Name: convection enhanced delivery of optogenetic adeno-associated viral vector to the cortex of rhesus macaque under guidance of online mri images
Uploaded: 2019-05-23T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Convection Enhanced Delivery of Optogenetic Adeno-associated Viral Vector to the Cortex of Rhesus Macaque Under Guidance of Online MRI Images at JoVE.com

Detta arbete stöddes av American Heart Association postdoktorala Fellowship (AY), Defense Advanced forskningsprojekt Agency (DARPA) omorganisation och plasticitet att påskynda skada återhämtning (reparation; N66001-10-C-2010), R01. NS073940, och av UCSF Neuroscience Imaging Center. Detta arbete stöddes också av Eunice Kennedy Shiver National Institute of Child Health & mänsklig utveckling av National Institutes of Health under tilldelning nummer K12HD073945, Washington National Primate Research Center (WaNPCR, P51 OD010425), och Centrum för neuroteknik (CNT, en National Science Foundation Engineering Research Center under Grant EEG-1028725). Vi tackar Camilo Diaz-Botia, Tim Hanson, Viktor Kharazia, Daniel silversmed, Karen J. MacLeod, Juliana Milani, och Blakely Andrews för deras hjälp med experiment och Nan Tian, Jiwei han, Peter Ledochowitsch, Michel Maharbiz, och Toni Haun för teknisk hjälp.

Alla procedurer har godkänts av University of California, San Francisco institutionella djuromsorg och användning kommittén (IACUC) och är förenliga med guiden för vård och användning av försöksdjur. Följande procedur utfördes med två vuxna manliga rhesusmakaker på 8 och 7 års ålder, som väger 17,5 kg och 16,5 kg (Monkey G och Monkey J), respektive.
Anmärkning: Använd standard aseptiska tekniker för alla kirurgiska ingrepp.
1. bildbehandling vid ba...

<ol>
	<li>Ruiz, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetics+through+windows+on+the+brain+in+the+nonhuman+primate.">Optogenetics through windows on the brain in the nonhuman primate.</a> Journal of Neurophysiology. 110 (6), 1455-1467 (2013).</li><li>Diester, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optogenetic+toolbox+designed+for+primates.">An optogenetic toolbox designed for primates.</a> Nature Neuroscience. 14 (3), 387-397 (2011).</li><li>Ohayon, S., Grimaldi, P., Schweers, N., Tsao, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saccade+modulation+by+optical+and+electrical+stimulation+in+the+macaque+frontal+eye+field.">Saccade modulation by optical and electrical stimulation in the macaque frontal eye field.</a> Journal of Neuroscience. 33 (42), 16684-16697 (2013).</li><li>Gerits, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetically+induced+behavioral+and+functional+network+changes+in+primates.">Optogenetically induced behavioral and functional network changes in primates.</a> Current Biology. 22 (18), 1722-1726 (2012).</li><li>Jazayeri, M., Lindbloom-Brown, Z., Horwitz, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saccadic+eye+movements+evoked+by+optogenetic+activation+of+primate+V1.">Saccadic eye movements evoked by optogenetic activation of primate V1.</a> Nature Neuroscience. 15 (10), 1368-1370 (2012).</li><li>Dai, J., Brooks, D. I., Sheinberg, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+and+electrical+microstimulation+systematically+bias+visuospatial+choice+in+primates.">Optogenetic and electrical microstimulation systematically bias visuospatial choice in primates.</a> Current Biology. 24 (1), 63-69 (2014).</li><li>Afraz, A., Boyden, E. S., DiCarlo, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+and+pharmacological+suppression+of+spatial+clusters+of+face+neurons+reveal+their+causal+role+in+face+gender+discrimination.">Optogenetic and pharmacological suppression of spatial clusters of face neurons reveal their causal role in face gender discrimination.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (21), 6730-6735 (2015).</li><li>Ledochowitsch, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+optical+control+and+simultaneous+electrical+readout+of+extended+cortical+circuits.">Strategies for optical control and simultaneous electrical readout of extended cortical circuits.</a> Journal of Neuroscience Methods. 256, 220-231 (2015).</li><li>Yazdan-Shahmorad, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Large-Scale+Interface+for+Optogenetic+Stimulation+and+Recording+in+Nonhuman+Primates.">A Large-Scale Interface for Optogenetic Stimulation and Recording in Nonhuman Primates.</a> Neuron. 89 (5), 927-939 (2016).</li><li>Ju, N., Jiang, R., Macknik, S. L., Martinez-Conde, S., Tang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+all-optical+interrogation+of+cortical+neurons+in+awake-behaving+nonhuman+primates.">Long-term all-optical interrogation of cortical neurons in awake-behaving nonhuman primates.</a> PLoS Biology. 16 (8), e2005839 (2018).</li><li>Bankiewicz, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convection-enhanced+delivery+of+AAV+vector+in+parkinsonian+monkeys;+in+vivo+detection+of+gene+expression+and+restoration+of+dopaminergic+function+using+pro-drug+approach.">Convection-enhanced delivery of AAV vector in parkinsonian monkeys; in vivo detection of gene expression and restoration of dopaminergic function using pro-drug approach.</a> Experimental Neurology. 164 (1), 2-14 (2000).</li><li>Kells, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+therapy-based+method+for+the+delivery+of+therapeutics+to+primate+cortex.">Efficient gene therapy-based method for the delivery of therapeutics to primate cortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (7), 2407-2411 (2009).</li><li>Krauze, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reflux-free+cannula+for+convection-enhanced+high-speed+delivery+of+therapeutic+agents.">Reflux-free cannula for convection-enhanced high-speed delivery of therapeutic agents.</a> Journal of Neurosurgery. 103 (5), 923-929 (2005).</li><li>Yazdan-Shahmorad, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+optogenetic+expression+in+macaque+cortex+obtained+with+MR-guided,+convection+enhanced+delivery+(CED)+of+AAV+vector+to+the+thalamus.">Widespread optogenetic expression in macaque cortex obtained with MR-guided, convection enhanced delivery (CED) of AAV vector to the thalamus.</a> Journal of Neuroscience Methods. 293, 347-358 (2018).</li><li>Yazdan-Shahmorad, A., Silversmith, D. B., Kharazia, V., Sabes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+cortical+reorganization+using+optogenetics+in+non-human+primates.">Targeted cortical reorganization using optogenetics in non-human primates.</a> Elife. 7, (2018).</li><li>Yazdan-Shahmorad, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demonstration+of+a+setup+for+chronic+optogenetic+stimulation+and+recording+across+cortical+areas+in+non-human+primates.">Demonstration of a setup for chronic optogenetic stimulation and recording across cortical areas in non-human primates.</a> SPIE BiOS. , (2015).</li><li>Lerchner, W., Corgiat, B., Der Minassian, V., Saunders, R. C., Richmond, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injection+parameters+and+virus+dependent+choice+of+promoters+to+improve+neuron+targeting+in+the+nonhuman+primate+brain.">Injection parameters and virus dependent choice of promoters to improve neuron targeting in the nonhuman primate brain.</a> Gene Therapy. 21 (3), 233-241 (2014).</li><li>Acker, L., Pino, E. N., Boyden, E. S., Desimone, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FEF+inactivation+with+improved+optogenetic+methods.">FEF inactivation with improved optogenetic methods.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (46), (2016).</li><li>Bobo, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convection-enhanced+delivery+of+macromolecules+in+the+brain.">Convection-enhanced delivery of macromolecules in the brain.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (6), 2076-2080 (1994).</li><li>Lieberman, D. M., Laske, D. W., Morrison, P. F., Bankiewicz, K. S., Oldfield, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convection-enhanced+distribution+of+large+molecules+in+gray+matter+during+interstitial+drug+infusion.">Convection-enhanced distribution of large molecules in gray matter during interstitial drug infusion.</a> Journal of Neurosurgery. 82 (6), 1021-1029 (1995).</li><li>Lonser, R. R., Gogate, N., Morrison, P. F., Wood, J. D., Oldfield, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+convective+delivery+of+macromolecules+to+the+spinal+cord.">Direct convective delivery of macromolecules to the spinal cord.</a> Journal of Neurosurgery. 89 (4), 616-622 (1998).</li><li>Szerlip, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+of+convection-enhanced+delivery+of+viruses+and+virus-sized+particles.">Real-time imaging of convection-enhanced delivery of viruses and virus-sized particles.</a> Journal of Neurosurgery. 107 (3), 560-567 (2007).</li></ol>

Här skisserar vi en genomförbar och effektiv teknik för att uppnå storskaliga optogenetiska uttryck i NHP primära somatosensoriska och motoriska cortex av MR-guidad CED. Användningen av MR-Guided CED presenterar betydande fördelar jämfört med traditionella metoder för viral infusion i NHP hjärnan. En sådan fördel är förmågan att uppnå uttryck över stora områden med färre nödvändiga infusioner. Till exempel, med konventionella metoder, multipla injektioner av 1-2 μl av vektor avkastning uttryck i en...

Optogenetics är ett kraftfullt verktyg som gör det möjligt för manipulation av neurala aktivitet och studiet av nätverksanslutningar i hjärnan. Implementera denna teknik i icke-mänskliga primater (NHPs) har potential att förbättra vår förståelse av storskaliga neurala beräkningar, kognition, och beteende i primater hjärnan. Även om optogenetik har genomförts framgångsrikt i NHPS under de senaste åren1,2,3,4,5,6,7, en utmaning som forskare ansikte uppnår höga uttrycks nivåer över stora hjärnområden hos dessa djur. Här ger vi en effektiv och förenklad metod för att uppnå höga halter av optogenetiska uttryck över stora delar av cortex i makaker. Denna teknik har stor potential att förbättra nuvarande optogenetiska studier hos dessa djur i kombination med State-of-the-art inspelning8,9 och optisk stimulering10 Technologies.
Konvektion förbättrad leverans (CED) är en etablerad metod för leverans av farmakologiska medel och andra stora molekyler, inklusive virala vektorer, till centralanervsystemet11,12,13. Medan konventionella leveransmetoder innebär flera låg volym infusioner fördelas över små regioner i hjärnan, CED kan uppnå bredare och jämnare agentdistribution med färre infusioner. Tryck driven bulk Fluid Flow (konvektion) under infusion möjliggör en mer utbredd och jämnt fördelad transduktion av målvävnaden vid leverans av virala vektorer med CED. I nyare studier, vi visade transduktion och efterföljande optogenetiska uttryck för stora områden av primär motor (M1) och somatosensorisk (S1) cortices9 och thalamus14 med hjälp av magnetisk resonans (Mr)-guidad CED.
Här, vi beskriver användningen av CED att uppnå optogenetiska uttryck över stora kortikala områden med endast ett fåtal kortikala injektioner.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 mL High Pressure IV Tubing</td>
			<td>Smiths Medical Inc., Dublin, OH, USA</td>
			<td>533640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.32 mm ID, 0.43 mm OD Silica Tubing</td>
			<td>Polymicro Technologies</td>
			<td>1068150027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 mm ID, 0.76 mm OD Silica Tubing</td>
			<td>Polymicro Technologies</td>
			<td>1068150625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV2.5-CamKII-C1V1-EYFP</td>
			<td>Penn Vector Core, University of Pennsylvania</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABS plastic</td>
			<td>Stratasys, MN, USA</td>
			<td>ABSplus-P430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimicrobial incise drape</td>
			<td>3M</td>
			<td>6650EZ</td>
			<td>Ioban Drape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental Acrylic</td>
			<td>Henry Schein, Inc.</td>
			<td>1013117</td>
			<td>Acrylic Bonding Agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elevators</td>
			<td>VWR International, LLC.</td>
			<td>10196-564</td>
			<td>Langenbeck Elevator, Wide Tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine suture</td>
			<td>McKesson Medical-Surgical Inc.</td>
			<td>1034505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gadoteridol</td>
			<td>Prohance, Bracco Diagnostics, Princeton, NJ</td>
			<td>0270-1111-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser for light stimulation</td>
			<td>Omicron-Laserage, Germany</td>
			<td>PhoxX 488-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MR compatible 3cc syringe</td>
			<td>Harvard apparatus, Holliston, MA, USA</td>
			<td>59-8377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MR Imaging Software</td>
			<td>Pixmeo</td>
			<td>OsiriX MD 10.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MR-Compatible Pump</td>
			<td>Harvard apparatus, Holliston, MA, USA</td>
			<td>Harvard PHD 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MR-compatible stereotaxic frame</td>
			<td>KOPF</td>
			<td>1430M MRI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perifix Clamp Style Catheter Connector</td>
			<td>B-Braun, Bethlehem, PA, USA</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Screws</td>
			<td>Plastics 1</td>
			<td>0-80 x 1/8N</td>
			<td>Nylon screws</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titanium screws</td>
			<td>Crist Instrument Co., Inc.</td>
			<td>6-YCX-0312</td>
			<td>Self-tapping bone screws</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trephine</td>
			<td>GerMedUSA Inc,</td>
			<td>SKU:GV70-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>uPrinter SE 3D printer</td>
			<td>Stratasys, MN, USA</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin E Capsule</td>
			<td>Pure Encapsulations, LLC.</td>
			<td>DE1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wet sterile absorbable gelatin</td>
			<td>Pfizer Inc.</td>
			<td>AZL0009034201</td>
			<td>Gelfoam</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

convection enhanced delivery of optogenetic adeno-associated viral vector to the cortex of rhesus macaque under guidance of online mri images

I icke-mänskliga primater (NHP) optogenetik, infekterar stora kortikala områden med virala vektorer är ofta en svår och tidskrävande uppgift. Här visar vi användningen av magnetisk resonans (MR)-guidad konvektion förbättrad leverans (CED) av optogenetiska virala vektorer i primär somatosensorisk (S1) och motor (M1) cortices av makaker för att få effektiva, utbredda kortikala uttryck av ljuskänsliga jonkanaler. Adeno-Associated viral (AAV) vektorer kodning den rödskiftade opsin C1V1 smält till gult fluorescerande protein (EYFP) injicerades i cortex av Rhesus makaker under MR-ledda CED. Tre månader efter infusion bekräftade epilys Imaging stora regioner av optogenetiskt uttryck (> 130 mm2) i M1 och S1 i två makaker. Dessutom kunde vi spela in tillförlitlig ljus-framkallade elektrofysiologi svar från att uttrycka områden med mikro-elektrokortikographic arrayer. Senare histologisk analys och immunofärgning mot reportern avslöjade omfattande och täta optogenetiska uttryck i M1 och S1 som motsvarar den fördelning som indikeras av epilys Imaging. Denna teknik gör det möjligt för oss att få uttryck över stora delar av cortex inom en kortare tid med minimal skada jämfört med de traditionella teknikerna och kan vara en optimal metod för optogenetisk viral leverans hos stora djur som NHPs. Denna metod visar stor potential för nätverk-nivå manipulation av neurala kretsar med cell-typ specificitet i djurmodeller evolutionärt nära människor.

Konvektion förbättrad leverans (CED) under MRI-vägledning
Spridningen av virus vektorn övervakades under CED-infusion under ledning av MR-bilder online (figur 3a). I denna studie var S1 och M1 av två apor riktade (figur 3b). De tredimensionella distributions volymerna beräknades i en post-hoc-analys av MR-bilder (figur 3c</str...

Watch this Scientific Journal Video about Convection Enhanced Delivery of Optogenetic Adeno-associated Viral Vector to the Cortex of Rhesus Macaque Under Guidance of Online MRI Images at JoVE.com

Convection Enhanced Delivery of Optogenetic Adeno-associated Viral Vector to the Cortex of Rhesus Macaque Under Guidance of Online MRI Images

Här demonstrerar vi magnetisk resonans (MR)-guidad konvektion förbättrad leverans (CED) av virala vektorer i cortex som en effektiv och förenklad metod för att uppnå optogenetiska uttryck över stora kortikala områden i makak hjärnan.

Konvektion förbättrad leverans av Optogenetiska Adeno-associerad viral vektor till cortex av Rhesus macaque under ledning av online MRI-bilder

In non-human primate (NHP) optogenetics, infecting large cortical areas with viral vectors is often a difficult and time-consuming task. Here, we ...

Konvektion förbättrad leverans, eller CED, av optogenetiska viral vektorer i icke mänskliga primater kommer att göra det möjligt för forskare att manipulera neural aktivitet i stor skala för att förstå komplexa neurala beräkningar och beteenden. Med CED kan vi uppnå högt optogenetiskt uttryck över stora regioner i primathjärnan med endast några injektioner på kort tid jämfört med traditionella metoder. Magnetisk resonans eller MR kompatibel kammare implantation utförs med hjälp av standardpraxis i icke mänskliga primater operationer, är förfarandet beskrivs i detalj i textprotokollet och beskrivs kortfattat i denna video.Efter djur sedering, positionering och inledande snitt som beskrivs i textprotokollet, skapa en cirkulär craniotomy att täcka de förplanerade trajektorer för injektioner med hjälp av en trefin. Skapa en indrag i mitten av den planerade kraniotomi tillräckligt djupt i skallen för att förankra trefin med hjälp av justerbar centrering punkt trefin. När mitten har gjorts, sänka trefin på skallen och rotera trefin medurs och moturs samtidigt som nedåt tryck tills benlocket kan tas bort med tänjningar.Efter att du lyft dura som beskrivs i textprotokollet, skär dura från centrum till kanten av craniotomy och fortsätt längs kanten med fina oftalmiska saxar. Montera den cylindriska skräddarsydda konvektionen förbättrad leverans MR kompatibel kammare till skallen ovanpå kraniotomi för att ge kanyl stöd under infusion så att krökning av kammaren flänsen anpassar sig väl med krökning av skallen. Säkra implantaten till skallen med antingen plastskruvar och dental akryl eller några titanskruvar.Strax efter implantering av MR-kompatibel kammare och sätta in kanyl injektion rutnätet i kammaren, fyll gallret med 0,9%koksaltlösning för visualisering av injektionsplatserna via MR anatomiska bilder. Fyll även kammaren håligheter med våtsteril absorberbar gel skum för att upprätthålla fukt i hjärnan. Täck huden och cylindern med en steril antimikrobiell incise-drapering för att bibehålla cylinders sterilitet under transport och MR-infusioner.Placera en vitamin E kapsel för att markera toppen av injektionsgallret för positiv identifiering. Medan djuret förblir intuberat, lossa endotrakeal röret från anestesi krets och återfästa den till en bärbar MR kompatibel isofluran maskin. Transportera djuret till MR-skannern.Förvärva T1 bilder för att beräkna avståndet från toppen av injektionsgallret och den kortikala ytan. E-vitaminkapseln syns tydligt i T1-bilder och ska användas som markör för toppen av injektionsgallret. Förvärva T2 bilder för att bestämma den optimala kanylguider för varje plats baserat på den riktade platsen för infusion.Kanylrutnätet är fyllt med saltlösning som syns bäst i T2-bilder. Med hjälp av MR imaging programvara, bläddra igenom koronal och sagittal plan för att hitta målet platsen för infusion. Efter upptining av viral vektorn i några timmar vid rumstemperatur, blanda viral vektor med MR kontrastmedlet gadoteridol genom pipett eller vortex blandning.Ladda det blandade viruset i 0,2 milliliter högtrycks-DROPPrör. Använd högtrycks-IV-slangar, anslut en lång förlängningsledning till en MR-kompatibel tre milliliterspruta och prima med koksaltlösning. Anslut den andra änden av den långa förlängningsslangen till 0,2 milliliter IV slangar lastade med viruset.Fäst sedan återflödesresistenta kanyl med en en milliliter stegspets till den distala änden av denna församling med en klämma stil kateterkontakt. Ställ slutligen in sprutan i en MR-kompatibel pump. Med hjälp av de erhållna originalplan för anatomiska MR-bilder väljer du den kanylinjektionsgallerplats och insättningsdjup som behövs för att nå målinfusionsstället.Märk in insättningsdjupet på kanylen med hjälp av steril tejp. Påbörja infusionen med en hastighet av en mikroliter per minut och validera vätskans flöde i infusionsledningen visuellt genom att observera utmatning av vätska från kanylspetsen. För in kanylen manuellt genom injektionsgallret till måldjupet samtidigt som flödet bibehålls i infusionsledningen eftersom detta förhindrar att den penetrerade vävnaden täpper till kanylen vid insättning.Nu förvärva snabba flash T1-viktade bilder för online-övervakning av viral vektor infusion. Efter infusing cirka 10 mikroliter av vektorn så att tillräckligt med virus är infunderas för att upptäcka i MR-skannern, få MR bilder för att kontrollera korrekt kanyl placering som framgår av den observerade spridningen av viruset. Om djupet på den insatta kanylen är felaktigt, justera djupet i enlighet med eller långsamt ta bort kanylen och återförsöka insatsen.Övervaka infusionen via vägledning av online MR-bilder. Öka infusionshastigheten till fem mikroliter per minut med en mikroliter per minut steg med några minuters mellanrum. Det är viktigt att öka infusionshastigheten långsamt och inte överskrida fem mikroliter per minut eftersom höga infusionshastigheter kan orsaka vävnadsskador.Efter infusing cirka 40 mikroliter av viral vektorn, börja minska infusionshastigheten med en microliter per minut steg. Avbryt infusionen efter att cirka 50 mikroliter injicerats. Låt kanylen vara på plats i tio minuter.Ta långsamt bort kanylen från hjärnan och flytta till nästa plats. Täck cylindern med en steril drapera i slutet av injektioner före djurtransport, sedan transportera djuret tillbaka till operationssalen. Histologiska analyser på seriella koronal sektioner avslöjar storskaliga optogenetiska uttryck runt infusionsställena.Visas här är baslinjen koronal MR bild och spridningen av kontrastmedlet efter infusionen för samma MR koronal skiva. En koronal vävnadssektion visas från ungefär samma. Peroxidasfärgning återspeglar uttryck för det gula fluorescerande proteinet eller EYFP-reportern.God anpassning observeras mellan området för EYFP uttryck, mätt med ytan epifluorescens och med histologiska färgning. Dessa inkluderar regionen av vektorspridning uppskattas från MR-bilder. Vita prickar indikerar injektionsställen och hela den svarta regionen representerar det område som exponeras av kraniotomi.Visas här är en låg förstoring bild av koronasektionerna färgas med anti GFP antikropp visar den mediala laterala aspekten av YFP uttryck i somatosensory cortex. Den svarta pilspetsen anger platsen för kanylspåret. Den intilliggande vävnaden visas vid större förstoring för att visa laminär fördelning av YFP-positiva cellerna.Tätbefolkade regioner i YFP positiva celler ligger huvudsakligen i lager två till tre och fem till sex. Ytterligare utvidgning avslöjar typiska pyramidala celler i lager två till tre, lager fem och lager sex. Det är viktigt att låta kanylen vara på plats i 10 minuter efter att flödet har stannat.Detta kommer att säkerställa att viruset har percolated i den omgivande riktade nervvävnad. CED är ett effektivt tillvägagångssätt för att uppnå jämnt höga uttrycksnivåer över stora hjärnregioner hos däggdjur. Det har potential att utöka vår förståelse av neurala kretsar och anslutningsmöjligheter.Efter viral transduktion av CED, efterföljande optogenetiska stimulering experiment kan paras ihop med elektrisk inspelning och beteendemässiga uppsatser att avslöja komplexa dynamiken krets i hjärnan. Denna teknik har tidigare använts av Yazdan-Shahmorad och kollegor under 2018 där optogenetisk neural modulering användes för att inducera nätverksomfattande anslutningsförändringar i den sensoriska motorcortexen.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors

Intrakraniell Injektion av Adeno-associerad virala vektorer

Intracranial injection of viral vectors engineered to express a fluorescent protein is a versatile labeling technique for visualization of specific ...

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Selektiv Viral nervsystemet av vuxna födda Olfactory Neuroner för kronisk In vivo Optogenetic Stimulering

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells ...

Simultaneous Electroencephalography, Real-time Measurement of Lactate Concentration and Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity in the Rodent Cerebral Cortex

Samtidig Elektroencefalografi, realtidsmätning av laktat koncentration och optogenetic Manipulering av neuronal aktivitet hos gnagare Cerebral Cortex

Although the brain represents less than 5% of the body  by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body  at rest1. The ...

Optogenetic Functional MRI

Optogenetic Funktionell MRI

The investigation of the functional connectivity of precise neural circuits across the entire intact brain can be achieved through optogenetic functional ...

Subpial Adeno-associated Virus 9 (AAV9) Vector Delivery in Adult Mice

Subpial Adeno-associated Virus 9 AAV9 Vector Delivery in Adult Mice

Subpierad adenoassocierad virus 9 (AAV9) vektorleverans i vuxna möss

The successful development of a subpial adeno-associated virus 9 (AAV9) vector delivery technique in adult rats and pigs has been reported on previously. ...

Effects of Transcranial Alternating Current Stimulation on the Primary Motor Cortex by Online Combined Approach with Transcranial Magnetic Stimulation

Effekterna av transkraniell växelström stimulering på primära motoriska Cortex av Online kombinerat tillvägagångssätt med transkraniell magnetisk stimulering

Transcranial Alternating Current Stimulation (tACS) is a neuromodulatory technique able to act through sinusoidal electrical waveforms in a specific ...

Adeno-associated Virus-mediated Transgene Expression in Genetically Defined Neurons of the Spinal Cord

Adeno-associerade Virus-medierad transgenens uttryck i genetiskt definierade nervceller i ryggmärgen

Selective manipulation of spinal neuronal subpopulations has mainly been achieved by two different methods: 1) Intersectional genetics, whereby double or ...

Automated Segmentation of Cortical Grey Matter from T1-Weighted MRI Images

Automatiserad segmentering av hjärnbarkens grå substans från T1-vägd MRI-bilder

Within neuroimaging research, a number of recent studies have discussed the impact of between-study differences in volumetric findings that are thought to ...

Direct Intrathecal Injection of Recombinant Adeno-associated Viruses in Adult Mice

Direkta intratekal injektion av rekombinant Adeno-associerade virus i vuxna möss

Intrathecal (IT) injection of adeno-associated virus (AAV) has drawn considerable interest in CNS gene therapy by virtue of its safety, noninvasiveness, ...

Delivery of Antibodies into the Murine Brain via Convection-enhanced Delivery

Leverans av antikroppar i murina hjärnan via konvektion-förbättrad leverans

Convection-enhanced delivery (CED) is a neurosurgical technique enabling effective perfusion of large brain volumes using a catheter system. Such an ...