Name: overexpressing long noncoding rnas using gene-activating crispr
Uploaded: 2019-03-01T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Overexpressing Long Noncoding RNAs Using Gene-activating CRISPR at JoVE.com

C.P. understøttes af RO1 DK60729 og P30 DK 41301-26. D.P. understøttes af en Crohns & Colitis Foundation (CCFA) karriere udvikling award, kur: fordøjelsessystemet sygdomme Research Center (Morsø) DK41301, og UCLA klinisk og translationel Science Institute (CTSI) UL1TR0001881. UCLA virologi core blev finansieret af Center for AIDS Research (CFAR) give 5P 30 AI028697. Den UCLA integreret Molekylær teknologier core blev støttet af kur/P30 give DK041301. Dette arbejde blev også støttet af UCLA AIDS Institute.

Bemærk: Det er vigtigt at bemærke, at denne protokol bruger replikation-mangelfuld lentiviruses. Udføre viral håndtering kun efter passende lab sikkerhedsuddannelse. Bleach alle genstande og overflader, der kommer i kontakt med levende vira i mindst 10 min efter håndtering. Brug en engangs lab coat og ansigt/øjne beskyttelse, samt dobbelt handsker på alle tidspunkter. Udføre virus arbejde i biosikkerhed niveau 2 + labs med viral certificering. Dedikere vævskultur hætter og inkubatorer til viral...

<ol>
	<li>Miao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trends+of+long+noncoding+RNA+research+from+2007+to+2016:+a+bibliometric+analysis.">Trends of long noncoding RNA research from 2007 to 2016: a bibliometric analysis.</a> Oncotarget. 8 (47), 83114-83127 (2017).</li><li>Derrien, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+GENCODE+v7+catalog+of+human+long+noncoding+RNAs:+analysis+of+their+gene+structure,+evolution,+and+expression.">The GENCODE v7 catalog of human long noncoding RNAs: analysis of their gene structure, evolution, and expression.</a> Genome Research. 22 (9), 1775-1789 (2012).</li><li>Johnsson, P., Lipovich, L., Grander, D., Morris, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+conservation+of+long+non-coding+RNAs;+sequence,+structure,+function.">Evolutionary conservation of long non-coding RNAs; sequence, structure, function.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1840 (3), 1063-1071 (2014).</li><li>Perez-Pinera, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-guided+gene+activation+by+CRISPR-Cas9-based+transcription+factors.">RNA-guided gene activation by CRISPR-Cas9-based transcription factors.</a> Nature Methods. 10 (10), 973-976 (2013).</li><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity.">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li><li>Maeder, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+RNA-guided+activation+of+endogenous+human+genes.">CRISPR RNA-guided activation of endogenous human genes.</a> Nature Methods. 10 (10), 977-979 (2013).</li><li>Konermann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+transcriptional+activation+by+an+engineered+CRISPR-Cas9+complex.">Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex.</a> Nature. 517 (7536), 583-588 (2015).</li><li>Schmittgen, T. D., Livak, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+real-time+PCR+data+by+the+comparative+C(T)+method.">Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method.</a> Nature Protocols. 3 (6), 1101-1108 (2008).</li><li>Gomez, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NeST+long+ncRNA+controls+microbial+susceptibility+and+epigenetic+activation+of+the+interferon-gamma+locus.">The NeST long ncRNA controls microbial susceptibility and epigenetic activation of the interferon-gamma locus.</a> Cell. 152 (4), 743-754 (2013).</li><li>Padua, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+long+noncoding+RNA+signature+for+ulcerative+colitis+identifies+IFNG-AS1+as+an+enhancer+of+inflammation.">A long noncoding RNA signature for ulcerative colitis identifies IFNG-AS1 as an enhancer of inflammation.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 311 (3), G446-G457 (2016).</li><li>Collier, S. P., Henderson, M. A., Tossberg, J. T., Aune, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+Th1+genomic+locus+from+Ifng+through+Tmevpg1+by+T-bet.">Regulation of the Th1 genomic locus from Ifng through Tmevpg1 by T-bet.</a> Journal of Immunology. 193 (8), 3959-3965 (2014).</li><li>Kotake, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+non-coding+RNA+ANRIL+is+required+for+the+PRC2+recruitment+to+and+silencing+of+p15(INK4B)+tumor+suppressor+gene.">Long non-coding RNA ANRIL is required for the PRC2 recruitment to and silencing of p15(INK4B) tumor suppressor gene.</a> Oncogene. 30 (16), 1956-1962 (2011).</li><li>Gilbert, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Scale+CRISPR-Mediated+Control+of+Gene+Repression+and+Activation.">Genome-Scale CRISPR-Mediated Control of Gene Repression and Activation.</a> Cell. 159 (3), 647-661 (2014).</li><li>Cheng, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+activation+of+endogenous+genes+by+CRISPR-on,+an+RNA-guided+transcriptional+activator+system.">Multiplexed activation of endogenous genes by CRISPR-on, an RNA-guided transcriptional activator system.</a> Cell Research. 23 (10), 1163-1171 (2013).</li><li>Matouskova, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reference+genes+for+real-time+PCR+quantification+of+messenger+RNAs+and+microRNAs+in+mouse+model+of+obesity.">Reference genes for real-time PCR quantification of messenger RNAs and microRNAs in mouse model of obesity.</a> PLoS One. 9 (1), e86033 (2014).</li></ol>

Dette manuskript præsenterer en protokol for at bruge aktivering CRISPR til overexpress lncRNAs in vitro. Dette er en specielt vigtig teknik, når man studerer længe noncoding RNA'er som transkriptom produkt er den funktionelle enhed. Efter overekspression, kan forskeren derefter bruge disse celler at øge signal / støj-forhold, når man studerer bindende partnere og endda måle cellulære konsekvenserne af øget niveauer af lncRNAs. Derudover som lncRNAs ofte handle på cis-gener, muliggør denne endogene overekspres...

Mens mest biomedicinsk forskning har fokuseret på protein-kodning afskrifter, består fleste af transskriberede gener faktisk af noncoding RNA'er (Ensembl release 93). Aktuel forskning er begyndt at udforske dette område med antallet af publikationer om lncRNAs i sygdomsprocesser stiger eksponentielt mellem 2007 og 20171. Disse publikationer viser, at mange lncRNAs er forbundet med sygdommen. De molekylære mekanismer af disse lncRNAs er dog svært at studere på grund af deres forskellige funktioner i forhold til mRNAs. Compounding problemet med oplysninger om betydningen af lncRNAs i sygdom, udtrykkes lncRNAs ofte på et lavere niveau end kodning RNA'er2. Derudover er lncRNAs dårligt bevaret, hvilket begrænser de funktionelle undersøgelser i human-celle-linje-baserede teknikker3. En metode til at studere mekanismen i disse roman gener er at endogent overexpress dem i kulturperler celler. Overekspression undersøgelser kan indeholde vigtige oplysninger om funktionen af specifikke gener og aktiverer forskere at dissekere centrale molekylære veje.
En ny metode til at aktivere omskrivning af lncRNA gener er baseret på CRISPR teknologi udviklet i starten af Gersbach laboratorium4. Denne protokol er blevet tilpasset til brug i lncRNA biologi og til udtryk for disse gener i andre modelsystemer. I CRISPR overekspression teknik, kan et protein kaldet CRISPR-forbundet protein 9 (Cas9) være rettet mod en DNA sekvens via en antisense gRNA, der genkendes af Cas9. Normalt, vil Cas9 fremkalde DNA kavalergang; men mutationer i Cas9, tidligere udviklet til overekspression teknik, deaktivere dette trin5. Når en transcriptional aktivator er sammenvoksede til en "død" Cas9 (dCas9) og transduced i cellelinjer, den endogene overekspression af lncRNAs kan være opnåede4,6. Tilføjelse af yderligere ændringer til gRNA, muliggør yderligere transcriptional faktorer til at binde til gRNA, øget effektivitet af dCas9 gen aktivisering ordning 10-fold7. Vigtigere, blev det påvist, at transcriptional aktivering kræver nærhed (< 200 bp) at det transkriptionel starte site gener, gør det muligt for en specifik Opregulering i gen-rige områder7. I modsætning til CRISPR knockout teknologier skal dCas9 og gRNA kassetter integreres i genom til cellerne til at bevare en overekspression over flere generationer. En metode til at opnå dette er at bruge lentiviruses til at integrere der indeholder dCas9 og gRNA kassetter. Efter integrationen, kan lncRNA Gen-ekspression bestemmes.
I denne artikel, vil blive demonstreret en protokol for lncRNA overekspression i en Jurkat T-celle model. En trinvis procedure er vist og kan også tilpasses vedhængende celler.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:837px;" width="837">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:245px;">Ampicillin</td>
			<td style="width:195px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:195px;">BP1760-5</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">CaCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:195px;">C1016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">cDNA synthesis kit (iScript)</td>
			<td style="width:195px;">BioRad</td>
			<td>1708891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">dCas9 forward primer</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:195px;">n/a</td>
			<td>5&#39;-TCGCCACAGCATAAAGAAGA&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">dCas9 reverse primer</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:195px;">n/a</td>
			<td>5&#39;-CTTTTCATGGTACGCCACCT</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">dCas9 vector</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:195px;">50918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM</td>
			<td>Corning</td>
			<td style="width:195px;">10013CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Ethanol</td>
			<td style="width:195px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:195px;">61509-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FBS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">gRNA plasmid</td>
			<td>VectorBuilder</td>
			<td style="width:195px;">VB180119-1195qxv</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEK293T cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td style="width:195px;">&#160;CRL-1573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:195px;">H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HPRT1 forward primer</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:195px;">n/a</td>
			<td>GACCAGTCAACAGGGGACAT&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HPRT1 reverse primer</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:195px;">n/a</td>
			<td>GCTTGCGACCTTGACCATCT</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hygromycin B</td>
			<td>Corning</td>
			<td style="width:195px;">MT3024CR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Isopropanol</td>
			<td style="width:195px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:195px;">BP2618-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Jurkat cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td style="width:195px;">&#160;TIB-152</td>
			<td style="width:203px;">clone E6-1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-glutamine</td>
			<td>Corning</td>
			<td style="width:195px;">25005Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LB agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1425-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LB broth</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1426-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Maxi-prep kit (Plasmid Purification Kit)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td style="width:195px;">12362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Na2HPO4</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:195px;">NIST2186II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Optimem I reduced serum media&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:195px;">31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">p24 elisa</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td style="width:195px;">NEK050B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">PBS</td>
			<td style="width:195px;">Corning</td>
			<td style="width:195px;">21-040-CMR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin and Streptomycin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pMDG2.G</td>
			<td>Addgene &#160;</td>
			<td style="width:195px;">#12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pMDLg/pRRE</td>
			<td>Addgene&#160;</td>
			<td style="width:195px;">#60488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Poly-L-Lysine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:195px;">P-4832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Polybrene</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td style="width:195px;">TR-1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pRSV-REV</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:195px;">#12253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Puromycin dihydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:195px;">P8833</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNA purification kit (Aurum RNA mini)</td>
			<td style="width:195px;">BioRad</td>
			<td>7326820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Butyrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:195px;">B5887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SYBR green (iTaq universal)</td>
			<td style="width:195px;">BioRad</td>
			<td>1725122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:195px;">X100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

overexpressing long noncoding rnas using gene-activating crispr

Længe noncoding RNA (lncRNA) biologi er et nyt og spændende forskningsfelt, med antallet af publikationer fra feltet vokser eksponentielt siden 2007. Disse undersøgelser har bekræftet, at lncRNAs er ændret i næsten alle sygdomme. Men at studere de funktionelle roller for lncRNAs i forbindelse med sygdom fortsat vanskelig på grund af den manglende proteinprodukter, væv-specifikke udtryk, lavt udtryk niveauer, kompleksiteten i splice former, og af bevarelse blandt arter. Givet den artsspecifikke udtryk, er lncRNA undersøgelser ofte begrænset til menneskelige forskning sammenhænge når man studerer sygdomsprocesser. Da lncRNAs funktion på molekylært niveau, er en måde at dissekere lncRNA biologi enten fjerne lncRNA eller overexpress lncRNA og foranstaltning cellulære virkningerne. I denne artikel præsenteres en skriftlig og visualiseret protokol til overexpress lncRNAs in vitro. Som en repræsentant eksperiment, er en lncRNA, der er associeret med inflammatorisk tarmsygdom, Interferon Gamma antisensstoffer 1 (IFNG-AS1), vist sig at være overexpressed i en Jurkat T-celle model. For at opnå dette, bruges den aktiverende grupperede regelmæssigt interspaced korte palindromiske gentagelser (CRISPR) teknik til at aktivere overekspression på de endogene genomisk loci. Den aktiverende CRISPR teknik mål et sæt af transkriptionsfaktorer til webstedet transcriptional start af et gen, muliggør en robust overekspression af flere lncRNA splice formularer. Denne procedure vil blive opdelt i tre trin, nemlig a guide RNA (gRNA) design og vektor konstruktion, (ii) virus generation og transduktion, og (iii) koloni screening for overekspression. For denne repræsentant eksperiment, en større end 20-fold forbedring i IFNG-AS1 i Jurkat T-celler blev observeret.

En dobbelt vektorsystem til overexpress lncRNA IFNG-AS1 Eksempel eksperiment i dette håndskrift er overekspression af en Jurkat T-celle modelsystem at udtrykke lncRNA IFNG-AS19. IFNG-AS1 er en lncRNA, der er associeret med inflammatorisk tarmsygdom, der er blevet set, at regulere Interferon Gamma10. IFNG-AS1 gen indeholder tre splice varianter, alle bruger det samme transcriptional startstedet (figur...

Watch this Scientific Journal Video about Overexpressing Long Noncoding RNAs Using Gene-activating CRISPR at JoVE.com

Overexpressing Long Noncoding RNAs Using Gene-activating CRISPR

Traditionelle cDNA-baserede overekspression teknikker har en begrænset anvendelighed for overekspression af lange noncoding RNA'er på grund af deres flere splice formularer med potentielle funktionalitet. Denne revision rapporterer en protokol, ved hjælp af CRISPR teknologi til overexpress flere splice varianter af en længe noncoding RNA.

Overekspression længe Noncoding RNA'er ved hjælp af gen-aktivering CRISPR

Long noncoding RNA (lncRNA) biology is a new and exciting field of research, with the number of publications from this field growing exponentially since ...

Ikke-kodning RNA'er har ofte flere isoformer. I in vitro overekspressionsundersøgelser er det ofte vanskeligt at studere alle disse udtrykte isoformer. Denne teknik giver brugerne mulighed for at udlede udtryk direkte fra genomet og gøre det muligt for cellerne at udtrykke de endogene isoformer for et bestemt ikke-kodnings-RNA.Denne kraftfulde teknik giver brugeren mulighed for specifikt at lede ekspressionen af ethvert gen i genomet med troskab og nøjagtighed. Ved at designe guide RNA'er til specifikke gener, er man i stand til at bruge den endogene gensplejsningsmaskiner til at udtrykke de naturlige isoformer i en given celle. Demonstration af proceduren vil være Robert Rankin, en post-doc fra mit laboratorium.For at designe guide RNA sekvens, som er placeret inden for 100 base par af transskriptionelle startstedet, bruge genetiske databaser såsom BLAT for at sikre, at vejledningen RNA er unik for genet af interesse. Opbevar guide RNA og de deaktiverede Cas9 plasmider ved fire grader Celsius. Streak ud E.coli på en Luria bouillon agar plade med ampicillin og vokse bakterier natten over ved 37 grader Celsius.Den næste dag, vælge en koloni og dyrke bakterier i fem milliliter LB med ampicillin natten over, kraftigt ryster røret i en 37-graders Celsius inkubator. Den næste dag, tilsæt to milliliter bakterier til 200 milliliter LB med ampicillin i en to-liters kolbe, kraftigt ryster kolben natten over i en 37-graders Celsius inkubator. Spin ned bakterierne på 3, 724 gange g i 20 minutter og gå videre til DNA rensning.For at skabe dCas9-holdige lentivirus, første lag 100-milliliter væv kultur retter med fem milliliter 0,01% Poly-L-lysin og plade fem millioner HEK293T celler pr fad i 10 milliliter komplet Dulbecco's Modified Eagles Medium, derefter forberede DNA transfektion prøver ved at blande 10 mikrogram af en LTR-holdige guide RNA vektor eller en LTR-holdige deaktiveret Cas9 vektor med plasmider, der indeholder komponenter af virus. Tilsæt vand til et samlet volumen på 450 mikroliter og filtre blandingen gennem en 0,2-mikron filterspids fastgjort til en sprøjte. Dernæst tilsættes 50 mikroliter af 2,5-molar calciumdichlorid til hver transfection prøve af DNA og bland forsigtigt.Filter calcium-DNA blandingen gennem en 0,2-mikron filter spids fastgjort til en sprøjte. Pipette 500 mikroliter 2X HBS i et fem milliliter polystyrenrør. Tilsæt 500 mikroliter af calcium-DNA blandingen dropwise og forsigtigt vortex.Inkuber ved stuetemperatur i tre minutter. Tilføj en milliliter af DNA-calcium HBS suspension til hver HEK293T-holdige væv kultur fad og inkubere dem i en 5% kuldioxid inkubator ved 37 grader Celsius natten over. På dag tre skal du langsomt fjerne og kassere mediet fra opvasken.Vask omhyggeligt cellerne med PBS én gang. Der tilsættes seks milliliter komplet DMEM suppleret med 20-millimolar HEPES og 10-millimolar natrium butyrat. Derefter inkuberes cellerne i en 5% kuldioxid inkubator ved 37 grader Celsius i fem til seks timer.Efter inkubationen vaskes cellerne med PBS én gang, og der tilsættes fem milliliter komplet DMEM med 20 millimolar HEPES til HEK293T-cellerne. Inkuber cellerne i en 5% kuldioxid inkubator ved 37 grader Celsius i 12 timer. På dag fire, indsamle HEK293T celle supernatants og filtrere supernatant indeholder virus.For at begynde viruspartikeltællingerne fortyndes vaskekoncentratet fra P24 ELISA-sættet ved at tilsætte 19 dele destilleret, deioniseret vand. Derefter fortyndes den positive kontrol fra dette kit til 200 nanogram pr. milliliter ved hjælp af RPMI 1640 som fortyndingstyndingsmateriale, og der foretages fortyndinger for en standardkurve i 1,5 milliliterrør i henhold til P24 ELISA-fortyndingstabellen. For at måle koncentrationen af virus i prøverne tilsættes prøvefortyndingerne til de udpegede brønde på en 96-brøndplade fra kl.Derefter fortyndes prøverne med Triton X-100 til en endelig koncentration på 0,5%, og der tilsættes 200 mikroliter af hver prøve og RPMI 1640 til de udpegede brønde. Forsegle pladen og inkubere den ved 37 grader Celsius i to timer. Vask pladen med 300 mikroliter pr. brønd af 1X vaskepude seks gange.Fjern eventuel overskydende væske ved at vende pladen og banke den på en køkkenrulle. Derefter tilsættes 100 mikroliter af detektor antistof fra sættet til alle brønde undtagen substrat blank. Forsegle pladen og inkubere den ved 37 grader Celsius i en time.Vask pladen og fjern derefter overskydende væske ved at vende pladen og banke den på en køkkenrulle. For at måle detektorantistoffet fortyndes streptavidin peberrodsperoxidase ved 1:100 fortynding med SA-HRP fortyndingsmiddel. Bland den fortyndede SA-HRP grundigt og tilsæt 100 mikroliter til alle brønde undtagen det tomme.Pladen forsegles og inkuberes ved stuetemperatur i 30 minutter. Vask derefter pladen med 1X vaskebufferen, og bank overskydende væske væk. Drop en ortho-phenylenediamine tablet i 11 milliliter af substrat fortyndingstyndingstyndingsan for at gøre nok substrat opløsning til en plade.Vortex OPD-opløsningen skal opløses fuldstændigt og beskyttes mod lys. Tilføj 100 mikroliter OPD substrat opløsning til alle brønde, herunder den tomme. Ved hjælp af et spektrofotometer, aflæs absorbans ved 450 nanometer straks.Gentag 10 gange med et sekunds intervaller, og tag den gennemsnitlige måling. Resuspend og kultur Jurkat T-celler i en T75 kolbe med en masse tæthed på en million celler i fem milliliter af det reducerede serummedie med polybren. Derefter tilsættes HEK293T-betingede medier, der indeholder en million dCas9-holdige viruspartikler.Inkuber cellerne ved 37 grader Celsius med 5% kuldioxid. Tre dage efter infektion, spin ned cellerne på 233 gang g i fem minutter og resuspend dem i 10 milliliter komplet DMEM suppleret med puromycin. Cellerne dyrkes i T75-kolber og inkuberes ved 37 grader Celsius med 5 % kuldioxid.Hver tredje dag i en periode på ni dage, spin ned cellerne på 233 gange g i fem minutter og erstatte medierne med den komplette DMEM suppleret med puromycin. Tæl cellerne ved hjælp af et hæmocytometer eller en automatiseret celletæller. Derefter, på en 96-brønd plade med væv kultur-behandlet væv, tilsæt 10,000 celler i 100 mikroliter af den komplette DMEM suppleret med puromycin i den første brønd.Lav 1:1 serielle fortyndinger af indholdet af følgende brønde med den komplette DMEM suppleret med puromycin. Inkuber cellerne ved 37 grader Celsius med 5% kuldioxid. Udvid klonceller i to 24-brønds plader, derefter plade to millioner celler pr brønd af en seks-brønd plade til tre af klonerne.Plade de tre andre brønde med ikke-transduced Jurkat celler som kontrol. Endelig plade cellerne i en T75 kolbe og sætte cellerne i en cellekultur inkubator natten over. For at begynde kvantitativ PCR til at måle genekspression, først syntetisere supplerende DNA ved at tilføje et mikrogram RNA, fire mikroliter af cDNA syntese buffer, og en mikroliter af omvendt transskription til 250 mikroliter rør, derefter tilføje vand til en endelig volumen på 20 mikroliter.Brug derefter en termisk cycler ved 42 grader Celsius i 30 minutter og ved 95 grader Celsius i fem minutter for at inaktivere den omvendte transskription. CDNA fortyndes med 60 mikroliter vand efter syntesen. Kør polymerasekædereaktioner for rør, der indeholder 0,5 mikroliter af hver fremad- og bakprimer ved den endelige koncentration af 10 mikromolar, fem mikroliter SYBR grøn og fire mikroliter cDNA.Endelig skal du vælge Jurkat-dCas9 celler i DMEM suppleret med Hygromycin B i 10 dage. Spin ned cellerne og ændre medierne hver tredje dag. Rens RNAse og fortsæt til RT-qPCR.I denne undersøgelse blev gRNA-sekvenser, der var inden for 10 til 100 basepar væk fra det transskriptionelle startsted, brugt til at lede Cas9-aktiverende kompleks til den transskriptionelle locus af IFNG-AS1, en lang noncoding RNA forbundet med inflammatorisk tarmsygdom. For at gøre det muligt at vælge dobbelt transduced celler, en to-plasmid system blev brugt til at transduce enten dCas9 eller gRNAse smagsforstærkere i celler. Her MS2 proteiner forbedre overekspression af IFNG-AS1.Cas9-udtrykket blev bekræftet for begge kloner. Primere mod HPRT1 blev brugt til at bekræfte tilstedeværelsen af RNA i de ikke-transucerede celler. mRNA-udtrykket blev bekræftet ved at udelade den omvendte transskription fra cDNA-reaktionen.Tre splejse varianter af IFNG-AS1 kunne påvises med enten udskrift-specifikke primer sæt eller en primer sat mod alle kendte IFNG-AS1 udskrifter. Alle fluorescenskurver var eksponentielle, da rengøringsgenet HPRT1 nåede den eksponentielle fase inden for en halv cyklus mellem kontrol og IFNG-AS1 gRNA-ekspresserende celler. Primere mod alle kendte IFNG-AS1 udskrifter var de mest påviselige mellem eksperimenter, med målinger af 20-fold stigninger i IFNG-AS1 udtryk.Men den tredje udskrift af IFNG-AS1 viste en fem-til 10-fold betydelig stigning i IFNG-AS1 niveauer. For aktivt at overudse dit ønskede gen er design af guideRNA i trin 2.1 afgørende for protokollens succes. Derudover vil produktionen af virale kvalitetspartikler sikre et robust udtryk for dine protokolkomponenter.Når det ønskede gen er overudtrykt, kan der udføres funktionelle undersøgelser for at undersøge genmekanismerne. I vores eksempel valgte vi at se på cytokinproduktion efter overekspression af vores gen af interesse. Denne teknik blev oprindeligt udviklet af Griesbach-gruppen i 2013 og er blevet anvendt bredt og uddybet af andre grupper.Vi var glade for at anvende denne teknik til lange ukodede RNA'er for at udforske deres specifikke funktioner. Replikationsstærte lentivirus skal håndteres i et laboratorium, der er godkendt til viralt arbejde. Derudover, menneskelige cellelinjer og E.coli bakterier betragtes biologiske.Endelig bør rekombinant DNA plasmider håndteres af uddannet personale.

Research

JoVE Journal

Genetics

Sequence-specific and Selective Recognition of Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs by Chemically Modified Peptide Nucleic Acids

Sekvens-specifikke og selektiv anerkendelse af dobbelt-strenget RNA'er over enkeltstrenget RNA'er af kemisk modificerede peptid nukleinsyrer

RNAs are emerging as important biomarkers and therapeutic targets. Thus, there is great potential in developing chemical probes and therapeutic ligands ...

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-medieret målrettede Integration In Vivo ved hjælp af en homologi-medieret End at deltage-baseret strategi

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

Metabolic Labeling and Profiling of Transfer RNAs Using Macroarrays

Metaboliske mærkning og profilering af overførsel RNA'er ved hjælp af Macroarrays

Transfer RNAs (tRNA) are abundant short non-coding RNA species that are typically 76 to 90 nucleotides in length. tRNAs are directly responsible for ...

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

En hurtig og letkøbt Pipeline for generering af genomisk punkt mutanter i C. elegans bruger CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

The clustered regularly interspersed palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (Cas9) prokaryotic adaptive immune defense system has been ...

Dissection of Enhancer Function Using Multiplex CRISPR-based Enhancer Interference in Cell Lines

Dissektion af Enhancer funktion ved hjælp af Multiplex CRISPR-baserede forstærker interferens i cellelinjer

Multiple enhancers often regulate a given gene, yet for most genes, it remains unclear which enhancers are necessary for gene expression, and how these ...

CRISPR Guide RNA Cloning for Mammalian Systems

CRISPR Guide RNA kloning for pattedyr systemer

The outlined protocol describes streamlined methods for the efficient and cost-effective generation of Cas9-associated guide RNAs. Two alternative ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

Endogene Protein Tagging i menneskelige induceret pluripotente stamceller ved hjælp af CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas

Genom-redigering i pattedyr cellelinjer ved hjælp af CRISPR-Cas

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) system functions naturally in bacterial adaptive immunity, but has been ...

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

Introduktion af et gen knockout direkte i den Amastigote fase af Trypanosoma cruzi ved hjælp af Crispr/Cas9 system

Trypanosoma cruzi is a pathogenic protozoan parasite that causes Chagas&#8217; disease mainly in Latin America. In order to identify a novel drug target ...