Name: overexpressing long noncoding rnas using gene-activating crispr
Uploaded: 2019-03-01T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Overexpressing Long Noncoding RNAs Using Gene-activating CRISPR at JoVE.com

c. p. 由 ro1 dk60729 和 p30 dk 41301-26 提供支持。d. p. 由 crohn & 结肠炎基金会 (ccfa) 职业发展奖、cure: 消化系统疾病研究中心 (ddrc) dk41301 和加州大学洛杉矶分校临床和转化科学研究所 (ctsi) ul1tr881 提供支持。加州大学洛杉矶分校病毒学核心由艾滋病研究中心 (cfar) 资助 5p30 ai028697。ucla 综合分子技术核心得到 cureea/p30 赠款 dk041301 的支持。这项工作也得到了加州大学洛杉矶分校艾滋病研究所的支持。

请注意:需要注意的是, 该协议使用复制缺陷的慢病毒。只有在经过适当的实验室安全培训后, 才进行病毒处理。处理后, 将所有接触活体病毒的物品和表面漂白至少10分钟。在任何时候都要使用一次性的实验室外套和面部保护, 以及双手套。在具有病毒认证的生物安全 2 + 级实验室中执行病毒工作。专门的组织培养罩和孵化器的病毒工作。
1. 矢量设计<stro...

<ol>
	<li>Miao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trends+of+long+noncoding+RNA+research+from+2007+to+2016:+a+bibliometric+analysis.">Trends of long noncoding RNA research from 2007 to 2016: a bibliometric analysis.</a> Oncotarget. 8 (47), 83114-83127 (2017).</li><li>Derrien, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+GENCODE+v7+catalog+of+human+long+noncoding+RNAs:+analysis+of+their+gene+structure,+evolution,+and+expression.">The GENCODE v7 catalog of human long noncoding RNAs: analysis of their gene structure, evolution, and expression.</a> Genome Research. 22 (9), 1775-1789 (2012).</li><li>Johnsson, P., Lipovich, L., Grander, D., Morris, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+conservation+of+long+non-coding+RNAs;+sequence,+structure,+function.">Evolutionary conservation of long non-coding RNAs; sequence, structure, function.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1840 (3), 1063-1071 (2014).</li><li>Perez-Pinera, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-guided+gene+activation+by+CRISPR-Cas9-based+transcription+factors.">RNA-guided gene activation by CRISPR-Cas9-based transcription factors.</a> Nature Methods. 10 (10), 973-976 (2013).</li><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity.">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li><li>Maeder, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+RNA-guided+activation+of+endogenous+human+genes.">CRISPR RNA-guided activation of endogenous human genes.</a> Nature Methods. 10 (10), 977-979 (2013).</li><li>Konermann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+transcriptional+activation+by+an+engineered+CRISPR-Cas9+complex.">Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex.</a> Nature. 517 (7536), 583-588 (2015).</li><li>Schmittgen, T. D., Livak, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+real-time+PCR+data+by+the+comparative+C(T)+method.">Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method.</a> Nature Protocols. 3 (6), 1101-1108 (2008).</li><li>Gomez, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NeST+long+ncRNA+controls+microbial+susceptibility+and+epigenetic+activation+of+the+interferon-gamma+locus.">The NeST long ncRNA controls microbial susceptibility and epigenetic activation of the interferon-gamma locus.</a> Cell. 152 (4), 743-754 (2013).</li><li>Padua, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+long+noncoding+RNA+signature+for+ulcerative+colitis+identifies+IFNG-AS1+as+an+enhancer+of+inflammation.">A long noncoding RNA signature for ulcerative colitis identifies IFNG-AS1 as an enhancer of inflammation.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 311 (3), G446-G457 (2016).</li><li>Collier, S. P., Henderson, M. A., Tossberg, J. T., Aune, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+Th1+genomic+locus+from+Ifng+through+Tmevpg1+by+T-bet.">Regulation of the Th1 genomic locus from Ifng through Tmevpg1 by T-bet.</a> Journal of Immunology. 193 (8), 3959-3965 (2014).</li><li>Kotake, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+non-coding+RNA+ANRIL+is+required+for+the+PRC2+recruitment+to+and+silencing+of+p15(INK4B)+tumor+suppressor+gene.">Long non-coding RNA ANRIL is required for the PRC2 recruitment to and silencing of p15(INK4B) tumor suppressor gene.</a> Oncogene. 30 (16), 1956-1962 (2011).</li><li>Gilbert, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Scale+CRISPR-Mediated+Control+of+Gene+Repression+and+Activation.">Genome-Scale CRISPR-Mediated Control of Gene Repression and Activation.</a> Cell. 159 (3), 647-661 (2014).</li><li>Cheng, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+activation+of+endogenous+genes+by+CRISPR-on,+an+RNA-guided+transcriptional+activator+system.">Multiplexed activation of endogenous genes by CRISPR-on, an RNA-guided transcriptional activator system.</a> Cell Research. 23 (10), 1163-1171 (2013).</li><li>Matouskova, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reference+genes+for+real-time+PCR+quantification+of+messenger+RNAs+and+microRNAs+in+mouse+model+of+obesity.">Reference genes for real-time PCR quantification of messenger RNAs and microRNAs in mouse model of obesity.</a> PLoS One. 9 (1), e86033 (2014).</li></ol>

本手稿提出了一种在体外使用激活 crispr 超细的协议。这是研究长期非编码 rna 时的一项特别重要的技术, 因为转录产物是功能单元。在过度表达后, 研究人员可以在研究结合伙伴时使用这些细胞来提高信噪比, 甚至可以测量英 r r a 水平增加对细胞的影响。此外, 由于 incrna 经常作用于顺基因, 这种内源性过度表达技术使这些事件能够被研究 11,12.
<p class=...

虽然大多数生物医学研究都集中在蛋白质编码转录记录上, 但大多数转录基因实际上是由非编码 rna (ensembl 发布 93) 组成的。目前的研究开始探索这一领域, 2007年至2017年期间, 关于疾病过程中的 inrna 的出版物数量呈指数级增长1。这些出版物表明, 许多 inrna 与疾病有关。然而, 与 mrna 相比, 这些神经网络的分子机制由于其功能不同而难以研究。使理解信息素的作用的问题更加复杂, 而英特罗 a 的表达水平往往低于编码 rna2。此外, 英特拉 a 的保守程度很低, 这限制了基于人的技术的功能研究3。研究这些新基因机制的一种方法是在培养的细胞中内源过度表达它们。过度表达研究可以提供有关特定基因功能的关键信息, 并使研究人员能够剖析关键的分子途径。
一种激活 lncRNA 基因转录的新方法是基于 gersbach 实验室最初开发的 crispr 技术。该协议已被改编用于英卡纳生物学和这些基因在其他模型系统中的表达。在 crispr 过度表达技术中, 一种名为 crispr 相关蛋白 9 (cas9) 的蛋白质可以通过 cas9 识别的反义 grna 指向 dna 序列。通常情况下, cas9 会诱导 dna 裂解;然而, 以前为过度表达技术开发的 cas9 中的突变会停用这一步骤5。当转录激活剂融合到 "死" cas9 (dcas9) 并转化为细胞系时, 就能实现 ncrna 的内源性过度表达 4,6。添加了对 grna 的额外修饰, 使额外的转录因子与 grna 结合, 提高了 dcas9 基因激活系统的疗效 10倍7倍。重要的是, 它表明, 转录激活需要接近 (和 lt;200 bp) 转录起始位基因, 使一个特定的隆起地区7。与 crispr 淘汰赛技术不同, dcas9 和 grna 盒式磁带需要集成到基因组中, 以允许细胞在多代人的多代中保持过度表达。实现这一目标的一种方法是使用慢病毒集成含有 dcas9 和 grna 的盒式磁带。整合后, 可以确定英克斯拉基因的表达。
在本文中, 将演示一种在 jurkat t 细胞模型中过度表达的协议。一个循序渐进的过程显示, 也可以适应粘附细胞。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:837px;" width="837">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:245px;">Ampicillin</td>
			<td style="width:195px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:195px;">BP1760-5</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">CaCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:195px;">C1016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">cDNA synthesis kit (iScript)</td>
			<td style="width:195px;">BioRad</td>
			<td>1708891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">dCas9 forward primer</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:195px;">n/a</td>
			<td>5&#39;-TCGCCACAGCATAAAGAAGA&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">dCas9 reverse primer</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:195px;">n/a</td>
			<td>5&#39;-CTTTTCATGGTACGCCACCT</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">dCas9 vector</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:195px;">50918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM</td>
			<td>Corning</td>
			<td style="width:195px;">10013CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Ethanol</td>
			<td style="width:195px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:195px;">61509-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FBS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">gRNA plasmid</td>
			<td>VectorBuilder</td>
			<td style="width:195px;">VB180119-1195qxv</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEK293T cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td style="width:195px;">&#160;CRL-1573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:195px;">H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HPRT1 forward primer</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:195px;">n/a</td>
			<td>GACCAGTCAACAGGGGACAT&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HPRT1 reverse primer</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:195px;">n/a</td>
			<td>GCTTGCGACCTTGACCATCT</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hygromycin B</td>
			<td>Corning</td>
			<td style="width:195px;">MT3024CR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Isopropanol</td>
			<td style="width:195px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:195px;">BP2618-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Jurkat cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td style="width:195px;">&#160;TIB-152</td>
			<td style="width:203px;">clone E6-1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-glutamine</td>
			<td>Corning</td>
			<td style="width:195px;">25005Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LB agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1425-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LB broth</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1426-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Maxi-prep kit (Plasmid Purification Kit)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td style="width:195px;">12362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Na2HPO4</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:195px;">NIST2186II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Optimem I reduced serum media&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:195px;">31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">p24 elisa</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td style="width:195px;">NEK050B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">PBS</td>
			<td style="width:195px;">Corning</td>
			<td style="width:195px;">21-040-CMR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin and Streptomycin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pMDG2.G</td>
			<td>Addgene &#160;</td>
			<td style="width:195px;">#12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pMDLg/pRRE</td>
			<td>Addgene&#160;</td>
			<td style="width:195px;">#60488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Poly-L-Lysine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:195px;">P-4832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Polybrene</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td style="width:195px;">TR-1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pRSV-REV</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:195px;">#12253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Puromycin dihydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:195px;">P8833</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNA purification kit (Aurum RNA mini)</td>
			<td style="width:195px;">BioRad</td>
			<td>7326820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Butyrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:195px;">B5887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SYBR green (iTaq universal)</td>
			<td style="width:195px;">BioRad</td>
			<td>1725122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:195px;">X100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

overexpressing long noncoding rnas using gene-activating crispr

长非编码 rna (lncrna) 生物学是一个新的和令人兴奋的研究领域, 自2007年以来, 来自该领域的出版物数量呈指数级增长。这些研究证实, 几乎所有疾病的情况都发生了变化。然而, 由于缺乏蛋白质产品、组织特异性表达、表达水平低、拼接形式复杂、物种之间缺乏保护, 研究环境中的环境中的环境中的环境中的环境中的环境中的神经网络的功能作用仍然困难。鉴于物种特异性表达, 在研究疾病过程时, 英克拉研究往往仅限于人类的研究背景。由于 ncrna 在分子水平上发挥作用, 因此解剖而不是去除而不是过度表达而不是超表达而不是超表达而不是超表达而不是多表达的。本文提出了一种在体外超表达英 r a 的书面可视化协议。作为一个有代表性的实验, 与炎症性肠病相关的英卡纳, 干扰素伽玛反义 1 (ifng-as1), 在 jurkat t 细胞模型中被证明是过度表达。为了实现这一目标, 激活聚集定期间隔的短回文重复 (crispr) 技术被用来使内源基因组位点过度表达。激活 crispr 技术的目标是一组转录因子到一个基因的转录起始位点, 使多个 incrna 拼接形式的强大过度表达。这一程序将分为三个步骤, 即 (i) 指导 rna (grna) 设计和载体构建, (ii) 病毒生成和转导, (iii) 菌落筛查过度表达。在这一具有代表性的实验中, jurkat t 细胞的 ifng-as1 增强了20倍以上。

一种超微向量系统, 用于超快 本手稿中的示例实验是表示 incrna ifng-as1 9 的 jurkat t 细胞模型系统的过度表达。ifng-as1 是一种与炎症性肠病相关的英卡纳, 被认为可以调节干扰素伽玛 10。ifng-as1 基因包含三个拼接变体, 它们都使用相同的转录起始位点 (图 1a)。因此, grna 序列距离转录起始位点10和 100 bp, ?...

Watch this Scientific Journal Video about Overexpressing Long Noncoding RNAs Using Gene-activating CRISPR at JoVE.com

Overexpressing Long Noncoding RNAs Using Gene-activating CRISPR

传统的基于 cdna 的过度表达技术由于具有潜在功能的多个拼接形式, 对长非编码 rna 的过度表达的适用性有限。本综述报告了一个协议使用 crispr 技术超细的多个拼接变体的长非编码 rna。

使用基因激活 crispr 过度表达长非编码 rna

Long noncoding RNA (lncRNA) biology is a new and exciting field of research, with the number of publications from this field growing exponentially since ...

非编码 RNA 通常具有多个等值形式。在体外过度表达研究中，通常很难研究所有这些表达的等同形。该技术允许用户直接从基因组中派生表达，使细胞能够表达特定非编码RNA的内源等异构。这种强大的技术允许用户以保真度和准确性专门指导基因组中任何基因的表达。通过设计引导RNA到特定基因，一个人能够使用内源基因拼接机制来表达给定细胞中的天然异构体。演示这个程序将是罗伯特·兰金，一个博士后从我的实验室。要设计位于转录开始位点100个碱基对内的引导RNA序列，请使用BLAT等基因数据库确保引导RNA是感兴趣的基因所独有。将导导RNA和停用的Cas9质粒储存在4摄氏度。用安比西林在卢里亚肉汤加糖盘上划出大肠杆菌，并在37摄氏度下一夜之间将细菌生长。第二天，挑选一个菌落，用安霉素在五毫升的LB中生长细菌，在37摄氏度的培养箱中剧烈摇晃管子。第二天，在2升烧瓶中加入200毫升的细菌，用安霉素加入200毫升的LB中，在37摄氏度的培养箱中一夜之间剧烈摇动烧瓶。在3，724次g下旋转细菌20分钟，然后进行DNA纯化。为了制造含有dCas9的扁病毒，首先涂上100毫升组织培养皿，配以5毫升0.01%的聚-L-莱辛和板500万个 HEK293T 细胞每盘在10毫升完整的Dulbecco的修改鹰中等， 然后通过混合10微克含LTR导导RNA载体或含LTR的停用Cas9载体与含有病毒成分的质粒来准备DNA转染样本。将水加入总体积为 450 微升的混合物，并通过连接到注射器的 0.2 微米滤片尖过滤混合物。接下来，在DNA的每个转染样品中加入50微升2.5摩尔二氯化钙，轻轻混合。通过附着在注射器上 0.2 微米的滤波尖过滤钙-DNA 混合物。将 500 微升 2X HBS 移入五毫升聚苯乙烯管中。滴滴加入500微升的钙-DNA混合物，轻轻涡流。在室温下孵育三分钟。在每个含 HEK293T 的组织培养盘中加入一毫升的 DNA 钙 HBS 悬浮液，并在 37 摄氏度的 5%二氧化碳培养箱中孵育。第三天，慢慢取出介质，然后丢弃盘子。用 PBS 小心洗一次细胞。加入六毫升完整的DMEM，辅以20毫升的 HEPES 和 10 毫升的甲酸钠。然后在37摄氏度的5%二氧化碳培养箱中孵育细胞5至6小时。孵育后，用PBS清洗细胞一次，在 HEK293T 细胞中加入5毫升完整的DMEM，用20毫升的 HEPES。在37摄氏度的5%二氧化碳培养箱中孵育细胞12小时。第四天，收集HK293T细胞中分，过滤含有病毒的上清液。要开始病毒颗粒计数，首先通过添加 19 个部分蒸馏、去化水来稀释 P24 ELISA 试剂盒中的洗涤浓缩物。然后，使用 RPMI 1640 作为稀释剂，将该套件的正控从该套件稀释至每毫升 200 毫微克，然后根据 P24 ELISA 稀释表对 1.5 毫升管中的标准曲线进行稀释。为了测量样品中病毒的浓度，将样品稀释添加到96孔板的指定孔中，从1：1000稀释开始，并根据需要修改体积，以便在标准曲线范围内。然后用Triton X-100稀释样品，最终浓度为0.5%，并将每个样品的200微升和RPMI 1640添加到指定的油井中。密封板并在37摄氏度下孵育两小时。每 1X 洗涤缓冲液中每井用 300 微升清洗板 6 次。通过倒置盘子并在纸巾上敲击它来去除多余的液体。然后将100微升的检测器抗体从试剂盒添加到除基板空白以外的所有孔中。密封板，并在37摄氏度下孵育一小时。清洗盘子，然后通过倒置盘子，用纸巾敲击它，去除多余的液体。为了测量检测器抗体，用SA-HRP稀释剂在1：100稀释马萝卜过氧化物酶。将稀释的SA-HRP彻底混合，并在除空白以外的所有孔中加入100微升。在室温下密封并孵育板30分钟。接下来，用1X洗涤缓冲液清洗盘子，然后敲开多余的液体。将一个正苯二胺片滴在基板稀释剂的 11 毫升中，为一个板提供足够的基底溶液。涡流 OPD 溶液大力溶解，并保护其免受光线的光。将 100 微升 OPD 基板溶液添加到包括空白在内的所有孔中。使用分光光度计，立即读取 450 纳米的吸光度。以一秒间隔重复 10 次，然后进行平均测量。在T75烧瓶中，在5毫升的减少血清介质中，用聚布雷恩的5毫升中，重新发送和培养Jurkat T细胞。然后添加 HEK293T 条件介质，其中包含 100 万个包含 dCas9 的病毒颗粒。用5%的二氧化碳在37摄氏度下孵育细胞。感染后三天，在233次g下旋转细胞5分钟，并在10毫升完整的DMEM中重新释放，并辅以纯霉素。培养T75烧瓶中的细胞，并在37摄氏度下用5%的二氧化碳孵育。每三天一次，为期九天，以233次g旋转细胞，五分钟，用完整的DMEM代替用紫霉素补充的 DMEM。使用血细胞计或自动细胞计数器计算细胞。然后，在一个96井的盘子里，用组织培养处理的组织，在第一个井的100微升中加入1万个细胞，并辅以紫霉素。使用完整的DMEM辅以紫霉素，对以下孔的内容进行1：1的连续稀释。用5%的二氧化碳在37摄氏度下孵育细胞。将克隆细胞扩展成两个24孔板，然后将六孔板的两百万个细胞板板，用于三个克隆。将其他三个孔的板板，以非转导的Jurkat细胞作为对控装置。最后，将细胞板入T75烧瓶中，将细胞放入细胞培养箱中过夜。要开始定量PCR测量基因表达，首先通过添加1微克RNA、4微升cDNA合成缓冲液和1微升逆转录酶到250微升管来合成补充DNA，然后将水加入20微升的最终体积。然后，在 42 摄氏度下使用热循环器 30 分钟，在 95 摄氏度下使用 5 分钟，以灭活逆转录酶。合成后用60微升水稀释cDNA。在最终浓度为10微摩尔、5微升的SYBR绿色和4微升的cDNA时，每个前进和反向底剂含有0.5微升的管的运行聚合酶链反应。最后选择在DMEM中的Jurkat-dCas9细胞，辅以海霉素B10天。向下旋转细胞，每三天更换一次介质。净化 RNAse 并转到 RT-qPCR。在这项研究中，gRNA序列在10至100个碱基对内，远离转录开始位点，用于将Cas9激活复合物定向到 IFNG-AS1 的转录位点，这是一种与炎症性肠病相关的长非编码RNA。为了能够选择双传感器，使用双质粒系统将dCas9或gRNAse增强剂转换到细胞中。在这里，MS2蛋白质可增强 IFNG-AS1 的过表达。已确认两个克隆的 Cas9 表达式。针对 HPRT1 的引土用于确认非转导细胞中存在 RNA。mRNA表达通过省略cDNA反应中的逆转录酶得到确认。IFNG-AS1 的三个拼接变体可以通过特定于脚本的底像集或针对所有已知 IFNG-AS1 转录的底转集检测。所有荧光曲线都是指数的，内务基因HPRT1在控制和 IFNG-AS1 gRNA 表达细胞之间的半周期内达到指数相。所有已知 IFNG-AS1 转录的底片在实验之间检测最多，IFNG-AS1 表达的测量结果增加了 20 倍。然而，IFNG-AS1的第三份记录显示，IFNG-AS1水平显著增加了5至10倍。为了积极过度表达你想要的基因，在步骤2.1中设计指南RNA对于协议的成功至关重要。此外，高质量的病毒颗粒的产生将确保协议组件的稳健表达。一旦所需的基因被过度表达，可以进行功能研究来研究基因机制。在我们的示例中，我们选择在过度表达我们感兴趣的基因后查看细胞因子的产生。该技术最初由格里斯巴赫集团于2013年开发，并已被其他集团广泛应用和阐述。我们很高兴地将这种技术应用于长非编码的RNA，以探索它们的特定功能。复制缺陷的扁病毒应在已被批准用于病毒工作的实验室中处理。此外，人类细胞系和大肠杆菌被认为是生物危害。最后，重组DNA质粒应由训练有素的工作人员处理。

Research

JoVE Journal

Genetics

Sequence-specific and Selective Recognition of Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs by Chemically Modified Peptide Nucleic Acids

化学修饰肽核酸对单链 rna 双链 rna 的序列特异和选择性识别

RNAs are emerging as important biomarkers and therapeutic targets. Thus, there is great potential in developing chemical probes and therapeutic ligands ...

科研

遗传学

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

Metabolic Labeling and Profiling of Transfer RNAs Using Macroarrays

使用 Macroarrays 的转移 rna 的代谢标记和剖面分析

Transfer RNAs (tRNA) are abundant short non-coding RNA species that are typically 76 to 90 nucleotides in length. tRNAs are directly responsible for ...

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

利用 CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins 快速简便地生成线虫基因组点突变体的管道

The clustered regularly interspersed palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (Cas9) prokaryotic adaptive immune defense system has been ...

Dissection of Enhancer Function Using Multiplex CRISPR-based Enhancer Interference in Cell Lines

基于多重 CRISPR 增强器的细胞系干扰增强功能解剖

Multiple enhancers often regulate a given gene, yet for most genes, it remains unclear which enhancers are necessary for gene expression, and how these ...

CRISPR Guide RNA Cloning for Mammalian Systems

哺乳动物系统 CRISPR 指南 RNA 克隆

The outlined protocol describes streamlined methods for the efficient and cost-effective generation of Cas9-associated guide RNAs. Two alternative ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9 诱导人多潜能干细胞内源蛋白标记的应用

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas

利用 Crispr-ca 在哺乳动物细胞系中进行基因组编辑

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) system functions naturally in bacterial adaptive immunity, but has been ...

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

使用CRISPR/Cas9系统将基因挖空直接引入锥虫瘤的肌瘤阶段

Trypanosoma cruzi is a pathogenic protozoan parasite that causes Chagas&#8217; disease mainly in Latin America. In order to identify a novel drug target ...