Name: convection enhanced delivery of optogenetic adeno-associated viral vector to the cortex of rhesus macaque under guidance of online mri images
Uploaded: 2019-05-23T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Convection Enhanced Delivery of Optogenetic Adeno-associated Viral Vector to the Cortex of Rhesus Macaque Under Guidance of Online MRI Images at JoVE.com

Bu çalışma Amerikan Kalp Derneği doktora sonrası Bursu (AY), Savunma Gelişmiş Araştırma Projeleri Ajansı (DARPA) yeniden yapılanma ve plastisite yaralanma kurtarma hızlandırmak için (onarım; N66001-10-C-2010), R01. NS073940, ve UCSF Nörobilim görüntüleme Merkezi tarafından. Bu çalışma da Eunice Kennedy Shiver Ulusal Enstitüsü Çocuk Sağlığı & ınsan gelişimi Sağlık Ulusal Enstitüleri ödül numarası K12HD073945, Washington Ulusal Primate Araştırma Merkezi (WaNPCR, P51 OD010425) altında tarafından desteklenmektedir ve Neuroteknoloji Merkezi (CNT, Grant EEC altında bir Ulusal Bilim Vakfı Mühendisliği Araştırma Merkezi-1028725). Biz, deneme ve Nan Tian, Jiwei he, Peter Ledochowitsch, Michel Maharbiz ve Toni haun teknik yardım için onların yardım için Camilo Diaz-Botia, Tim Hanson, Viktor Kharazia, Daniel Silversmith, Karen J. MacLeod, Juliana Milani ve Blakely Andrews teşekkür ederiz.

Tüm prosedürler Kaliforniya Üniversitesi, San Francisco kurumsal hayvan bakımı ve kullanım Komitesi (ıABUC) tarafından onaylanmıştır ve laboratuar hayvanlarının bakımı ve kullanımı kılavuzu ile uyumludur. Aşağıdaki prosedür, sırasıyla 17,5 kg ve 16,5 kg (maymun G ve maymun J) ağırlığında, 8 ve 7 yaş arası iki yetişkin erkek Rhesus Makaklar kullanılarak yapılmıştır.
Not: tüm cerrahi prosedürler için standart aseptik teknikler kullanın.
<p class="jove...

<ol>
	<li>Ruiz, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetics+through+windows+on+the+brain+in+the+nonhuman+primate.">Optogenetics through windows on the brain in the nonhuman primate.</a> Journal of Neurophysiology. 110 (6), 1455-1467 (2013).</li><li>Diester, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optogenetic+toolbox+designed+for+primates.">An optogenetic toolbox designed for primates.</a> Nature Neuroscience. 14 (3), 387-397 (2011).</li><li>Ohayon, S., Grimaldi, P., Schweers, N., Tsao, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saccade+modulation+by+optical+and+electrical+stimulation+in+the+macaque+frontal+eye+field.">Saccade modulation by optical and electrical stimulation in the macaque frontal eye field.</a> Journal of Neuroscience. 33 (42), 16684-16697 (2013).</li><li>Gerits, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetically+induced+behavioral+and+functional+network+changes+in+primates.">Optogenetically induced behavioral and functional network changes in primates.</a> Current Biology. 22 (18), 1722-1726 (2012).</li><li>Jazayeri, M., Lindbloom-Brown, Z., Horwitz, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saccadic+eye+movements+evoked+by+optogenetic+activation+of+primate+V1.">Saccadic eye movements evoked by optogenetic activation of primate V1.</a> Nature Neuroscience. 15 (10), 1368-1370 (2012).</li><li>Dai, J., Brooks, D. I., Sheinberg, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+and+electrical+microstimulation+systematically+bias+visuospatial+choice+in+primates.">Optogenetic and electrical microstimulation systematically bias visuospatial choice in primates.</a> Current Biology. 24 (1), 63-69 (2014).</li><li>Afraz, A., Boyden, E. S., DiCarlo, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+and+pharmacological+suppression+of+spatial+clusters+of+face+neurons+reveal+their+causal+role+in+face+gender+discrimination.">Optogenetic and pharmacological suppression of spatial clusters of face neurons reveal their causal role in face gender discrimination.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (21), 6730-6735 (2015).</li><li>Ledochowitsch, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+optical+control+and+simultaneous+electrical+readout+of+extended+cortical+circuits.">Strategies for optical control and simultaneous electrical readout of extended cortical circuits.</a> Journal of Neuroscience Methods. 256, 220-231 (2015).</li><li>Yazdan-Shahmorad, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Large-Scale+Interface+for+Optogenetic+Stimulation+and+Recording+in+Nonhuman+Primates.">A Large-Scale Interface for Optogenetic Stimulation and Recording in Nonhuman Primates.</a> Neuron. 89 (5), 927-939 (2016).</li><li>Ju, N., Jiang, R., Macknik, S. L., Martinez-Conde, S., Tang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+all-optical+interrogation+of+cortical+neurons+in+awake-behaving+nonhuman+primates.">Long-term all-optical interrogation of cortical neurons in awake-behaving nonhuman primates.</a> PLoS Biology. 16 (8), e2005839 (2018).</li><li>Bankiewicz, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convection-enhanced+delivery+of+AAV+vector+in+parkinsonian+monkeys;+in+vivo+detection+of+gene+expression+and+restoration+of+dopaminergic+function+using+pro-drug+approach.">Convection-enhanced delivery of AAV vector in parkinsonian monkeys; in vivo detection of gene expression and restoration of dopaminergic function using pro-drug approach.</a> Experimental Neurology. 164 (1), 2-14 (2000).</li><li>Kells, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+therapy-based+method+for+the+delivery+of+therapeutics+to+primate+cortex.">Efficient gene therapy-based method for the delivery of therapeutics to primate cortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (7), 2407-2411 (2009).</li><li>Krauze, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reflux-free+cannula+for+convection-enhanced+high-speed+delivery+of+therapeutic+agents.">Reflux-free cannula for convection-enhanced high-speed delivery of therapeutic agents.</a> Journal of Neurosurgery. 103 (5), 923-929 (2005).</li><li>Yazdan-Shahmorad, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+optogenetic+expression+in+macaque+cortex+obtained+with+MR-guided,+convection+enhanced+delivery+(CED)+of+AAV+vector+to+the+thalamus.">Widespread optogenetic expression in macaque cortex obtained with MR-guided, convection enhanced delivery (CED) of AAV vector to the thalamus.</a> Journal of Neuroscience Methods. 293, 347-358 (2018).</li><li>Yazdan-Shahmorad, A., Silversmith, D. B., Kharazia, V., Sabes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+cortical+reorganization+using+optogenetics+in+non-human+primates.">Targeted cortical reorganization using optogenetics in non-human primates.</a> Elife. 7, (2018).</li><li>Yazdan-Shahmorad, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demonstration+of+a+setup+for+chronic+optogenetic+stimulation+and+recording+across+cortical+areas+in+non-human+primates.">Demonstration of a setup for chronic optogenetic stimulation and recording across cortical areas in non-human primates.</a> SPIE BiOS. , (2015).</li><li>Lerchner, W., Corgiat, B., Der Minassian, V., Saunders, R. C., Richmond, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injection+parameters+and+virus+dependent+choice+of+promoters+to+improve+neuron+targeting+in+the+nonhuman+primate+brain.">Injection parameters and virus dependent choice of promoters to improve neuron targeting in the nonhuman primate brain.</a> Gene Therapy. 21 (3), 233-241 (2014).</li><li>Acker, L., Pino, E. N., Boyden, E. S., Desimone, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FEF+inactivation+with+improved+optogenetic+methods.">FEF inactivation with improved optogenetic methods.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (46), (2016).</li><li>Bobo, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convection-enhanced+delivery+of+macromolecules+in+the+brain.">Convection-enhanced delivery of macromolecules in the brain.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (6), 2076-2080 (1994).</li><li>Lieberman, D. M., Laske, D. W., Morrison, P. F., Bankiewicz, K. S., Oldfield, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convection-enhanced+distribution+of+large+molecules+in+gray+matter+during+interstitial+drug+infusion.">Convection-enhanced distribution of large molecules in gray matter during interstitial drug infusion.</a> Journal of Neurosurgery. 82 (6), 1021-1029 (1995).</li><li>Lonser, R. R., Gogate, N., Morrison, P. F., Wood, J. D., Oldfield, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+convective+delivery+of+macromolecules+to+the+spinal+cord.">Direct convective delivery of macromolecules to the spinal cord.</a> Journal of Neurosurgery. 89 (4), 616-622 (1998).</li><li>Szerlip, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+of+convection-enhanced+delivery+of+viruses+and+virus-sized+particles.">Real-time imaging of convection-enhanced delivery of viruses and virus-sized particles.</a> Journal of Neurosurgery. 107 (3), 560-567 (2007).</li></ol>

Burada, Bay güdümlü CED tarafından NHP primer somatoduyusal ve motor korteks büyük ölçekli optogenetik ifade elde etmek için uygulanabilir ve verimli bir tekniği özetlemektedir. MR-güdümlü CED kullanımı NHP beynin geleneksel viral infüzyon yöntemleri üzerinde önemli avantajlar sunar. Böyle bir avantaj, daha az gerekli infüzyon ile büyük alanlarda ifade elde etme yeteneğidir. Örneğin, geleneksel yöntemlerle, 2-3 mm çap bölge1,2,<...

Optogenetiği nöral aktivite manipülasyon ve beyindeki ağ bağlantılarının çalışması için izin veren güçlü bir araçtır. İnsan dışı primatlar (NHPs) Bu tekniğin uygulanması büyük ölçekli nöral hesaplama, biliş ve primat beynin davranış anlayışımızı geliştirmek için potansiyele sahiptir. Optogenetiği son yıllarda nhps 'de başarıyla uygulanmasına rağmen1,2,3,4,5,6,7, Araştırmacılar yüz bu hayvanların büyük beyin alanları arasında ifade yüksek düzeylerde elde etmektir. Burada, macakların korteksinin büyük alanlarında yüksek düzeyde optogenetik ifade elde etmek için verimli ve basitleştirilmiş bir yaklaşım sağlıyoruz. Bu tekniğin, bu hayvanların son teknoloji kayıt8,9 ve optik stimülasyon10 teknolojileri ile birlikte mevcut optogenetik çalışmalarını iyileştirmek için büyük bir potansiyeli vardır.
Konveksiyon gelişmiş teslimat (Ced) farmakolojik ajanlar ve diğer büyük moleküllerin, viral vektörler de dahil olmak üzere, merkezi sinir sistemi11,12,13için kurulan bir yöntemdir. Geleneksel Teslimat yöntemleri beyin küçük bölgeler arasında dağıtılan birden düşük hacimli infüzyon içerir ise, CED daha az infüzyon ile daha geniş ve daha bile Ajan dağıtımı elde edebilirsiniz. İnfüzyon sırasında basınç odaklı toplu sıvı akışı (Konveksiyon) CED ile viral vektörler teslim ederken hedef doku daha yaygın ve eşit şekilde dağıtılmış dönüştürücü sağlar. Son çalışmalar, biz temel motor (M1) ve somatoduyusal (S1) korteks9 ve talamus14 manyetik rezonans (Mr) destekli Ced kullanarak büyük alanların transksiyon ve sonraki optogenetik ifade göstermiştir.
Burada, sadece birkaç kortikal enjeksiyon ile büyük kortikal alanlarda optogenetik ifade elde etmek için CED kullanımını özetlemektedir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 mL High Pressure IV Tubing</td>
			<td>Smiths Medical Inc., Dublin, OH, USA</td>
			<td>533640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.32 mm ID, 0.43 mm OD Silica Tubing</td>
			<td>Polymicro Technologies</td>
			<td>1068150027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 mm ID, 0.76 mm OD Silica Tubing</td>
			<td>Polymicro Technologies</td>
			<td>1068150625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV2.5-CamKII-C1V1-EYFP</td>
			<td>Penn Vector Core, University of Pennsylvania</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABS plastic</td>
			<td>Stratasys, MN, USA</td>
			<td>ABSplus-P430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimicrobial incise drape</td>
			<td>3M</td>
			<td>6650EZ</td>
			<td>Ioban Drape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental Acrylic</td>
			<td>Henry Schein, Inc.</td>
			<td>1013117</td>
			<td>Acrylic Bonding Agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elevators</td>
			<td>VWR International, LLC.</td>
			<td>10196-564</td>
			<td>Langenbeck Elevator, Wide Tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine suture</td>
			<td>McKesson Medical-Surgical Inc.</td>
			<td>1034505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gadoteridol</td>
			<td>Prohance, Bracco Diagnostics, Princeton, NJ</td>
			<td>0270-1111-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser for light stimulation</td>
			<td>Omicron-Laserage, Germany</td>
			<td>PhoxX 488-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MR compatible 3cc syringe</td>
			<td>Harvard apparatus, Holliston, MA, USA</td>
			<td>59-8377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MR Imaging Software</td>
			<td>Pixmeo</td>
			<td>OsiriX MD 10.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MR-Compatible Pump</td>
			<td>Harvard apparatus, Holliston, MA, USA</td>
			<td>Harvard PHD 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MR-compatible stereotaxic frame</td>
			<td>KOPF</td>
			<td>1430M MRI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perifix Clamp Style Catheter Connector</td>
			<td>B-Braun, Bethlehem, PA, USA</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Screws</td>
			<td>Plastics 1</td>
			<td>0-80 x 1/8N</td>
			<td>Nylon screws</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titanium screws</td>
			<td>Crist Instrument Co., Inc.</td>
			<td>6-YCX-0312</td>
			<td>Self-tapping bone screws</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trephine</td>
			<td>GerMedUSA Inc,</td>
			<td>SKU:GV70-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>uPrinter SE 3D printer</td>
			<td>Stratasys, MN, USA</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin E Capsule</td>
			<td>Pure Encapsulations, LLC.</td>
			<td>DE1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wet sterile absorbable gelatin</td>
			<td>Pfizer Inc.</td>
			<td>AZL0009034201</td>
			<td>Gelfoam</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

convection enhanced delivery of optogenetic adeno-associated viral vector to the cortex of rhesus macaque under guidance of online mri images

İnsan dışı primat (NHP) optogenetik olarak, viral vektörler ile büyük kortikal alanları enfekte genellikle zor ve zaman alıcı bir iştir. Burada, optogenetik viral vektörler için manyetik rezonans (MR) destekli konveksiyon gelişmiş teslimat (CED) ' nin primer somatoduyusal (S1) ve motor (M1) korüslerinin etkili, yaygın kortikal ifadesi elde etmek için kullanılması gösterilmektedir. ışık duyarlı iyon kanalları. Adeno-ilişkili viral (AAV) vektörler, Sarı floresan protein (EYFP) için kırmızı-kaydırılmış opsin C1V1 erimiş kodlama Bay güdümlü Ced altında Rhesus Makaklar korteks içine enjekte edildi. Üç ay sonrası infüzyon, epifloresan görüntüleme iki Macaques M1 ve S1 optogenetik ifade (> 130 mm2) büyük bölgeler doğruladı. Ayrıca, mikro-electrocorticographic dizileri kullanarak ifade alanlarından güvenilir ışık uyarılmış Elektrofizyoloji yanıtlarını kayıt edebildik. Daha sonra histolojik analiz ve gazeteciye karşı immünostan, M1 ve S1 'de epifloresan görüntüleme ile gösterilen dağılıma karşılık gelen yaygın ve yoğun optogenetik ifade gösterdi. Bu teknik, geleneksel tekniklere kıyasla minimal hasar ile daha kısa bir süre içinde korteks büyük alanlarda ifade elde etmek için bize sağlar ve NHPs gibi büyük hayvanların optogenetik viral teslim için optimum bir yaklaşım olabilir. Bu yaklaşım, insan evrime yakın hayvan modellerinde hücre tipi özgüllüğü ile sinir devrelerinin ağ düzeyinde manipülasyon için büyük bir potansiyel göstermektedir.

MRG rehberlik altında konveksiyon gelişmiş teslimat (CED)
Viral vektörünün yayılmasını, CED infüzyon sırasında online MR görüntüleri (Şekil 3A) rehberlik altında izleniyor. Bu çalışmada iki maymun S1 ve M1 hedeflenmiştir (Şekil 3B). Üç boyutlu dağıtım hacimleri MR görüntüleri bir post-hoc analiz tahmin edildi (<strong class...

Watch this Scientific Journal Video about Convection Enhanced Delivery of Optogenetic Adeno-associated Viral Vector to the Cortex of Rhesus Macaque Under Guidance of Online MRI Images at JoVE.com

Convection Enhanced Delivery of Optogenetic Adeno-associated Viral Vector to the Cortex of Rhesus Macaque Under Guidance of Online MRI Images

Burada, biz manyetik rezonans göstermektedir (Mr)-güdümlü konveksiyon gelişmiş teslim (Ced) viral vektörler içinde korteks içine etkili ve basitleştirilmiş bir yaklaşım olarak makak beynin büyük kortikal alanlarda arasında optogenetik ifade elde etmek.

Online MRG görüntüleri rehberlik altında Rhesus Macaque korteks için optogenetik Adeno-ilişkili Viral vektör konveksiyon geliştirilmiş teslim

In non-human primate (NHP) optogenetics, infecting large cortical areas with viral vectors is often a difficult and time-consuming task. Here, we ...

Konveksiyon gelişmiş teslimat, ya da CED, insan olmayan primatlar optogenetik viral vektörler, araştırmacılar karmaşık nöral hesaplamalar ve davranışları anlamak için büyük bir ölçekte nöral aktivite işlemek için sağlayacaktır. CED ile primat beyninin büyük bölgelerinde geleneksel yöntemlere göre kısa sürede sadece birkaç enjeksiyon la yüksek optogenetik ekspresyon elde edebiliriz. Manyetik rezonans veya MR uyumlu oda implantasyonu insan olmayan primat ameliyatlarında standart uygulama kullanılarak gerçekleştirilir, prosedür metin protokolünde ayrıntılı olarak anlatılır ve bu videoda kısaca özetlenmiştir.Metin protokolünde açıklandığı gibi hayvan sedasyonu, konumlandırma ve ilk kesiden sonra, trephine kullanarak enjeksiyonlar için önceden planlanmış yörüngeleri kapsayacak şekilde dairesel bir kraniyotomi oluşturur. Trephine ayarlanabilir merkezleme noktası kullanarak trephine çapa kafatası yeterince derin planlanan kraniyotomi merkezinde bir girintin oluşturun. Merkez yapıldıktan sonra, trephine'i kafatasının üzerine indirin ve kemik kapağı forceps ile çıkarılAna kadar aşağı doğru basınç uygularken trephine'i saat yönünde ve saat yönünün tersine döndürün.Metin protokolünde ayrıntılı olarak dura kaldırdıktan sonra, kraniyotomi kenarına merkezinden dura kesti ve ince oftalmik makas ile kenar boyunca devam edin. Konveksiyon özel yapılan konveksiyon gelişmiş teslimat MR uyumlu oda kraniotomi üstüne kafatası için bu tür oda flanş eğriliği kafatası eğriliği ile iyi hizalar infüzyon sırasında kanül desteği sağlamak için. İmplantları plastik vidalar ve diş akrilik veya birkaç titanyum vida kullanarak kafatasına sabitleyin.MR uyumlu haznesini yerleştirdikten ve kanül enjeksiyon ızgarasını odaya yerleştirdikten kısa bir süre sonra, MR anatomik görüntüler aracılığıyla enjeksiyon yerlerini görselleştirmek için ızgarayı %0,9 tuzlu suyla doldurun. Ayrıca beynin nemini korumak için ıslak steril emilebilir jel köpük ile oda boşlukları doldurun. Taşıma ve MR infüzyonu sırasında silindirlerin sterilliğini korumak için cildi ve silindiri steril bir antimikrobiyal eğim perdeile kaplayın.Pozitif tanımlama için enjeksiyon ızgarasının üst ünü işaretlemek için Bir E vitamini kapsülü yerleştirin. Hayvan entübe kalırken, anestezi devresinden endotrakeal tüp ayırmak ve taşınabilir bir MR uyumlu isoflurane makineye yeniden takın. Hayvanı MR Tarayıcısına götürün.Enjeksiyon ızgarasının üst kısmından ve kortikal yüzeyden uzaklığı hesaplamak için T1 görüntüleri edinin. E vitamini kapsülaçıkça T1 görüntülerde görülebilir ve enjeksiyon ızgara üst için bir belirteç olarak kullanılmalıdır. Hedeflenen infüzyon bölgesine göre her site için en uygun kanül kılavuzlarını belirlemek için T2 görüntüleri edinin.Kanül ızgarası, T2 görüntülerinde en iyi görünen tuzlu suyla doldurulur. MR görüntüleme yazılımını kullanarak, infüzyonun hedef konumunu bulmak için koronal ve sagital düzlemlerde ilerleyin. Oda sıcaklığında birkaç saat viral vektör eritme sonra, pipet veya girdap karıştırma ile MR kontrast ajan gadoteridol ile viral vektör karıştırın.Karışık virüsü 0.2 mililitreyüksek basınçlı IV tüpe yükleyin. Yüksek basınçlı IV tüp kullanarak, uzun bir uzatma hattını MR uyumlu üç mililitreşile şırınga ve salin ile asal olarak bağlayın. Uzun uzatma borularının diğer ucunu virüs yüklü 0.2 mililitrelik IV boruya bağlayın.Daha sonra bir mililitre adımlı ucu ile reflüye dayanıklı kanül bir kelepçe tarzı kateter konektörü ile bu montaj distal ucuna takın. Son olarak şırıngayı MR uyumlu bir pompaya ayarlayın. Elde edilen temel anatomik MR görüntülerini kullanarak, hedef infüzyon bölgesine ulaşmak için gerekli kanül enjeksiyon ızgara sıyrık konumunu ve ekleme derinliğini seçin.Steril bant kullanarak kanülün üzerine ekleme derinliğini işaretleyin. Dakikada bir mikrolitre hızında infüzyon alabilirsiniz ve kanül ucundan sıvı nın ejeksiyon gözlemleyerek infüzyon hattında sıvı akışını görsel olarak doğrulayın. Bu ekleme sırasında kanül tıkanmasını nüfuz doku engelleyecek gibi infüzyon hattında akış korurken hedef derinliğine enjeksiyon ızgara sıaracılığıyla kanül elle yerleştirin.Şimdi viral vektör infüzyon online izleme için hızlı flaş T1 ağırlıklı görüntüler elde. Vektörün yaklaşık 10 mikrolitresini, MR tarayıcısında tespit etmek için yeterli virüs aşılanmış şekilde aşıladıktan sonra, virüsün gözlenen yayılmasında belirgin olarak doğru kanül yerleşimini doğrulamak için MR görüntüleri elde edin. Eklenen kanülün derinliği yanlışsa, derinliği buna göre veya yavaşça kanülü çıkarın ve eklemeyi yeniden dene.Çevrimiçi MR görüntülerinin rehberliğinde infüzyonu izleyin. Dakikada bir mikrolitre dakikada bir mikrolitre ile dakikada beş mikrolitre infüzyon oranını artırın. Yüksek infüzyon oranları doku hasarına neden olabilir gibi yavaş yavaş infüzyon oranını artırmak ve dakikada beş mikrolitre aşmamak önemlidir.Viral vektörün yaklaşık 40 mikrolitresini aşıladıktan sonra, infüzyon hızını dakikada bir mikrolitre azaltmaya başlar. Yaklaşık 50 mikrolitre enjekte edildikten sonra infüzyonu durdurun. Kanülleri on dakika bekletin.Yavaşça beyinden kanül çıkarın ve bir sonraki konuma taşımak. Hayvan taşımadan önce enjeksiyonların sonunda silindiri steril bir perdeile kapatın, ardından hayvanı ameliyathaneye geri götürün. Seri koronal kesitler üzerinde yapılan histolojik analizler infüzyon bölgeleri etrafında büyük ölçekli optogenetik ekspresyon ortaya koymaktadır.Burada gösterilen temel koronal MR görüntü ve aynı MR koronal dilim için infüzyon sonra kontrast madde nin yayılması. Bir koronal doku bölümü yaklaşık aynı gösterilir. Peroksidaz boyama sarı floresan protein veya EYFP muhabiri nin ifadesini yansıtır.Yüzey epifluorescense ve histolojik boyama ile ölçülen EYFP ekspresyonu alanı arasında iyi bir uyum gözlenir. Bunlar, MR görüntülerinden tahmin edilen vektör yayılımı bölgesini içerir. Beyaz noktalar enjeksiyon bölgelerini gösterir ve tüm siyah bölge kraniyotominin maruz kaçtığı bölgeyi temsil eder.Burada gösterilen somatosensoriyel kortekste YFP ekspresyonunun medial lateral yönünü gösteren anti GFP antikor ile boyanmış koronal kesitlerin düşük büyütme görüntüsüdür. Siyah ok ucu kanül yolunun konumunu gösterir. YFP pozitif hücrelerin laminar dağılımını göstermek için bitişik doku daha büyük büyütme gösterilir.YFP pozitif hücrelerin yoğun nüfuslu bölgeleri ağırlıklı olarak katmanlar iki ile üç ve beş ile altı arasında yer almaktadır. Daha fazla genişleme katmanları iki ile üç, katman beş ve katman altı tipik piramidal hücreleri ortaya koymaktadır. Akış durduktan sonra kanülden 10 dakika boyunca yerinde bırakmak önemlidir.Bu, virüsün çevredeki hedefli sinir dokusuna nüfuz edilmesini sağlayacaktır. CED memelilerde büyük beyin bölgeleri arasında düzgün yüksek ifade düzeyleri elde etmek için etkili bir yaklaşımdır. Nöral devreler ve bağlantı anlayışımızı genişletme potansiyeline sahiptir.CED ile viral transdüksiyon sonra, sonraki optogenetik stimülasyon deneyleri beyin içinde karmaşık devre dinamikleri ortaya çıkarmak için elektrik kayıt ve davranışsal denemeler ile eşleştirilmiş olabilir. Bu teknik daha önce Yazdan-Shahmorad ve meslektaşları tarafından 2018 yılında, duyusal motor kortekste ağ geniş bağlantı değişikliklerini tetiklemek için optogenetik nöral modülasyon kullanılmıştır.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors

Adeno-ilişkili Viral Vektörler İntrakranial Enjeksiyon

Intracranial injection of viral vectors engineered to express a fluorescent protein is a versatile labeling technique for visualization of specific ...

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Kronik Yetişkin doğmuş Koku Nöronlar Seçici Viral İletimi In vivo Optogenetic Uyarım

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells ...

Simultaneous Electroencephalography, Real-time Measurement of Lactate Concentration and Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity in the Rodent Cerebral Cortex

Eşzamanlı Elektroensefalografi, Kemirgen Serebral Korteks Laktat Konsantrasyonu ve Nöronal Faaliyet Optogenetic Manipülasyon Gerçek zamanlı ölçüm

Although the brain represents less than 5% of the body  by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body  at rest1. The ...

Optogenetic Functional MRI

Optogenetic Fonksiyonel MRI

The investigation of the functional connectivity of precise neural circuits across the entire intact brain can be achieved through optogenetic functional ...

Subpial Adeno-associated Virus 9 (AAV9) Vector Delivery in Adult Mice

Subpial Adeno-associated Virus 9 AAV9 Vector Delivery in Adult Mice

Yetişkin Farelerde Subpial Adeno-ilişkili Virüs 9 (AAV9) Vektör Teslimatı

The successful development of a subpial adeno-associated virus 9 (AAV9) vector delivery technique in adult rats and pigs has been reported on previously. ...

Effects of Transcranial Alternating Current Stimulation on the Primary Motor Cortex by Online Combined Approach with Transcranial Magnetic Stimulation

Transkraniyal manyetik stimülasyon ile transkranyal alternatif akım stimülasyon Online kombine yaklaşım tarafından birincil Motor korteks üzerinde etkileri

Transcranial Alternating Current Stimulation (tACS) is a neuromodulatory technique able to act through sinusoidal electrical waveforms in a specific ...

Adeno-associated Virus-mediated Transgene Expression in Genetically Defined Neurons of the Spinal Cord

Omurilik genetik olarak tanımlanmış nöronlar Adeno ilişkili virüs-aracılı Transgene ifade

Selective manipulation of spinal neuronal subpopulations has mainly been achieved by two different methods: 1) Intersectional genetics, whereby double or ...

Automated Segmentation of Cortical Grey Matter from T1-Weighted MRI Images

Kortikal gri cevherde T1 ağırlıklı MRG görüntülerden otomatik bölümleme

Within neuroimaging research, a number of recent studies have discussed the impact of between-study differences in volumetric findings that are thought to ...

Direct Intrathecal Injection of Recombinant Adeno-associated Viruses in Adult Mice

Rekombinant Adeno ilişkili virüs yetişkin farelerde doğrudan intratekal enjeksiyon

Intrathecal (IT) injection of adeno-associated virus (AAV) has drawn considerable interest in CNS gene therapy by virtue of its safety, noninvasiveness, ...

Delivery of Antibodies into the Murine Brain via Convection-enhanced Delivery

Konveksiyon ile Murine beyin içine antikorların teslimi-gelişmiş teslimat

Convection-enhanced delivery (CED) is a neurosurgical technique enabling effective perfusion of large brain volumes using a catheter system. Such an ...