Name: convection enhanced delivery of optogenetic adeno-associated viral vector to the cortex of rhesus macaque under guidance of online mri images
Uploaded: 2019-05-23T13:00:00
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Este trabajo fue apoyado por la beca postdoctoral de la Asociación Americana del Corazón (AY), la Reorganización de la Agencia de Proyectos de Investigación Avanzada de Defensa (DARPA) y la Plasticidad para Acelerar la Recuperación de Lesiones (REPARACION; N66001-10-C-2010), R01. NS073940, y por el Centro de Imágenes de Neurociencia UCSF. Este trabajo también fue apoyado por el Instituto Nacional Eunice Kennedy Shiver de Salud Infantil y Desarrollo Humano de los Institutos Nacionales de Salud bajo el Número de Premio K12HD073945, el Centro Nacional de Investigación de Primates de Washington (WaNPCR, P51 OD010425), y el Centro de Neurotecnología (CNT, un Centro de Investigación de Ingeniería de la Fundación Nacional de Ciencias bajo la Beca CEE-1028725). Agradecemos a Camilo Díaz-Botia, Tim Hanson, Viktor Kharazia, Daniel Silversmith, Karen J. MacLeod, Juliana Milani y Blakely Andrews por su ayuda con los experimentos y Nan Tian, Jiwei He, Peter Ledochowitsch, Michel Maharbiz y Toni Haun por su ayuda técnica.

Todos los procedimientos han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC, por sus sitios) de la Universidad de California, San Francisco y cumplen con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. El siguiente procedimiento se realizó utilizando dos macacos machos adultos de 8 y 7 años de edad, con un peso de 17,5 kg y 16,5 kg (mono G y mono J), respectivamente.
NOTA: Utilice técnicas asépticas estándar para todos los procedimientos quirúr...

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	<li>Ruiz, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetics+through+windows+on+the+brain+in+the+nonhuman+primate.">Optogenetics through windows on the brain in the nonhuman primate.</a> Journal of Neurophysiology. 110 (6), 1455-1467 (2013).</li><li>Diester, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optogenetic+toolbox+designed+for+primates.">An optogenetic toolbox designed for primates.</a> Nature Neuroscience. 14 (3), 387-397 (2011).</li><li>Ohayon, S., Grimaldi, P., Schweers, N., Tsao, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saccade+modulation+by+optical+and+electrical+stimulation+in+the+macaque+frontal+eye+field.">Saccade modulation by optical and electrical stimulation in the macaque frontal eye field.</a> Journal of Neuroscience. 33 (42), 16684-16697 (2013).</li><li>Gerits, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetically+induced+behavioral+and+functional+network+changes+in+primates.">Optogenetically induced behavioral and functional network changes in primates.</a> Current Biology. 22 (18), 1722-1726 (2012).</li><li>Jazayeri, M., Lindbloom-Brown, Z., Horwitz, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saccadic+eye+movements+evoked+by+optogenetic+activation+of+primate+V1.">Saccadic eye movements evoked by optogenetic activation of primate V1.</a> Nature Neuroscience. 15 (10), 1368-1370 (2012).</li><li>Dai, J., Brooks, D. I., Sheinberg, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+and+electrical+microstimulation+systematically+bias+visuospatial+choice+in+primates.">Optogenetic and electrical microstimulation systematically bias visuospatial choice in primates.</a> Current Biology. 24 (1), 63-69 (2014).</li><li>Afraz, A., Boyden, E. S., DiCarlo, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+and+pharmacological+suppression+of+spatial+clusters+of+face+neurons+reveal+their+causal+role+in+face+gender+discrimination.">Optogenetic and pharmacological suppression of spatial clusters of face neurons reveal their causal role in face gender discrimination.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (21), 6730-6735 (2015).</li><li>Ledochowitsch, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+optical+control+and+simultaneous+electrical+readout+of+extended+cortical+circuits.">Strategies for optical control and simultaneous electrical readout of extended cortical circuits.</a> Journal of Neuroscience Methods. 256, 220-231 (2015).</li><li>Yazdan-Shahmorad, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Large-Scale+Interface+for+Optogenetic+Stimulation+and+Recording+in+Nonhuman+Primates.">A Large-Scale Interface for Optogenetic Stimulation and Recording in Nonhuman Primates.</a> Neuron. 89 (5), 927-939 (2016).</li><li>Ju, N., Jiang, R., Macknik, S. L., Martinez-Conde, S., Tang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+all-optical+interrogation+of+cortical+neurons+in+awake-behaving+nonhuman+primates.">Long-term all-optical interrogation of cortical neurons in awake-behaving nonhuman primates.</a> PLoS Biology. 16 (8), e2005839 (2018).</li><li>Bankiewicz, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convection-enhanced+delivery+of+AAV+vector+in+parkinsonian+monkeys;+in+vivo+detection+of+gene+expression+and+restoration+of+dopaminergic+function+using+pro-drug+approach.">Convection-enhanced delivery of AAV vector in parkinsonian monkeys; in vivo detection of gene expression and restoration of dopaminergic function using pro-drug approach.</a> Experimental Neurology. 164 (1), 2-14 (2000).</li><li>Kells, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+therapy-based+method+for+the+delivery+of+therapeutics+to+primate+cortex.">Efficient gene therapy-based method for the delivery of therapeutics to primate cortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (7), 2407-2411 (2009).</li><li>Krauze, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reflux-free+cannula+for+convection-enhanced+high-speed+delivery+of+therapeutic+agents.">Reflux-free cannula for convection-enhanced high-speed delivery of therapeutic agents.</a> Journal of Neurosurgery. 103 (5), 923-929 (2005).</li><li>Yazdan-Shahmorad, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+optogenetic+expression+in+macaque+cortex+obtained+with+MR-guided,+convection+enhanced+delivery+(CED)+of+AAV+vector+to+the+thalamus.">Widespread optogenetic expression in macaque cortex obtained with MR-guided, convection enhanced delivery (CED) of AAV vector to the thalamus.</a> Journal of Neuroscience Methods. 293, 347-358 (2018).</li><li>Yazdan-Shahmorad, A., Silversmith, D. B., Kharazia, V., Sabes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+cortical+reorganization+using+optogenetics+in+non-human+primates.">Targeted cortical reorganization using optogenetics in non-human primates.</a> Elife. 7, (2018).</li><li>Yazdan-Shahmorad, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demonstration+of+a+setup+for+chronic+optogenetic+stimulation+and+recording+across+cortical+areas+in+non-human+primates.">Demonstration of a setup for chronic optogenetic stimulation and recording across cortical areas in non-human primates.</a> SPIE BiOS. , (2015).</li><li>Lerchner, W., Corgiat, B., Der Minassian, V., Saunders, R. C., Richmond, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injection+parameters+and+virus+dependent+choice+of+promoters+to+improve+neuron+targeting+in+the+nonhuman+primate+brain.">Injection parameters and virus dependent choice of promoters to improve neuron targeting in the nonhuman primate brain.</a> Gene Therapy. 21 (3), 233-241 (2014).</li><li>Acker, L., Pino, E. N., Boyden, E. S., Desimone, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FEF+inactivation+with+improved+optogenetic+methods.">FEF inactivation with improved optogenetic methods.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (46), (2016).</li><li>Bobo, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convection-enhanced+delivery+of+macromolecules+in+the+brain.">Convection-enhanced delivery of macromolecules in the brain.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (6), 2076-2080 (1994).</li><li>Lieberman, D. M., Laske, D. W., Morrison, P. F., Bankiewicz, K. S., Oldfield, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convection-enhanced+distribution+of+large+molecules+in+gray+matter+during+interstitial+drug+infusion.">Convection-enhanced distribution of large molecules in gray matter during interstitial drug infusion.</a> Journal of Neurosurgery. 82 (6), 1021-1029 (1995).</li><li>Lonser, R. R., Gogate, N., Morrison, P. F., Wood, J. D., Oldfield, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+convective+delivery+of+macromolecules+to+the+spinal+cord.">Direct convective delivery of macromolecules to the spinal cord.</a> Journal of Neurosurgery. 89 (4), 616-622 (1998).</li><li>Szerlip, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+of+convection-enhanced+delivery+of+viruses+and+virus-sized+particles.">Real-time imaging of convection-enhanced delivery of viruses and virus-sized particles.</a> Journal of Neurosurgery. 107 (3), 560-567 (2007).</li></ol>

Aquí, delineamos una técnica factible y eficiente para lograr la expresión optogenética a gran escala en la corteza primaria somatosensorial y motora de NHP por CED guiada por RMN. El uso de CED guiado por RMN presenta ventajas significativas sobre los métodos tradicionales de infusión viral en el cerebro NHP. Una de estas ventajas es la capacidad de lograr la expresión en grandes áreas con menos infusiones necesarias. Por ejemplo, con métodos convencionales, múltiples inyecciones de 1-2 l de la expresión de r...

La optogenética es una potente herramienta que permite la manipulación de la actividad neuronal y el estudio de las conexiones de red en el cerebro. La implementación de esta técnica en primates no humanos (NCP) tiene el potencial de mejorar nuestra comprensión de la computación neuronal a gran escala, la cognición y el comportamiento en el cerebro de los primates. Aunque la optogenética se ha implementado con éxito en los NCP en los últimos años1,2,3,4,5,6,7, un reto que los investigadores se enfrentan está alcanzando altos niveles de expresión en grandes áreas cerebrales en estos animales. Aquí, estamos proporcionando un enfoque eficiente y simplificado para lograr altos niveles de expresión optogenética en grandes áreas de la corteza en macacos. Esta técnica tiene un gran potencial para mejorar los estudios optogenéticos actuales en estos animales en combinación con la grabación de última generación8,9 y la estimulación óptica10 tecnologías.
La entrega mejorada por convección (CED) es un método establecido de entrega de agentes farmacológicos y otras moléculas grandes, incluidos los vectores virales, al sistema nervioso central11,12,13. Mientras que los métodos de administración convencionales implican múltiples infusiones de bajo volumen distribuidas en pequeñas regiones del cerebro, CED puede lograr una distribución más amplia y uniforme de los agentes con menos perfusiones. El flujo de fluido a granel (convección) impulsado por presión durante la perfusión permite una transducción distribuida más ampliamente y uniformemente del tejido objetivo al administrar vectores virales con CED. En estudios recientes, demostramos la transducción y posterior expresión optogenética de grandes áreas de masilla primaria (M1) y somatosensorial (S1) cortices9 y thalamus14 utilizando Resonancia magnética (MR) guiada por CED.
Aquí, delineamos el uso de CED para lograr la expresión optogenética en grandes áreas corticales con sólo unas pocas inyecciones corticales.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 mL High Pressure IV Tubing</td>
			<td>Smiths Medical Inc., Dublin, OH, USA</td>
			<td>533640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.32 mm ID, 0.43 mm OD Silica Tubing</td>
			<td>Polymicro Technologies</td>
			<td>1068150027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 mm ID, 0.76 mm OD Silica Tubing</td>
			<td>Polymicro Technologies</td>
			<td>1068150625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV2.5-CamKII-C1V1-EYFP</td>
			<td>Penn Vector Core, University of Pennsylvania</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABS plastic</td>
			<td>Stratasys, MN, USA</td>
			<td>ABSplus-P430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimicrobial incise drape</td>
			<td>3M</td>
			<td>6650EZ</td>
			<td>Ioban Drape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental Acrylic</td>
			<td>Henry Schein, Inc.</td>
			<td>1013117</td>
			<td>Acrylic Bonding Agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elevators</td>
			<td>VWR International, LLC.</td>
			<td>10196-564</td>
			<td>Langenbeck Elevator, Wide Tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine suture</td>
			<td>McKesson Medical-Surgical Inc.</td>
			<td>1034505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gadoteridol</td>
			<td>Prohance, Bracco Diagnostics, Princeton, NJ</td>
			<td>0270-1111-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser for light stimulation</td>
			<td>Omicron-Laserage, Germany</td>
			<td>PhoxX 488-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MR compatible 3cc syringe</td>
			<td>Harvard apparatus, Holliston, MA, USA</td>
			<td>59-8377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MR Imaging Software</td>
			<td>Pixmeo</td>
			<td>OsiriX MD 10.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MR-Compatible Pump</td>
			<td>Harvard apparatus, Holliston, MA, USA</td>
			<td>Harvard PHD 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MR-compatible stereotaxic frame</td>
			<td>KOPF</td>
			<td>1430M MRI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perifix Clamp Style Catheter Connector</td>
			<td>B-Braun, Bethlehem, PA, USA</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Screws</td>
			<td>Plastics 1</td>
			<td>0-80 x 1/8N</td>
			<td>Nylon screws</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titanium screws</td>
			<td>Crist Instrument Co., Inc.</td>
			<td>6-YCX-0312</td>
			<td>Self-tapping bone screws</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trephine</td>
			<td>GerMedUSA Inc,</td>
			<td>SKU:GV70-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>uPrinter SE 3D printer</td>
			<td>Stratasys, MN, USA</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin E Capsule</td>
			<td>Pure Encapsulations, LLC.</td>
			<td>DE1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wet sterile absorbable gelatin</td>
			<td>Pfizer Inc.</td>
			<td>AZL0009034201</td>
			<td>Gelfoam</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

convection enhanced delivery of optogenetic adeno-associated viral vector to the cortex of rhesus macaque under guidance of online mri images

En la optogenética de primates no humanos (NHP), infectar grandes áreas corticales con vectores virales es a menudo una tarea difícil y que requiere mucho tiempo. Aquí, demostramos el uso de resonancia magnética (RM) convección guiada entrega mejorada (CED) de vectores virales optogenéticos en corticas primarias somatosensoriales (S1) y motor (M1) de macacos para obtener una expresión cortical eficiente y generalizada de canales ióniones sensibles a la luz. Los vectores virales asociados a adenos (AAV) que codifican las opsin C1V1 de desplazamiento rojo fusionadas a proteínafluorescentes amarillas (EYFP) se inyectaron en la corteza de macacos de resus bajo CED guiado por RMN. Tres meses después de la infusión, imágenes epifluorescentes confirmaron grandes regiones de expresión optogenética (>130 mm2) en M1 y S1 en dos macacos. Además, pudimos registrar respuestas electrofisiológicas fiables de las áreas de expresión mediante matrices microelectrocortigráficas. El análisis histológico posterior y la inmunomancha contra el reportero revelaron una expresión optogenética generalizada y densa en M1 y S1 correspondiente a la distribución indicada por imágenes epifluorescentes. Esta técnica nos permite obtener expresión en grandes áreas de la corteza en un período de tiempo más corto con un daño mínimo en comparación con las técnicas tradicionales y puede ser un enfoque óptimo para el parto viral optogenético en animales grandes como los NCP. Este enfoque demuestra un gran potencial para la manipulación a nivel de red de circuitos neuronales con especificidad de tipo celular en modelos animales evolutivamente cerca de los seres humanos.

Entrega mejorada por convección (CED) bajo la Guía de RMN
La propagación del vector viral se monitorizó durante la perfusión de CED bajo la guía de imágenes de RM en línea (Figura3A). En este estudio, S1 y M1 de dos monos fueron atacados (Figura3B). Los volúmenes de distribución tridimensional se estimaron en un análisis post-hoc de las imág...

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Convection Enhanced Delivery of Optogenetic Adeno-associated Viral Vector to the Cortex of Rhesus Macaque Under Guidance of Online MRI Images

Aquí, demostramos la convección guiada por resonancia magnética (RM) entrega mejorada (CED) de vectores virales en la corteza como un enfoque eficiente y simplificado para lograr la expresión optogenética a través de grandes áreas corticales en el cerebro macaco.

Convección Mejorada Entrega de Vector Viral Asociado a Adeno Optogenético a la Corteza de Rhesus Macaque Bajo Guía de Imágenes de RMN en Línea

In non-human primate (NHP) optogenetics, infecting large cortical areas with viral vectors is often a difficult and time-consuming task. Here, we ...

La convección mejorada entrega, o CED, de vectores virales optogenéticos en primates no humanos permitirá a los investigadores manipular la actividad neuronal a gran escala para entender los cálculos y comportamientos neuronales complejos. Con CED podemos lograr una alta expresión optogenética a través de grandes regiones del cerebro de primate con sólo unas pocas inyecciones en un corto período de tiempo en comparación con los métodos tradicionales. La resonancia magnética o la implantación de cámara compatible con RMN se realiza utilizando la práctica estándar en cirugías de primates no humanos, el procedimiento se describe en detalle en el protocolo de texto y se describe brevemente en este video.Después de la sedación animal, posicionamiento e incisión inicial como se describe en el protocolo de texto, crear una craneotomía circular para cubrir las trayectorias preplanificadas para las inyecciones utilizando una tretelina. Crea una sangría en el centro de la craneotomía planificada lo suficientemente profunda en el cráneo para anclar la tretina usando el punto de centrado ajustable de la tretina. Una vez que se ha hecho el centro, baje la trephine sobre el cráneo y gire la tretela en el sentido de las agujas del reloj y en el sentido contrario a las agujas del reloj mientras aplica presión hacia abajo hasta que la tapa ósea se pueda quitar con fórceps.Después de levantar la dura como se detalla en el protocolo de texto, cortar la dura desde el centro hasta el borde de la craneotomía y continuar a lo largo del borde con finas tijeras oftálmicas. Monte la cámara compatible con RM de entrega mejorada de convección hecha a medida cilíndrica al cráneo en la parte superior de la craneotomía para proporcionar soporte de cánula durante la perfusión de modo que la curvatura de la brida de la cámara se alinee bien con la curvatura del cráneo. Fije los implantes al cráneo usando tornillos de plástico y acrílico dental o unos pocos tornillos de titanio.Poco después de implantar la cámara compatible con RM e insertar la rejilla de inyección de cánula en la cámara, llene la rejilla con 0,9% de solución salina para visualizar las ubicaciones de inyección a través de imágenes anatómicas de RMN. También llene las cavidades de la cámara con espuma de gel estéril húmeda absorbible para mantener la humedad del cerebro. Cubra la piel y el cilindro con una cortina antimicrobiana estéril para mantener la esterilidad de los cilindros durante el transporte y las infusiones de RM.Coloque una cápsula de vitamina E para marcar la parte superior de la rejilla de inyección para una identificación positiva. Mientras el animal permanece intubado, desprende el tubo endotraqueal del circuito de anestesia y vuelva a conectarlo a una máquina de isoflurano compatible con RMN portátil. Transporte al animal al escáner de resonancia magnética.Adquiera imágenes T1 para calcular la distancia desde la parte superior de la rejilla de inyección y la superficie cortical. La cápsula de vitamina E es claramente visible en las imágenes T1 y debe utilizarse como marcador para la parte superior de la rejilla de inyección. Adquiera imágenes T2 para determinar las guías de cánula óptimas para cada sitio en función del sitio específico de la perfusión.La cuadrícula de cánulas está llena de solución salina que es mejor visible en las imágenes T2. Usando el software de imágenes por RMN, desplácese a través de los planos coronal y sagital para encontrar la ubicación objetivo de la perfusión. Después de descongelar el vector viral durante unas horas a temperatura ambiente, mezcle el vector viral con el agente de contraste MR gadoteridol por pipeta o mezcla de vórtice.Cargue el virus mezclado en tubo IV de alta presión de 0,2 mililitros. Con tubo IV de alta presión, conecte una línea de extensión larga a una jeringa de tres mililitros compatible con RMN y cebada con solución salina. Conecte el otro extremo del tubo de extensión larga al tubo de 0,2 mililitros IV cargado con el virus.A continuación, coloque la cánula resistente al reflujo con una punta escalonada de un mililitro en el extremo distal de este conjunto con un conector de catéter de estilo abrazadera. Por último, ajuste la jeringa en una bomba compatible con MR. Utilizando las imágenes de RM anatómicas de línea base obtenidas, seleccione la ubicación de la rejilla de inyección de cánula y la profundidad de inserción necesarias para llegar al lugar de perfusión objetivo.Marque la profundidad de inserción en la cánula con cinta estéril. Comience la perfusión a una velocidad de un microlitro por minuto y valide visualmente el flujo del líquido en la línea de perfusión observando la expulsión de líquido de la punta de la cánula. Inserte la cánula manualmente a través de la rejilla de inyección hasta la profundidad objetivo mientras mantiene el flujo en la línea de perfusión, ya que esto evitará que el tejido penetrado obstruya la cánula durante la inserción.Ahora adquiera imágenes ponderadas T1 flash rápido para la monitorización en línea de la infusión vectorial viral. Después de infundir aproximadamente 10 microlitros del vector de tal manera que se infunda suficiente virus para detectar en el escáner de RMN, obtenga imágenes de RMN para verificar la correcta colocación de la cánula como es evidente por la propagación observada del virus. Si la profundidad de la cánula insertada es incorrecta, ajuste la profundidad en consecuencia o retire lentamente la cánula y vuelva a intentar la inserción.Supervise la perfusión mediante la guía de imágenes de RM en línea. Aumente la velocidad de perfusión a cinco microlitros por minuto en un microlitro por minuto cada pocos minutos. Es importante aumentar lentamente la velocidad de perfusión y no exceder cinco microlitros por minuto, ya que las altas tasas de perfusión podrían causar daño tisular.Después de infundir aproximadamente 40 microlitros del vector viral, comience a reducir la velocidad de perfusión en un microlitro por minuto pasos. Detenga la perfusión después de inyectar aproximadamente 50 microlitros. Deje la cánula en su lugar durante diez minutos.Retire lentamente la cánula del cerebro y muévase a la siguiente ubicación. Cubra el cilindro con una cortina estéril al final de las inyecciones antes del transporte animal, luego transporte al animal de vuelta al quirófano. Los análisis histológicos en secciones coronales en serie revelan una expresión optogenética a gran escala alrededor de los sitios de perfusión.Aquí se muestra la imagen de RM coronal basal y la propagación del agente de contraste después de la perfusión para la misma rebanada coronal de RM. Una sección del tejido coronal se muestra aproximadamente de la misma. La tinción de peroxidasa refleja la expresión de la proteína fluorescente amarilla o del reportero de EYFP.Se observa una buena alineación entre el área de expresión EYFP, medida con epifluorescensa superficial y con tinción histológica. Estos incluyen la región de propagación vectorial estimada a partir de imágenes de RM. Los puntos blancos indican los sitios de inyección y toda la región negra representa el área expuesta por la craneotomía.Aquí se muestra una imagen de bajo aumento de las secciones coronales manchadas con anticuerpos anti GFP que muestran el aspecto lateral medial de la expresión de YFP en la corteza somatosensorial. La punta de flecha negra indica la ubicación de la pista de cánula. El tejido adyacente se muestra con un mayor aumento para mostrar la distribución laminar de las células positivas de YFP.Las regiones densamente pobladas de células positivas de YFP se encuentran predominantemente en las capas de dos a tres y cinco a seis. El agrandamiento adicional revela celdas piramidales típicas en las capas dos a tres, la capa cinco y la capa seis. Es importante dejar la cánula en su lugar durante 10 minutos después de que el flujo se haya detenido.Esto asegurará que el virus se haya percolado en el tejido neural objetivo circundante. CED es un enfoque eficiente para lograr niveles de expresión uniformemente altos en grandes regiones cerebrales en mamíferos. Tiene el potencial de ampliar nuestra comprensión de los circuitos neuronales y la conectividad.Después de la transducción viral por CED, los experimentos de estimulación optogenética posteriores se pueden emparejar con la grabación eléctrica y ensayos conductuales para revelar la dinámica de circuito complejo dentro del cerebro. Esta técnica ha sido empleada previamente por Yazdan-Shahmorad y sus colegas en 2018 en la que se utilizó la modulación neuronal optogenética para inducir cambios de conectividad en toda la red en la corteza motora sensorial.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors

Inyección intracraneal de adeno-asociado vectores virales

Intracranial injection of viral vectors engineered to express a fluorescent protein is a versatile labeling technique for visualization of specific ...

Investigación

Neurociencias

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Transducción viral selectiva de adultos nacidos en las neuronas olfativas de las enfermedades crónicas En vivo Estimulación Optogenetic

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells ...

Simultaneous Electroencephalography, Real-time Measurement of Lactate Concentration and Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity in the Rodent Cerebral Cortex

Electroencefalografía simultánea, en tiempo real Medición de la concentración de lactato y Manipulación optogenético de la actividad neuronal en la corteza cerebral de roedores

Although the brain represents less than 5% of the body  by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body  at rest1. The ...

Optogenetic Functional MRI

RM funcional Optogenética

The investigation of the functional connectivity of precise neural circuits across the entire intact brain can be achieved through optogenetic functional ...

Subpial Adeno-associated Virus 9 (AAV9) Vector Delivery in Adult Mice

Subpial Adeno-associated Virus 9 AAV9 Vector Delivery in Adult Mice

Adenovirus Subagonal Asociado 9 (AAV9) Vector Entrega en Ratones Adultos

The successful development of a subpial adeno-associated virus 9 (AAV9) vector delivery technique in adult rats and pigs has been reported on previously. ...

Effects of Transcranial Alternating Current Stimulation on the Primary Motor Cortex by Online Combined Approach with Transcranial Magnetic Stimulation

Efectos de la corriente alterna la estimulación transcraneal en la corteza de Motor primaria por Online enfoque combinado con la estimulación magnética transcraneal

Transcranial Alternating Current Stimulation (tACS) is a neuromodulatory technique able to act through sinusoidal electrical waveforms in a specific ...

Adeno-associated Virus-mediated Transgene Expression in Genetically Defined Neurons of the Spinal Cord

Expresión de transgenes de mediada por Virus adeno-asociado en neuronas genéticamente definidas de la médula espinal

Selective manipulation of spinal neuronal subpopulations has mainly been achieved by two different methods: 1) Intersectional genetics, whereby double or ...

Automated Segmentation of Cortical Grey Matter from T1-Weighted MRI Images

Segmentación automática de la materia gris Cortical de las imágenes de T1-Weighted MRI

Within neuroimaging research, a number of recent studies have discussed the impact of between-study differences in volumetric findings that are thought to ...

Direct Intrathecal Injection of Recombinant Adeno-associated Viruses in Adult Mice

Directa de la inyección intratecal de virus Adeno-asociado recombinantes en ratones adultos

Intrathecal (IT) injection of adeno-associated virus (AAV) has drawn considerable interest in CNS gene therapy by virtue of its safety, noninvasiveness, ...

Delivery of Antibodies into the Murine Brain via Convection-enhanced Delivery

Entrega de anticuerpos en el cerebro murino a través de la entrega mejorada por convección

Convection-enhanced delivery (CED) is a neurosurgical technique enabling effective perfusion of large brain volumes using a catheter system. Such an ...