience Methods. 293, 347-358 (2018).</li><li>Yazdan-Shahmorad, A., Silversmith, D. B., Kharazia, V., Sabes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+cortical+reorganization+using+optogenetics+in+non-human+primates.">Targeted cortical reorganization using optogenetics in non-human primates.</a> Elife. 7, (2018).</li><li>Yazdan-Shahmorad, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demonstration+of+a+setup+for+chronic+optogenetic+stimulation+and+recording+across+cortical+areas+in+non-human+primates.">Demonstration of a setup for chronic optogenetic stimulation and recording across cortical areas in non-human primates.</a> SPIE BiOS. , (2015).</li><li>Lerchner, W., Corgiat, B., Der Minassian, V., Saunders, R. C., Richmond, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injection+parameters+and+virus+dependent+choice+of+promoters+to+improve+neuron+targeting+in+the+nonhuman+primate+brain.">Injection parameters and virus dependent choice of promoters to improve neuron targeting in the nonhuman primate brain.</a> Gene Therapy. 21 (3), 233-241 (2014).</li><li>Acker, L., Pino, E. N., Boyden, E. S., Desimone, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FEF+inactivation+with+improved+optogenetic+methods.">FEF inactivation with improved optogenetic methods.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (46), (2016).</li><li>Bobo, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convection-enhanced+delivery+of+macromolecules+in+the+brain.">Convection-enhanced delivery of macromolecules in the brain.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (6), 2076-2080 (1994).</li><li>Lieberman, D. M., Laske, D. W., Morrison, P. F., Bankiewicz, K. S., Oldfield, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convection-enhanced+distribution+of+large+molecules+in+gray+matter+during+interstitial+drug+infusion.">Convection-enhanced distribution of large molecules in gray matter during interstitial drug infusion.</a> Journal of Neurosurgery. 82 (6), 1021-1029 (1995).</li><li>Lonser, R. R., Gogate, N., Morrison, P. F., Wood, J. D., Oldfield, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+convective+delivery+of+macromolecules+to+the+spinal+cord.">Direct convective delivery of macromolecules to the spinal cord.</a> Journal of Neurosurgery. 89 (4), 616-622 (1998).</li><li>Szerlip, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+of+convection-enhanced+delivery+of+viruses+and+virus-sized+particles.">Real-time imaging of convection-enhanced delivery of viruses and virus-sized particles.</a> Journal of Neurosurgery. 107 (3), 560-567 (2007).</li></ol>

Здесь мы намечаем осуществимую и эффективную технику для достижения крупномасштабной оптогенетической экспрессии в первичной соматосенсорной и моторной коре NHP с помощью MR-управляемого CED. Использование MR-управляемого CED представляет значительные преимущества по сравнению с традици...

Оптогенетика является мощным инструментом, который позволяет манипулировать нервной деятельностью и изучение сетевых связей в головном мозге. Внедрение этой методики в нечеловеческих приматах (NHPs) имеет потенциал для улучшения нашего понимания крупномасштабных нейронных вычислений, познания и поведения в мозге приматов. Хотя оптогенетика была успешно реализована вNHPs в последние годы 1,2,3,4,5,6,7, вызов, который Исследователи сталкиваются достигает высокого уровня экспрессии через большие области мозга у этих животных. Здесь мы обеспечиваем эффективный и упрощенный подход для достижения высокого уровня оптогенетической экспрессии на больших участках коры головного мозга у макак. Этот метод имеет большой потенциал для улучшения текущих оптогенетических исследованийу этих животных в сочетании с современной записи 8,9 и оптической стимуляции10 технологий.
Конвекция расширенные поставки (CED) является установленным методом доставки фармакологических агентов и других крупных молекул, в том числе вирусных векторов, в центральную нервную систему11,12,13. В то время как обычные методы доставки включают в себя несколько небольших вливаний, распределенных по небольшим областям мозга, CED может достичь более широкого и даже распределения агентов с меньшим количеством вливаний. Давление управляемых объемных потока жидкости (конвекция) во время инфузии позволяет более широко и равномерно распределенной трансдукции целевой ткани при доставке вирусных векторов с CED. В недавних исследованиях мы продемонстрировали трансдукцию и последующее оптогенетическое выражение больших участков первичного двигателя (M1) и соматосенсорных (S1) кортиков9 и таламуса14 с помощью магнитно-резонансного (MR) управляемого CED.
Здесь мы планируем использование CED для достижения оптогенетической экспрессии в больших корковых областях только с несколькими инъекциями корковых.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 mL High Pressure IV Tubing</td>
			<td>Smiths Medical Inc., Dublin, OH, USA</td>
			<td>533640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.32 mm ID, 0.43 mm OD Silica Tubing</td>
			<td>Polymicro Technologies</td>
			<td>1068150027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 mm ID, 0.76 mm OD Silica Tubing</td>
			<td>Polymicro Technologies</td>
			<td>1068150625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV2.5-CamKII-C1V1-EYFP</td>
			<td>Penn Vector Core, University of Pennsylvania</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABS plastic</td>
			<td>Stratasys, MN, USA</td>
			<td>ABSplus-P430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimicrobial incise drape</td>
			<td>3M</td>
			<td>6650EZ</td>
			<td>Ioban Drape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental Acrylic</td>
			<td>Henry Schein, Inc.</td>
			<td>1013117</td>
			<td>Acrylic Bonding Agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elevators</td>
			<td>VWR International, LLC.</td>
			<td>10196-564</td>
			<td>Langenbeck Elevator, Wide Tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine suture</td>
			<td>McKesson Medical-Surgical Inc.</td>
			<td>1034505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gadoteridol</td>
			<td>Prohance, Bracco Diagnostics, Princeton, NJ</td>
			<td>0270-1111-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser for light stimulation</td>
			<td>Omicron-Laserage, Germany</td>
			<td>PhoxX 488-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MR compatible 3cc syringe</td>
			<td>Harvard apparatus, Holliston, MA, USA</td>
			<td>59-8377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MR Imaging Software</td>
			<td>Pixmeo</td>
			<td>OsiriX MD 10.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MR-Compatible Pump</td>
			<td>Harvard apparatus, Holliston, MA, USA</td>
			<td>Harvard PHD 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MR-compatible stereotaxic frame</td>
			<td>KOPF</td>
			<td>1430M MRI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perifix Clamp Style Catheter Connector</td>
			<td>B-Braun, Bethlehem, PA, USA</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Screws</td>
			<td>Plastics 1</td>
			<td>0-80 x 1/8N</td>
			<td>Nylon screws</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titanium screws</td>
			<td>Crist Instrument Co., Inc.</td>
			<td>6-YCX-0312</td>
			<td>Self-tapping bone screws</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trephine</td>
			<td>GerMedUSA Inc,</td>
			<td>SKU:GV70-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>uPrinter SE 3D printer</td>
			<td>Stratasys, MN, USA</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin E Capsule</td>
			<td>Pure Encapsulations, LLC.</td>
			<td>DE1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wet sterile absorbable gelatin</td>
			<td>Pfizer Inc.</td>
			<td>AZL0009034201</td>
			<td>Gelfoam</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

convection enhanced delivery of optogenetic adeno-associated viral vector to the cortex of rhesus macaque under guidance of online mri images

В оптогенетике нечеловеческих приматов (NHP) заражение крупных корковых участков вирусными переносчиками часто является трудной и трудоемкой задачей. Здесь мы демонстрируем использование магнитно-резонансной (MR) конвекции расширенной доставки (CED) оптогенетических вирусных векторов в первичные соматосенсорные (S1) и моторные (M1) кортики макаки для получения эффективного, широко распространенного коркового экспрессии светочувствительных ионных каналов. Адено-ассоциированные вирусные (AAV) векторы, кодирующие красно-сдвинутый опсин C1V1, слитый с желтым флуоресцентным белком (EYFP), были введены в кору резус-макак под MR-управляемым CED. Три месяца после вливания эпифлюоресцентная визуализация подтвердила большие областиоптогенетической экспрессии (130 мм 2) в М1 и С1 в двух макаках. Кроме того, мы смогли зафиксировать надежные световые реакции электрофизиологии из выражающихся областей с помощью микроэлектрокортикографических массивов. Позже гистологический анализ и иммуностоинирование в отношении репортера выявили широко распространенную и плотную оптогенетическую экспрессию в М1 и С1, соответствующую распределению, указанному эпифлуоресцентной визуализацией. Этот метод позволяет нам получить экспрессию на больших участках коры головного мозга в течение более короткого периода времени с минимальным ущербом по сравнению с традиционными методами и может быть оптимальным подходом для оптогенетических вирусных родов у крупных животных, таких как NHPs. Такой подход демонстрирует большой потенциал для сетевого уровня манипуляции нейронных цепей с клеточной типом специфичности в животных моделях эволюционно близко к человеку.

Конвекция Улучшенная доставка (CED) под руководством МРТ
Распространение вирусного вектора отслеживалось во время вливания CED под руководством онлайн-изображений MR(рисунок 3A). В этом исследовании, S1 и M1 из двух о...

Watch this Scientific Journal Video about Convection Enhanced Delivery of Optogenetic Adeno-associated Viral Vector to the Cortex of Rhesus Macaque Under Guidance of Online MRI Images at JoVE.com

Convection Enhanced Delivery of Optogenetic Adeno-associated Viral Vector to the Cortex of Rhesus Macaque Under Guidance of Online MRI Images

Здесь мы демонстрируем магнитно-резонансную (MR) конвекцию повышенной доставки (CED) вирусных векторов в кору как эффективный и упрощенный подход для достижения оптогенетической экспрессии в больших корковых областях в мозге макаки.

Конвекция Расширенная доставка оптогенетической адено-ассоциированной вирусного вектора в кору ресуса макаки под руководством онлайн МРТ изображений

In non-human primate (NHP) optogenetics, infecting large cortical areas with viral vectors is often a difficult and time-consuming task. Here, we ...

Конвекция расширенной доставки, или CED, оптогенетических вирусных векторов у не человеческих приматов позволит исследователям манипулировать нейронной активностью в больших масштабах, чтобы понять сложные нейронные вычисления и поведение. С CED мы можем достичь высокой оптогенетической экспрессии в больших областях мозга приматов только с несколькими инъекциями в короткий промежуток времени по сравнению с традиционными методами. Магнитно-резонансная или MR совместимая камерная имплантация выполняется с использованием стандартной практики в не человеческих операциях приматов, процедура подробно описана в текстовом протоколе и кратко изложена в этом видео.После лечения животных, позиционирования и первоначального разреза, как описано в текстовом протоколе, создайте круговую краниотомию, чтобы покрыть заранее спланированные траектории для инъекций с помощью трефина. Создайте отступ в центре запланированной краниотомии достаточно глубоко в черепе, чтобы закрепить трефин с помощью регулируемой точки центрирования трефина. После того, как центр был сделан, опустите трефин на череп и поверните трефин по часовой стрелке и против часовой стрелки при применении понижательного давления, пока костная крышка может быть удалена с типсами.Подняв дуру, как описано в текстовом протоколе, вырежьте дуру от центра до края краниотомии и продолжайте по краю с мелкими офтальмологическими ножницами. Гора цилиндрической обычай сделал конвекции расширенной доставки MR совместимой камеры к черепу на верхней части краниотомии, чтобы обеспечить поддержку канюли во время инфузии так, что кривизна камеры фланг хорошо выравнивается с кривизной черепа. Защитите имплантаты к черепу, используя либо пластиковые винты и зубной акрил или несколько титановых винтов.Вскоре после имплантации MR совместимой камеры и вставки сетки впрыска канюли в камеру, заполнить сетку с 0,9% солевого раствора для визуализации места инъекций через MR анатомических изображений. Также заполните камерные полости влажной стерильной абсорбируемой гелеобразной пеной для поддержания влажности мозга. Обложка кожи и цилиндра с стерильной антимикробной инкизировки для поддержания стерильности цилиндров во время транспортировки и М. инфузии.Поместите капсулу витамина Е, чтобы отметить верхнюю часть сетки инъекций для положительной идентификации. В то время как животное остается интубировано, отсоедините эндотрахеаную трубку от цепи анестезии и прикрепите ее к портативной совместимой с MR изофлюрановой машине. Транспорт животное к МРТ сканера.Приобретайте изображения T1 для расчета расстояния от верхней части сетки впрыска и поверхности кортика. Капсула витамина Е хорошо видна на снимках Т1 и должна использоваться в качестве маркера для верхней части сетки для инъекций. Приобрети изображения T2 для определения оптимальных руководств канюлей для каждого участка на основе целевого участка инфузии.Сетка канюли наполнена солевым раствором, который лучше всего виден на изображениях T2. Используя программное обеспечение для визуализации MR, прокрутите корональные и sagittal плоскости, чтобы найти целевое местоположение вливания. После оттаивания вирусного вектора в течение нескольких часов при комнатной температуре, смешать вирусный вектор с MR контрастным агентом gadoteridol по пипетке или вихревой смешивания.Загрузите смешанный вирус в 0,2 миллилитра высокого давления IV трубки. Используя трубки с высоким давлением IV, подключите длинную линию расширения к совместимому с MR трехми миллилитровому шприцу и премьеру с солевым раствором. Подключите другой конец длинной трубки расширения к трубе 0,2 миллилитра IV, загруженной вирусом.Затем приложите рефлюкс устойчивый канюла с одним миллилитров шагнул отзыв на дистальный конец этой сборки с разъемом катетера стиле зажима. Наконец установить шприц в MR совместимый насос. Используя полученные базовые анатомические изображения MR, выберите расположение сетки впрыска канюли и глубину вставки, необходимую для достижения целевого места вливания.Отметьте глубину вставки на канюле с помощью стерильной ленты. Начните вливание со скоростью одного микролитер в минуту и визуально проверить поток жидкости в линии инфузии, наблюдая выброс жидкости из кончика канюли. Вставьте канюлю вручную через сетку впрыска на целевую глубину, сохраняя при этом поток в линии инфузии, так как это предотвратит проникновение ткани от засорения канюли во время вставки.Теперь приобрети быстрые флэш T1-взвешенные изображения для онлайн-мониторинга вирусного векторного вливания. После вливая около 10 микролитров вектора таким образом, что достаточно вируса вливается для обнаружения в сканере MR, получить MR изображения для проверки правильного размещения канюли, как видно из наблюдаемого распространения вируса. Если глубина вставленной канюли неверна, отрегулируйте глубину соответствующим образом или медленно удалите канюлю и повторно извещайте вставку.Мониторинг вливания с помощью руководства онлайн MR изображений. Увеличьте скорость вливания до пяти микролитров в минуту на один микролитер в минуту шагов каждые несколько минут. Важно, чтобы увеличить скорость инфузии медленно и не превышать пять микролитров в минуту, как высокие показатели инфузии может привести к повреждению тканей.После вливания примерно 40 микролитров вирусного вектора, начните снижать скорость вливания на один микролитер в минуту шагов. Остановите настой после введения примерно 50 микролитров. Оставьте канюлю на месте на десять минут.Медленно удалить канюлю из мозга и перейти к следующему месту. Обложка цилиндра с стерильной драпировки в конце инъекций перед перевозкой животных, а затем транспортировать животное обратно в операционную. Гистологические анализы серийных корональных секций показывают крупномасштабное оптогенетическое выражение вокруг инфузионных участков.Здесь показан базовый корональная MR-изображение и распространение контрастного агента после инфузии для того же короналя MR. Раздел корональной ткани показан примерно из того же. Окрашивание пероксидазы отражает экспрессию желтого флуоресцентного белка или репортера EYFP.Хорошее выравнивание наблюдается между областью выражения EYFP, измеряется поверхностным эпифлюоресцентом и гистологическим окрашиванием. К ним относится область векторного распространения, оцененная на основе MR-изображений. Белые точки указывают на места инъекций, а вся черная область представляет область, подвергаемую краниотомии.Здесь показано низкое увеличение изображения корональных секций, окрашенных анти-антителами GFP, показывающими медиальный боковой аспект экспрессии YFP в соматосенсной коре. Черная наконечник стрелы указывает местоположение трассы канюли. Прилегающая ткань показана при большем увеличении, чтобы показать ламинарное распределение положительных клеток YFP.Плотно заселенные районы положительных ячеек YFP расположены преимущественно в слоях от двух до трех и от пяти до шести. Дальнейшее расширение показывает типичные пирамидальные клетки в слоях два-три, слой пять и слой шесть. Важно оставить канюлю на месте в течение 10 минут после того, как поток остановился.Это гарантирует, что вирус пронизыв в окружающих целевых нервной ткани. CED является эффективным подходом для достижения равномерно высокого уровня экспрессии в крупных областях мозга у млекопитающих. Он имеет потенциал, чтобы расширить наше понимание нейронных цепей и подключения.После вирусной трансдукции CED, последующие эксперименты оптогенетической стимуляции могут быть в паре с электрической записи и поведенческие эссе, чтобы выявить сложную динамику цепи в головном мозге. Этот метод ранее использовался Яздан-Шахморад и его коллегами в 2018 году, в котором оптогенетическая нейронная модуляция использовалась для индуцирования сетевых изменений широкой связи в сенсорной моторной коре.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors

Внутричерепное Инъекция адено-ассоциированные вирусные векторы

Intracranial injection of viral vectors engineered to express a fluorescent protein is a versatile labeling technique for visualization of specific ...

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Селективный Вирусный трансдукция взрослых происхождения обонятельных нейронов при хроническом В естественных условиях Optogenetic Стимуляция

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells ...

Simultaneous Electroencephalography, Real-time Measurement of Lactate Concentration and Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity in the Rodent Cerebral Cortex

Одновременное электроэнцефалография, в режиме реального времени измерения концентрации лактата и Optogenetic Манипуляция активности нейронов в коры головного мозга грызунов

Although the brain represents less than 5% of the body  by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body  at rest1. The ...

Optogenetic Functional MRI

Оптогенетика Функциональная МРТ

The investigation of the functional connectivity of precise neural circuits across the entire intact brain can be achieved through optogenetic functional ...

Subpial Adeno-associated Virus 9 (AAV9) Vector Delivery in Adult Mice

Subpial Adeno-associated Virus 9 AAV9 Vector Delivery in Adult Mice

Субпиальный адено-ассоциированный вирус 9 (AAV9) Доставка векселей для взрослых мышей

The successful development of a subpial adeno-associated virus 9 (AAV9) vector delivery technique in adult rats and pigs has been reported on previously. ...

Effects of Transcranial Alternating Current Stimulation on the Primary Motor Cortex by Online Combined Approach with Transcranial Magnetic Stimulation

Эффекты переменного тока транскраниальной стимуляции на первичной моторной коры, онлайн комбинированный подход с транскраниальная магнитная стимуляция

Transcranial Alternating Current Stimulation (tACS) is a neuromodulatory technique able to act through sinusoidal electrical waveforms in a specific ...

Adeno-associated Virus-mediated Transgene Expression in Genetically Defined Neurons of the Spinal Cord

Аденоассоциированный вирус опосредованной трансген выражение в генетически определенных нейронов спинного мозга

Selective manipulation of spinal neuronal subpopulations has mainly been achieved by two different methods: 1) Intersectional genetics, whereby double or ...

Automated Segmentation of Cortical Grey Matter from T1-Weighted MRI Images

Автоматизированный сегментация коркового серого вещества от T1-взвешенный МРТ изображения

Within neuroimaging research, a number of recent studies have discussed the impact of between-study differences in volumetric findings that are thought to ...

Direct Intrathecal Injection of Recombinant Adeno-associated Viruses in Adult Mice

Непосредственный впрыск Интратекальное рекомбинантного адено связанные вирусов у взрослых мышей

Intrathecal (IT) injection of adeno-associated virus (AAV) has drawn considerable interest in CNS gene therapy by virtue of its safety, noninvasiveness, ...

Delivery of Antibodies into the Murine Brain via Convection-enhanced Delivery

Доставка антител в мозг Мурин через конвекционно-увеличенную доставку

Convection-enhanced delivery (CED) is a neurosurgical technique enabling effective perfusion of large brain volumes using a catheter system. Such an ...