Name: overexpressing long noncoding rnas using gene-activating crispr
Uploaded: 2019-03-01T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Overexpressing Long Noncoding RNAs Using Gene-activating CRISPR at JoVE.com

س. ب. معتمد من قبل RO1 DK60729 و P30 DK 41301-26. موانئ دبي معتمد بواسطة كرون والتهاب القولون مؤسسة (معدل) تنمية جائزة مهنة، علاج: مركز بحوث أمراض الجهاز الهضمي (درك) DK41301، والسريرية من جامعة كاليفورنيا ومعهد العلوم متعدية الجنسيات (كتسي) UL1TR0001881. الأساسية علم الفيروسات في جامعة كاليفورنيا بتمويل من مركز أبحاث الإيدز (كفار) منح AI028697 5 ف 30. منح "جامعة كاليفورنيا المتكاملة التكنولوجيات الجزيئية" الأساسية وأيده علاج/P30 DK041301. وأيد هذا العمل أيضا معهد الإيدز في جامعة كاليفورنيا.

ملاحظة: من المهم ملاحظة أن هذا البروتوكول يستخدم lentiviruses تفتقر إلى النسخ المتماثل. تنفيذ معالجة الفيروسية إلا بعد التدريب على السلامة مختبر المناسبة. بليتش جميع البنود والأسطح التي تأتي في اتصال مع فيروسات حية للحد أدنى من 10 دقيقة بعد المناولة. استخدام حماية الوجه/العين ومعطف معم?...

<ol>
	<li>Miao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trends+of+long+noncoding+RNA+research+from+2007+to+2016:+a+bibliometric+analysis.">Trends of long noncoding RNA research from 2007 to 2016: a bibliometric analysis.</a> Oncotarget. 8 (47), 83114-83127 (2017).</li><li>Derrien, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+GENCODE+v7+catalog+of+human+long+noncoding+RNAs:+analysis+of+their+gene+structure,+evolution,+and+expression.">The GENCODE v7 catalog of human long noncoding RNAs: analysis of their gene structure, evolution, and expression.</a> Genome Research. 22 (9), 1775-1789 (2012).</li><li>Johnsson, P., Lipovich, L., Grander, D., Morris, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+conservation+of+long+non-coding+RNAs;+sequence,+structure,+function.">Evolutionary conservation of long non-coding RNAs; sequence, structure, function.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1840 (3), 1063-1071 (2014).</li><li>Perez-Pinera, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-guided+gene+activation+by+CRISPR-Cas9-based+transcription+factors.">RNA-guided gene activation by CRISPR-Cas9-based transcription factors.</a> Nature Methods. 10 (10), 973-976 (2013).</li><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity.">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li><li>Maeder, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+RNA-guided+activation+of+endogenous+human+genes.">CRISPR RNA-guided activation of endogenous human genes.</a> Nature Methods. 10 (10), 977-979 (2013).</li><li>Konermann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+transcriptional+activation+by+an+engineered+CRISPR-Cas9+complex.">Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex.</a> Nature. 517 (7536), 583-588 (2015).</li><li>Schmittgen, T. D., Livak, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+real-time+PCR+data+by+the+comparative+C(T)+method.">Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method.</a> Nature Protocols. 3 (6), 1101-1108 (2008).</li><li>Gomez, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NeST+long+ncRNA+controls+microbial+susceptibility+and+epigenetic+activation+of+the+interferon-gamma+locus.">The NeST long ncRNA controls microbial susceptibility and epigenetic activation of the interferon-gamma locus.</a> Cell. 152 (4), 743-754 (2013).</li><li>Padua, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+long+noncoding+RNA+signature+for+ulcerative+colitis+identifies+IFNG-AS1+as+an+enhancer+of+inflammation.">A long noncoding RNA signature for ulcerative colitis identifies IFNG-AS1 as an enhancer of inflammation.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 311 (3), G446-G457 (2016).</li><li>Collier, S. P., Henderson, M. A., Tossberg, J. T., Aune, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+Th1+genomic+locus+from+Ifng+through+Tmevpg1+by+T-bet.">Regulation of the Th1 genomic locus from Ifng through Tmevpg1 by T-bet.</a> Journal of Immunology. 193 (8), 3959-3965 (2014).</li><li>Kotake, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+non-coding+RNA+ANRIL+is+required+for+the+PRC2+recruitment+to+and+silencing+of+p15(INK4B)+tumor+suppressor+gene.">Long non-coding RNA ANRIL is required for the PRC2 recruitment to and silencing of p15(INK4B) tumor suppressor gene.</a> Oncogene. 30 (16), 1956-1962 (2011).</li><li>Gilbert, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Scale+CRISPR-Mediated+Control+of+Gene+Repression+and+Activation.">Genome-Scale CRISPR-Mediated Control of Gene Repression and Activation.</a> Cell. 159 (3), 647-661 (2014).</li><li>Cheng, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+activation+of+endogenous+genes+by+CRISPR-on,+an+RNA-guided+transcriptional+activator+system.">Multiplexed activation of endogenous genes by CRISPR-on, an RNA-guided transcriptional activator system.</a> Cell Research. 23 (10), 1163-1171 (2013).</li><li>Matouskova, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reference+genes+for+real-time+PCR+quantification+of+messenger+RNAs+and+microRNAs+in+mouse+model+of+obesity.">Reference genes for real-time PCR quantification of messenger RNAs and microRNAs in mouse model of obesity.</a> PLoS One. 9 (1), e86033 (2014).</li></ol>

ويعرض هذه المخطوطة على بروتوكول لاستخدام تنشيط كريسبر إلى أوفيريكسبريس لنكرناس في المختبر. هذا أسلوب أهمية خاصة عند دراسة الكشف فضله منذ فترة طويلة كمنتج ترانسكريبتوميك هو وحدة وظيفية. بعد أوفيريكسبريشن، الباحث، ثم استخدام هذه الخلايا لزيادة نسبة الإشارة إلى الضوضاء عند دراسة الشركاء م...

حين ركزت البحوث الطبية الحيوية الأكثر على نصوص ترميز البروتين، يتألف غالبية الجينات يدون فعلا الكشف فضله (الإصدار انسيمبل 93). البحث الحالي هو بداية لاستكشاف هذا المجال، مع عدد المنشورات بشأن لنكرناس في عمليات المرض ترتفع أضعافاً مضاعفة بين 2007 و 20171. هذه المنشورات تبين أن الكثير من لنكرناس ترتبط بالمرض. ومع ذلك، يصعب الآليات الجزيئية لهذه لنكرناس من الدراسة بسبب وظائفها المتنوعة بالمقارنة مع مرناس. مما يضاعف من مشكلة فهم دور لنكرناس في المرض، لنكرناس غالباً ما يعبر عنها مستويات أدنى من الترميز الكشف2. بالإضافة إلى ذلك، لنكرناس هي سيئة حفظت، مما يحد من الدراسات الفنية في تقنيات الإنسان-خط-يستند إلى الخلية3. أسلوب واحد لدراسة إليه هذه الجينات الجديدة اندوجينوسلي أوفيريكسبريس لهم في الخلايا المستزرعة. الدراسات overexpression يمكن أن توفر معلومات أساسية بشأن الوظيفة الجينات محددة وتمكن الباحثين من تشريح المسارات الجزيئية الرئيسية.
يستند أسلوب جديد لتفعيل نسخ جينات لنكرنا كريسبر التقنيات المتقدمة في البداية المختبرات جيرسباتش4. هذا البروتوكول قد تم تكييفها للاستخدام في علم الأحياء لنكرنا و للتعبير عن هذه الجينات في نظم نموذجية أخرى. في كريسبر overexpressing تقنية، بروتين يسمى البروتين المرتبطة كريسبر 9 (Cas9) يمكن أن توجه نحو تسلسل الحمض النووي عن طريق جرنة العقاقير يتم التعرف عليه بواسطة Cas9. عادة، سوف تحفز Cas9 الانقسام والحمض النووي؛ ومع ذلك، إلغاء الطفرات في Cas9، سبق أن وضعت لهذه التقنية أوفيريكسبريشن، هذه الخطوة5. عندما يتم تنصهر فيها منشط النسخي Cas9 "ميتة" (dCas9)، ويمكن أن overexpression الذاتية من لنكرناس ترانسدوسيد في خطوط الخلايا، حققت4،6. إضافة تعديلات إضافية لجرنا، تمكين عوامل النسخي إضافية لربط جرنا، زيادة كفاءة نظام التنشيط الجيني dCas9 إذ7. الأهم من ذلك، اتضح أن يتطلب التنشيط النسخي مقربة (< 200 شركة بريتيش بتروليوم) النسخي ابدأ الجينات الموقع، تمكن من أوبريجوليشن محددة في المناطق الغنية جين7. خلافا لتكنولوجيات بالضربة القاضية كريسبر، أشرطة dCas9 وجرنة بحاجة إلى أن تدمج في الجينوم للسماح للخلايا للاحتفاظ أوفيريكسبريشن على مدى أجيال متعددة. أسلوب واحد لتحقيق هذا الهدف استخدام لينتيفيروسيس لدمج الأشرطة التي تحتوي على dCas9 وجرنة. بعد التكامل، يمكن تحديد التعبير الجيني لنكرنا.
في هذه المقالة، سوف يتجلى بروتوكول أوفيريكسبريشن لنكرنا في نموذج جوركات تي خلية. إجراء خطوة بخطوة ويمكن تكييفها أيضا للخلايا ملتصقة.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:837px;" width="837">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:245px;">Ampicillin</td>
			<td style="width:195px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:195px;">BP1760-5</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">CaCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:195px;">C1016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">cDNA synthesis kit (iScript)</td>
			<td style="width:195px;">BioRad</td>
			<td>1708891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">dCas9 forward primer</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:195px;">n/a</td>
			<td>5&#39;-TCGCCACAGCATAAAGAAGA&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">dCas9 reverse primer</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:195px;">n/a</td>
			<td>5&#39;-CTTTTCATGGTACGCCACCT</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">dCas9 vector</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:195px;">50918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM</td>
			<td>Corning</td>
			<td style="width:195px;">10013CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Ethanol</td>
			<td style="width:195px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:195px;">61509-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FBS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">gRNA plasmid</td>
			<td>VectorBuilder</td>
			<td style="width:195px;">VB180119-1195qxv</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEK293T cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td style="width:195px;">&#160;CRL-1573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:195px;">H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HPRT1 forward primer</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:195px;">n/a</td>
			<td>GACCAGTCAACAGGGGACAT&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HPRT1 reverse primer</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:195px;">n/a</td>
			<td>GCTTGCGACCTTGACCATCT</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hygromycin B</td>
			<td>Corning</td>
			<td style="width:195px;">MT3024CR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Isopropanol</td>
			<td style="width:195px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:195px;">BP2618-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Jurkat cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td style="width:195px;">&#160;TIB-152</td>
			<td style="width:203px;">clone E6-1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-glutamine</td>
			<td>Corning</td>
			<td style="width:195px;">25005Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LB agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1425-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LB broth</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1426-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Maxi-prep kit (Plasmid Purification Kit)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td style="width:195px;">12362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Na2HPO4</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:195px;">NIST2186II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Optimem I reduced serum media&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:195px;">31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">p24 elisa</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td style="width:195px;">NEK050B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">PBS</td>
			<td style="width:195px;">Corning</td>
			<td style="width:195px;">21-040-CMR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin and Streptomycin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pMDG2.G</td>
			<td>Addgene &#160;</td>
			<td style="width:195px;">#12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pMDLg/pRRE</td>
			<td>Addgene&#160;</td>
			<td style="width:195px;">#60488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Poly-L-Lysine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:195px;">P-4832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Polybrene</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td style="width:195px;">TR-1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pRSV-REV</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:195px;">#12253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Puromycin dihydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:195px;">P8833</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNA purification kit (Aurum RNA mini)</td>
			<td style="width:195px;">BioRad</td>
			<td>7326820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Butyrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:195px;">B5887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SYBR green (iTaq universal)</td>
			<td style="width:195px;">BioRad</td>
			<td>1725122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:195px;">X100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

overexpressing long noncoding rnas using gene-activating crispr

منذ فترة طويلة فضله الحمض النووي الريبي (لنكرنا) البيولوجيا حقل جديد ومثير للبحوث، مع عدد المنشورات من هذا الحقل تزايد أضعافاً مضاعفة منذ عام 2007. هذه الدراسات قد أكدت على أن يتم تغيير لنكرناس في تقريبا جميع الأمراض. بيد دراسة الأدوار الوظيفية لنكرناس في سياق المرض لا يزال صعباً بسبب عدم وجود منتجات البروتين، التعبير الخاصة بالانسجة، مستويات منخفضة من التعبير، والتعقيدات في لصق الأشكال، وعدم الحفظ فيما بين الأنواع. نظراً للتعبير إبلاغها، دراسات لنكرنا غالباً ما تنحصر في سياقات البحوث البشرية عند دراسة عمليات المرض. حيث تعمل لنكرناس على المستوى الجزيئي، هو طريقة واحدة لتشريح الأحياء لنكرنا إزالة لنكرنا أو أوفيريكسبريس لنكرنا وقياس آثار الخلوية. ويرد في هذه المادة، بروتوكول مكتوب وتصور أوفيريكسبريس لنكرناس في المختبر. كتجربة ممثل، يرد لنكرنا المرتبطة بمرض التهاب الأمعاء، انترفيرون غاما Antisense 1 (إيفنج-AS1)، أن overexpressed في نموذج جوركات تي خلية. لإنجاز هذا، استخدام التقنية يكرر المتناوب القصير إينتيرسباسيد بانتظام (كريسبر) بتفعيل متفاوت المسافات لتمكين أوفيريكسبريشن في المكاني الجينوم الذاتية. التقنية كريسبر تفعيل الأهداف مجموعة من عوامل النسخ إلى موقع بدء النسخي الجينات، تمكن overexpression قوية متعددة الأشكال لصق لنكرنا. هذا الإجراء سيتم تقسيمها إلى ثلاث خطوات، هي: (ط) دليل الحمض النووي الريبي (جرنة) التصميم وناقلات البناء والجيل (الثاني) فيروس وتوصيل والفرز (ثالثا) مستعمرة ل overexpression. لهذه التجربة التمثيلية، أكبر مما لوحظ تعزيز برنامج في IFNG-AS1 في خلايا تي جوركات.

نظام مزدوج متجه أوفيريكسبريس لنكرنا إيفنج-AS1 هذه التجربة مثال في هذه المخطوطة هو أوفيريكسبريشن جوركات تي خلية نموذج نظام الإعراب عن لنكرنا إيفنج-AS19. إيفنج-AS1 هو لنكرنا المرتبطة بمرض التهاب الأمعاء، التي شهدت تنظيم "انترفيرون غاما"10. ج?...

Watch this Scientific Journal Video about Overexpressing Long Noncoding RNAs Using Gene-activating CRISPR at JoVE.com

Overexpressing Long Noncoding RNAs Using Gene-activating CRISPR

التقنيات التقليدية المستندة إلى كدنا overexpression انطباقاً محدودا overexpression الكشف فضله منذ فترة طويلة بسبب أشكالها لصق متعددة مع الوظائف المحتملة. هذا الاستعراض تقارير بروتوكول باستخدام تكنولوجيا كريسبر إلى أوفيريكسبريس متعددة المتغيرات لصق الحمض النووي الريبي فضله منذ وقت طويل.

Overexpressing الكشف فضله منذ فترة طويلة باستخدام الجينات-تفعيل كريسبر

Long noncoding RNA (lncRNA) biology is a new and exciting field of research, with the number of publications from this field growing exponentially since ...

RNAs غير متكد غالبا ما يكون isoforms متعددة. في دراسات فرط التعبير في المختبر ، غالبا ما يكون من الصعب دراسة كل هذه isoforms أعرب. هذه التقنية تسمح للمستخدمين لاشتقاق التعبير مباشرة من الجينوم وتمكين الخلايا للتعبير عن isoforms الذاتية لرنا غير متكود معين.هذه التقنية القوية تسمح للمستخدم بتوجيه التعبير عن أي جين في الجينوم بدقة ودقة. من خلال تصميم RNAs دليل لجينات محددة، واحد هو قادر على استخدام آلة الربط الجينية الذاتية للتعبير عن isoforms الطبيعية في خلية معينة. إثبات الإجراء سيكون روبرت رانكين، طبيب ما بعد الطبيب من مختبري.لتصميم تسلسل RNA الدليل الذي يقع ضمن أزواج قاعدة 100 من موقع بدء النسخ، واستخدام قواعد البيانات الجينية مثل BLAT للتأكد من أن RNA دليل فريدة من نوعها لجين من الفائدة. تخزين الجيش الملكي النيبالي الدليل وتعطيلها Cas9 plasmids في أربع درجات مئوية. خط خارج E.coli على لوحة مرق لوريا أجار مع الأمبيسيلين وتنمو البكتيريا بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.في اليوم التالي ، اختر مستعمرة وتنمو البكتيريا في خمسة ملليلتر من LB مع الأمبيسيلين بين عشية وضحاها ، وهز بقوة الأنبوب في حاضنة 37 درجة مئوية. في اليوم التالي، إضافة مليلترين من البكتيريا إلى 200 ملليلتر من LB مع الأمبيسيلين في قارورة سعة لترين، يهز بقوة القارورة بين عشية وضحاها في حاضنة 37 درجة مئوية. تدور أسفل البكتيريا في 3، 724 مرات ز لمدة 20 دقيقة والمضي قدما في تنقية الحمض النووي.لإنشاء فيروس العدس dCas9 التي تحتوي على, معطف أول 100 ملليلتر الأنسجة الأطباق ثقافة مع خمسة ملليلتر من 0.01٪ بولي-L-ليسين ولوحة خمسة ملايين HEK293T الخلايا في طبق في 10 ملليلتر كاملة من النسور المعدلة كاملة من النسور المتوسطة, ثم إعداد عينات نقل الحمض النووي عن طريق خلط 10 ميكروغرام من ناقل RNA دليل يحتوي على LTR أو ناقل Cas9 المعطلة التي تحتوي على LTR مع plasmids تحتوي على مكونات الفيروسات. يضاف الماء إلى حجم إجمالي قدره 450 ميكرولترات وتصفية الخليط من خلال طرف مرشح 0.2 ميكرون تعلق على حقنة. بعد ذلك، أضف 50 ميكرولترات من 2.5-2-المولر كلوريد الكالسيوم لكل عينة من الحمض النووي ومزيج بلطف.قم بتصفية خليط الكالسيوم والحمض النووي من خلال طرف مرشح 0.2 ميكرون متصل بحقنة. Pipette 500 ميكرولترات من 2X HBS في أنبوب البوليسترين خمسة ملليلتر. إضافة 500 ميكرولترات من الكالسيوم والحمض النووي خليط قطرة ودوامة بلطف.احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة ثلاث دقائق. إضافة ملليلتر واحد من تعليق الحمض النووي والكالسيوم HBS لكل طبق ثقافة الأنسجة المحتوية على HEK293T واحتضانها في حاضنة ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. في اليوم الثالث، قم بإزالة وسائل الإعلام ببطء وتجاهلها من الأطباق.غسل الخلايا بعناية مع برنامج تلفزيوني مرة واحدة. إضافة ستة ملليلتر من DMEM كاملة تكملها HEPES 20 ملليمولار و 10 ملليمولار بتيرات الصوديوم. ثم احتضان الخلايا في حاضنة ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ عند 37 درجة مئوية لمدة خمس إلى ست ساعات.بعد الحضانة، وغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني مرة واحدة وإضافة خمسة ملليلتر من DMEM كاملة مع HEPES 20 ملليمولار إلى خلايا HEK293T. احتضان الخلايا في حاضنة ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ عند 37 درجة مئوية لمدة 12 ساعة. في اليوم الرابع، جمع عظمى خلية HEK293T وتصفية عظمى تحتوي على الفيروس.للبدء في عدد الجسيمات الفيروسية، قم أولاً بتخفيف تركيز الغسيل من مجموعة P24 ELISA عن طريق إضافة 19 جزءًا من الماء المقطر والمأين. ثم، تمييع السيطرة الإيجابية من هذه المجموعة إلى 200 نانوغرام لكل ملليلتر باستخدام 1640 1640 1640 كما diluent وجعل التخفيفات لمنحنى القياسية في أنابيب 1.5 ملليلتر وفقا لجدول تخفيف P24 ELISA. لقياس تركيز الفيروس داخل العينات إضافة التخفيف العينة إلى الآبار المعينة من لوحة 96-جيدا، بدءا من تخفيف 1:1000 وتعديل حجم حسب الضرورة من أجل أن تكون ضمن نطاق المنحنى القياسي.ثم تمييع العينات مع تريتون X-100 إلى تركيز نهائي من 0.5٪وإضافة 200 ميكرولترات من كل عينة و RPMI 1640 إلى الآبار المعينة. ختم لوحة واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة ساعتين. اغسل الطبق بـ 300 ميكرولترات لكل بئر من عازل الغسيل 1X ست مرات.إزالة أي السوائل الزائدة عن طريق عكس لوحة والاستفادة منه على منشفة ورقية. ثم إضافة 100 ميكرولترات من الأجسام المضادة للكشف من عدة إلى جميع الآبار باستثناء الركازة فارغة. ختم لوحة واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.اغسل الطبق ثم ازيل أي سائل زائد عن طريق عكس اللوحة والنقر عليها على منشفة ورقية. من أجل قياس الأجسام المضادة للكشف، وتمييع بيروكسيديز الفجل streptavidin في 1:100 تخفيف مع SA-HRP اللوين. اخلطي SA-HRP المخففة بدقة وأضيفي 100 ميكرولترات إلى جميع الآبار باستثناء الفارغ.ختم واحتضان لوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك، قم بغسل الطبق مع المخزن المؤقت 1X والاستفادة من أي سائل زائد. إسقاط واحد تقويم العظام-phenylenediamine قرص في 11 ملليلتر من الزاوي الركيزة لجعل ما يكفي من محلول الركيزة لصفيحة واحدة.دوامة الحل OPD بقوة لإذابته تماما وحمايته من الضوء. إضافة 100 ميكرولترات من محلول الركيزة OPD لجميع الآبار بما في ذلك فارغة. باستخدام مقياس الطيف، قراءة امتصاص في 450 نانومتر على الفور.كرر 10 مرات على فترات ثانية واحدة واتخاذ متوسط القياس. Resuspend والثقافة Jurkat الخلايا التائية في قارورة T75 مع كثافة من مليون خلية في خمسة ملليلتر من وسائل الإعلام المصل انخفاض مع البوليبرين. ثم أضف HEK293T وسائل الإعلام المكيفة التي تحتوي على مليون من الجسيمات الفيروسية المحتوية على dCas9.احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. ثلاثة أيام بعد العدوى, تدور أسفل الخلايا في 233 الوقت ز لمدة خمس دقائق و resuspend لهم في 10 ملليلتر من DMEM كاملة تكملها مع البورومايسين. ثقافة الخلايا في T75 قارورة واحتضان لهم في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون.كل يوم ثالث لمدة تسعة أيام، تدور أسفل الخلايا في 233 مرات ز لمدة خمس دقائق واستبدال وسائل الإعلام مع DMEM كاملة تكملها البوريميسين. عد الخلايا باستخدام مقياس الهيموسيت أو عداد الخلايا الآلي. ثم، على لوحة 96-well مع الأنسجة المعالجة ثقافة الأنسجة، إضافة 10،000 الخلايا في 100 ميكرولترات من DMEM كاملة تستكمل مع البورومايسين في البئر الأولى.جعل 1:1 تخفيف المسلسل من محتويات الآبار التالية مع DMEM كاملة تكمل مع البوروميسين. احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. توسيع الخلايا المنعزلة إلى اثنين من لوحات 24 جيدا، ثم لوحة مليوني خلية في بئر من لوحة ستة جيدا لثلاثة من المستنسخين.لوحة الآبار الثلاثة الأخرى مع خلايا جوركات غير مستحثة كضوابط. وأخيرا، لوحة الخلايا في قارورة T75 ووضع الخلايا في حاضنة ثقافة الخلية بين عشية وضحاها. لبدء PCR الكمي لقياس التعبير الجيني، أولا توليف الحمض النووي التكميلي عن طريق إضافة ميكروغرام واحد من الجيش الملكي النيبالي، وأربعة ميكرولترات من المخزن المؤقت التوليفية cDNA، وميكر واحد من النسخ العكسي إلى 250 أنابيب ميكرولتر، ثم إضافة الماء إلى حجم النهائي من 20 ميكرولتر.ثم، استخدام دورة حرارية في 42 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة و 95 درجة مئوية لمدة خمس دقائق لإلغاء تنشيط النسخ العكسي. تمييع cDNA مع 60 ميكرولترات من الماء بعد التوليف. تشغيل تفاعل البوليميراز سلسلة من الأنابيب التي تحتوي على 0.5 ميكرولترات من كل إلى الأمام وعكس التمهيدي في التركيز النهائي من 10 ميكرومولار، وخمسة ميكرولترات من الأخضر SYBR، وأربعة ميكرولترات من cDNA.وأخيراً حدد Jurkat-dCas9 الخلايا في DMEM تكمل مع هيغروميسين B لمدة 10 أيام. تدور أسفل الخلايا وتغيير وسائل الإعلام كل ثلاثة أيام. تنقية RNAse والمضي قدما إلى RT-qPCR.في هذه الدراسة، تم استخدام تسلسلات GRNA التي كانت ضمن 10 إلى 100 زوج قاعدة بعيدًا عن موقع البدء النسخي لتوجيه مجمع Cas9-activating إلى مكان النسخ من IFNG-AS1، وهو رنا طويل غير متكد مرتبط بمرض الأمعاء الالتهابي. لتمكين اختيار الخلايا المستحثة المزدوجة ، تم استخدام نظام ثنائي البلازميد لتحويل إما dCas9 أو gRNAse محسنات إلى خلايا. هنا بروتينات MS2 تعزيز التعبير الزائد من IFNG-AS1.تم تأكيد تعبير Cas9 لكل من المستنسخين. استخدمت ال التمهيديات ضد HPRT1 لتأكيد وجود الحمض النووي الريبي في الخلايا غير المستحثة. تم تأكيد التعبير مرنا عن طريق حذف نسخة عكسية من رد فعل cDNA.ويمكن الكشف عن ثلاثة متغيرات لصق من IFNG-AS1 مع مجموعات التمهيدي نسخة محددة أو التمهيدي تعيين ضد جميع النصوص IFNG-AS1 المعروفة. وكانت جميع منحنيات الفلوريسنس أسية مع الجينات التدبير المنزلي HPRT1 الوصول إلى المرحلة الأسية في غضون دورة نصف بين التحكم والخلايا IFNG-AS1 رنا التعبير عن. كانت ال التمهيديات ضد جميع النسخ القياسية المعروفة IFNG-AS1 هي الأكثر قابلية للكشف بين التجارب، مع قياسات الزيادات 20 أضعاف في التعبير IFNG-AS1.غير أن النص الثالث من النظام IFNG-AS1 أظهر زيادة كبيرة من خمسة إلى عشرة أضعاف في مستويات IFNG-AS1. لفرط بنشاط الجين الخاص بك المطلوب ، وتصميم RNA دليل في الخطوة 2.1 أمر بالغ الأهمية لنجاح البروتوكول. بالإضافة إلى ذلك، فإن إنتاج الجسيمات الفيروسية عالية الجودة سيضمن التعبير القوي عن مكونات البروتوكول الخاصة بك.بمجرد أن يتم التعبير عن الجين المطلوب بشكل مفرط ، يمكن إجراء دراسات وظيفية للتحقيق في آليات الجينات. في مثالنا، اخترنا أن ننظر في إنتاج السيتوكين بعد فرط التعبير عن جيناتنا ذات الاهتمام. وقد تم تطوير هذه التقنية في البداية من قبل مجموعة غريسباخ في عام 2013 وتم تطبيقها على نطاق واسع وتفصيلها من قبل مجموعات أخرى.كنا متحمسين لتطبيق هذه التقنية على RNAs طويلة غير مشفرة من أجل استكشاف وظائفها المحددة. يجب التعامل مع فيروسات العدسية المعيبة في المختبر الذي تمت الموافقة عليه للعمل الفيروسي. بالإضافة إلى ذلك، تعتبر خطوط الخلايا البشرية وبكتيريا الإشريكية القولونية هي الخطر الحيوي.وأخيرا، ينبغي أن يتم التعامل مع plasmids الحمض النووي المؤتلف من قبل الموظفين المدربين.

Research

JoVE Journal

Genetics

Sequence-specific and Selective Recognition of Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs by Chemically Modified Peptide Nucleic Acids

الاعتراف الخاصة بتسلسل وانتقائية بالكشف مزدوج-الذين تقطعت بهم السبل على الكشف واحد-الذين تقطعت بهم السبل بتعديل كيميائيا الببتيد الأحماض النووية

RNAs are emerging as important biomarkers and therapeutic targets. Thus, there is great potential in developing chemical probes and therapeutic ligands ...

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

كريسبر/Cas9-بوساطة التكامل المستهدفة في فيفو استخدام استراتيجية تستند إلى الانضمام إلى التماثل بوساطة نهاية

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

Metabolic Labeling and Profiling of Transfer RNAs Using Macroarrays

وسم الأيضية والتنميط لنقل الكشف باستخدام ماكروارايس

Transfer RNAs (tRNA) are abundant short non-coding RNA species that are typically 76 to 90 nucleotides in length. tRNAs are directly responsible for ...

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

السريع وخط أنابيب سهلة "توليد طفرات نقطة الجينوم" في C. ايليجانس باستخدام كريسبر/Cas9 "ريبونوكليوبروتينس"

The clustered regularly interspersed palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (Cas9) prokaryotic adaptive immune defense system has been ...

Dissection of Enhancer Function Using Multiplex CRISPR-based Enhancer Interference in Cell Lines

تشريح للدالة محسن باستخدام محسن متعدد المستندة إلى كريسبر التدخل في خطوط الخلايا

Multiple enhancers often regulate a given gene, yet for most genes, it remains unclear which enhancers are necessary for gene expression, and how these ...

CRISPR Guide RNA Cloning for Mammalian Systems

كريسبر دليل الحمض النووي الريبي استنساخ الثدييات بالأنظمة

The outlined protocol describes streamlined methods for the efficient and cost-effective generation of Cas9-associated guide RNAs. Two alternative ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

البروتين الذاتية في الإنسان التي يسببها الخلايا الجذعية Pluripotent باستخدام كريسبر/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas

تحرير الجينوم في "خطوط خلايا الثدييات" استخدام Cas كريسبر

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) system functions naturally in bacterial adaptive immunity, but has been ...

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

إدخال الجين بالضربة القاضية مباشرة في مرحلة Amastigote من التريبانوسوما كروزي باستخدام نظام CRISPR/Cas9

Trypanosoma cruzi is a pathogenic protozoan parasite that causes Chagas&#8217; disease mainly in Latin America. In order to identify a novel drug target ...