Name: overexpressing long noncoding rnas using gene-activating crispr
Uploaded: 2019-03-01T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Overexpressing Long Noncoding RNAs Using Gene-activating CRISPR at JoVE.com

C.P. wordt ondersteund door RO1 DK60729 en P30 DK 41301-26. D.P. wordt ondersteund door een ziekte van Crohn & Colitis Foundation (CCFA) carrière ontwikkeling award, CURE: spijsvertering ziekten Research Center (DDRC) DK41301, en UCLA klinisch en translationeel Science Institute (CTSI) UL1TR0001881. De kern van de virologie UCLA werd gefinancierd door het centrum van AIDS onderzoek (BVERRE) 5P 30 AI028697 verlenen. De UCLA geïntegreerde moleculaire technologieën kern werd gesteund door CURE/P30 verlenen DK041301. Dit werk werd ook ondersteund door het AIDS-Instituut van UCLA.

Opmerking: Het is belangrijk op te merken dat dit protocol wordt gebruikt voor replicatie-deficiënte lentivirussen. Virale behandeling slechts na juiste lab veiligheidstraining uitvoeren Bleekmiddel alle items en oppervlakken die in contact met levende virussen voor een minimum van 10 min na behandeling komen. Gebruik een wegwerp lab jas en gezicht/oog bescherming, alsmede dubbele handschoenen, te allen tijde. Virus werk uitvoeren in bioveiligheid niveau 2 + laboratoria met virale certificering. Weefsel...

<ol>
	<li>Miao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trends+of+long+noncoding+RNA+research+from+2007+to+2016:+a+bibliometric+analysis.">Trends of long noncoding RNA research from 2007 to 2016: a bibliometric analysis.</a> Oncotarget. 8 (47), 83114-83127 (2017).</li><li>Derrien, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+GENCODE+v7+catalog+of+human+long+noncoding+RNAs:+analysis+of+their+gene+structure,+evolution,+and+expression.">The GENCODE v7 catalog of human long noncoding RNAs: analysis of their gene structure, evolution, and expression.</a> Genome Research. 22 (9), 1775-1789 (2012).</li><li>Johnsson, P., Lipovich, L., Grander, D., Morris, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+conservation+of+long+non-coding+RNAs;+sequence,+structure,+function.">Evolutionary conservation of long non-coding RNAs; sequence, structure, function.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1840 (3), 1063-1071 (2014).</li><li>Perez-Pinera, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-guided+gene+activation+by+CRISPR-Cas9-based+transcription+factors.">RNA-guided gene activation by CRISPR-Cas9-based transcription factors.</a> Nature Methods. 10 (10), 973-976 (2013).</li><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity.">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li><li>Maeder, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+RNA-guided+activation+of+endogenous+human+genes.">CRISPR RNA-guided activation of endogenous human genes.</a> Nature Methods. 10 (10), 977-979 (2013).</li><li>Konermann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+transcriptional+activation+by+an+engineered+CRISPR-Cas9+complex.">Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex.</a> Nature. 517 (7536), 583-588 (2015).</li><li>Schmittgen, T. D., Livak, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+real-time+PCR+data+by+the+comparative+C(T)+method.">Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method.</a> Nature Protocols. 3 (6), 1101-1108 (2008).</li><li>Gomez, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NeST+long+ncRNA+controls+microbial+susceptibility+and+epigenetic+activation+of+the+interferon-gamma+locus.">The NeST long ncRNA controls microbial susceptibility and epigenetic activation of the interferon-gamma locus.</a> Cell. 152 (4), 743-754 (2013).</li><li>Padua, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+long+noncoding+RNA+signature+for+ulcerative+colitis+identifies+IFNG-AS1+as+an+enhancer+of+inflammation.">A long noncoding RNA signature for ulcerative colitis identifies IFNG-AS1 as an enhancer of inflammation.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 311 (3), G446-G457 (2016).</li><li>Collier, S. P., Henderson, M. A., Tossberg, J. T., Aune, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+Th1+genomic+locus+from+Ifng+through+Tmevpg1+by+T-bet.">Regulation of the Th1 genomic locus from Ifng through Tmevpg1 by T-bet.</a> Journal of Immunology. 193 (8), 3959-3965 (2014).</li><li>Kotake, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+non-coding+RNA+ANRIL+is+required+for+the+PRC2+recruitment+to+and+silencing+of+p15(INK4B)+tumor+suppressor+gene.">Long non-coding RNA ANRIL is required for the PRC2 recruitment to and silencing of p15(INK4B) tumor suppressor gene.</a> Oncogene. 30 (16), 1956-1962 (2011).</li><li>Gilbert, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Scale+CRISPR-Mediated+Control+of+Gene+Repression+and+Activation.">Genome-Scale CRISPR-Mediated Control of Gene Repression and Activation.</a> Cell. 159 (3), 647-661 (2014).</li><li>Cheng, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+activation+of+endogenous+genes+by+CRISPR-on,+an+RNA-guided+transcriptional+activator+system.">Multiplexed activation of endogenous genes by CRISPR-on, an RNA-guided transcriptional activator system.</a> Cell Research. 23 (10), 1163-1171 (2013).</li><li>Matouskova, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reference+genes+for+real-time+PCR+quantification+of+messenger+RNAs+and+microRNAs+in+mouse+model+of+obesity.">Reference genes for real-time PCR quantification of messenger RNAs and microRNAs in mouse model of obesity.</a> PLoS One. 9 (1), e86033 (2014).</li></ol>

Dit manuscript presenteert een protocol voor het gebruik van het activeren van CRISPR voor overexpress lncRNAs in vitro. Dit is een bijzonder belangrijk techniek bij de studie van lange noncoding RNAs zoals het transcriptomic product de functionele eenheid is. Na overexpressie, de onderzoeker, dan kunt deze cellen te verhogen van de signaal-/ ruisverhouding bij de studie van bindende partners en zelfs het meten van de cellulaire gevolgen van lncRNAs wordt verbeterd. Daarnaast zoals lncRNAs vaak over cis-genen handelen, m...

Terwijl de meest biomedisch onderzoek is gericht op eiwit-codeert transcripten, bestaat de meerderheid van de getranscribeerde genen eigenlijk uit noncoding RNAs (Ensembl versie 93). Huidige onderzoek begint te verkennen van dit gebied, met het aantal publicaties over lncRNAs in ziekteprocessen stijgt exponentieel tussen 2007 en 20171. Deze publicaties tonen aan dat veel lncRNAs geassocieerd met de ziekte zijn. De moleculaire mechanismen van deze lncRNAs zijn echter moeilijk te studeren als gevolg van hun verschillende functies in vergelijking met mRNAs. Compounding het probleem van het begrip van de rol van lncRNAs in ziekte, worden lncRNAs vaak uitgedrukt op lagere niveaus dan codering RNAs2. Bovendien zijn lncRNAs slecht bewaard, waardoor de functionele studies in de mens-cel-regel-gebaseerde technieken3beperkt. Eén methode om te studeren het mechanisme van deze nieuwe genen is endogeen overexpress hen in gekweekte cellen. Overexpressie studies kunnen belangrijke informatie verschaffen over de functie van specifieke genen en onderzoekers te ontleden belangrijke moleculaire pathways inschakelen.
Een nieuwe methode voor het activeren van de transcriptie van lncRNA genen is gebaseerd op CRISPR technologieën ontwikkeld in eerste instantie door de Gersbach laboratorium4. Dit protocol is aangepast voor gebruik in de biologie van de lncRNA en voor de uitdrukking van deze genen in andere modelsystemen. In de CRISPR overexpressing techniek, kan vallen proteïnen aan genaamd CRISPR-geassocieerde proteïne 9 (Cas9) worden omgeleid naar een DNA-sequentie via een antisense gRNA die door Cas9 wordt herkend. Normaal, Cas9 zal het induceren van DNA splitsingsproducten; echter deactiveren mutaties in Cas9, eerder ontwikkeld voor de overexpressie techniek, deze stap5. Wanneer een transcriptionele activator is gesmolten tot een "dode" Cas9 (dCas9) en getransduceerde in cellijnen, de endogene overexpressie van lncRNAs kan worden bereikt4,6. De toevoeging van extra wijzigingen in de gRNA, waardoor extra transcriptionele factoren te binden aan de gRNA, steeg de werkzaamheid van de activeringssysteem van de dCas9-gen 10-fold7. Nog belangrijker is, het werd aangetoond dat transcriptionele activering nabijheid vereist (< 200 bp) naar de transcriptionele start site genen, waardoor een specifieke opregulatie in gen-rijke gebieden7. In tegenstelling tot CRISPR knock-out technologieën moeten dCas9 en gRNA cassettes worden geïntegreerd in het genoom te voorzien in cellen behouden een overexpressie over meerdere generaties. Een methode om dit te bereiken is het gebruik van lentivirussen te integreren van de dCas9 - en gRNA-bevattende cassettes. Na de integratie, kan de genexpressie lncRNA worden bepaald.
In dit artikel, zal een protocol voor lncRNA overexpressie in een Jurkat T-cel-model worden aangetoond. Een stapsgewijze procedure weergegeven en kan ook worden aangepast naar Adherente cellen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:837px;" width="837">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:245px;">Ampicillin</td>
			<td style="width:195px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:195px;">BP1760-5</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">CaCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:195px;">C1016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">cDNA synthesis kit (iScript)</td>
			<td style="width:195px;">BioRad</td>
			<td>1708891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">dCas9 forward primer</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:195px;">n/a</td>
			<td>5&#39;-TCGCCACAGCATAAAGAAGA&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">dCas9 reverse primer</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:195px;">n/a</td>
			<td>5&#39;-CTTTTCATGGTACGCCACCT</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">dCas9 vector</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:195px;">50918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM</td>
			<td>Corning</td>
			<td style="width:195px;">10013CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Ethanol</td>
			<td style="width:195px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:195px;">61509-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FBS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">gRNA plasmid</td>
			<td>VectorBuilder</td>
			<td style="width:195px;">VB180119-1195qxv</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEK293T cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td style="width:195px;">&#160;CRL-1573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:195px;">H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HPRT1 forward primer</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:195px;">n/a</td>
			<td>GACCAGTCAACAGGGGACAT&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HPRT1 reverse primer</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:195px;">n/a</td>
			<td>GCTTGCGACCTTGACCATCT</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hygromycin B</td>
			<td>Corning</td>
			<td style="width:195px;">MT3024CR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Isopropanol</td>
			<td style="width:195px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:195px;">BP2618-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Jurkat cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td style="width:195px;">&#160;TIB-152</td>
			<td style="width:203px;">clone E6-1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-glutamine</td>
			<td>Corning</td>
			<td style="width:195px;">25005Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LB agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1425-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LB broth</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1426-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Maxi-prep kit (Plasmid Purification Kit)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td style="width:195px;">12362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Na2HPO4</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:195px;">NIST2186II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Optimem I reduced serum media&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:195px;">31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">p24 elisa</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td style="width:195px;">NEK050B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">PBS</td>
			<td style="width:195px;">Corning</td>
			<td style="width:195px;">21-040-CMR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin and Streptomycin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pMDG2.G</td>
			<td>Addgene &#160;</td>
			<td style="width:195px;">#12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pMDLg/pRRE</td>
			<td>Addgene&#160;</td>
			<td style="width:195px;">#60488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Poly-L-Lysine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:195px;">P-4832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Polybrene</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td style="width:195px;">TR-1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pRSV-REV</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:195px;">#12253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Puromycin dihydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:195px;">P8833</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNA purification kit (Aurum RNA mini)</td>
			<td style="width:195px;">BioRad</td>
			<td>7326820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Butyrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:195px;">B5887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SYBR green (iTaq universal)</td>
			<td style="width:195px;">BioRad</td>
			<td>1725122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:195px;">X100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

overexpressing long noncoding rnas using gene-activating crispr

Lang noncoding RNA (lncRNA) biologie is een nieuwe en spannende gebied van onderzoek, met het aantal publicaties uit dit veld groeien exponentieel sinds 2007. Deze studies hebben bevestigd dat de lncRNAs worden gewijzigd in bijna alle ziekten. Het blijft echter moeilijk te wijten aan het gebrek aan eiwitproducten weefsel-specifieke expressie, lage expressie niveaus, complexiteit in splice vormen, en van behoud onder soorten bestuderen van de functionele rollen voor lncRNAs in het kader van de ziekte. Gezien de soortspecifieke expressie, lncRNA studies zijn vaak beperkt tot menselijk onderzoek contexten bij de studie van ziekteprocessen. Aangezien lncRNAs op moleculair niveau functioneren, is een manier om te ontleden lncRNA biologie te verwijderen van de lncRNA of overexpress van de lncRNA en maatregel cellulaire gevolgen. In dit artikel, wordt een schriftelijke en gevisualiseerde protocol bij lncRNAs in vitro overexpress gepresenteerd. Als een representatieve experiment, is aangetoond dat een lncRNA geassocieerd met inflammatoire darmziekte, Interferon Gamma Antisense 1 (IFNG-AS1), in een Jurkat T-cel-model worden overexpressie. Om dit te bereiken, wordt de activerende geclusterde regelmatig interspaced korte palindromische herhaalt (CRISPR)-techniek gebruikt om overexpressie op de endogene genomic loci. De activerende CRISPR techniek richt zich op een reeks van transcriptiefactoren op de site van transcriptionele start van een gen, waardoor een robuuste overexpressie van meerdere lncRNA splice vormen. Deze procedure zal worden opgesplitst in drie stappen, namelijk (i) gids RNA (gRNA) ontwerp en vector constructie, (ii) virus generatie en transductie en (iii) kolonie screening voor overexpressie. Voor dit representatieve experiment, een groter is dan de verhoging van de 20-fold in IFNG-AS1 in Jurkat T-cellen werd waargenomen.

Een systeem van de dubbele vector te overexpress de lncRNA IFNG-AS1 De voorbeeld-experiment in dit manuscript is de overexpressie van een Jurkat T-cel modelsysteem uiting geven aan de lncRNA IFNG-AS19. IFNG-AS1 is een geassocieerd met inflammatoire darmziekte, die heeft gezien voor het regelen van Interferon Gamma10lncRNA. Het IFNG-AS1 gen bevat drie splice varianten waarmee alle dezelfde transcriptionele start site (<str...

Watch this Scientific Journal Video about Overexpressing Long Noncoding RNAs Using Gene-activating CRISPR at JoVE.com

Overexpressing Long Noncoding RNAs Using Gene-activating CRISPR

Traditionele cDNA gebaseerde overexpressie technieken hebben een beperkte toepasbaarheid voor de overexpressie van lang noncoding RNAs als gevolg van hun meerdere splice formulieren met potentiële functionaliteit. Dit overzicht meldt een protocol gebruiken CRISPR technologie om de overexpress van meerdere varianten van het splitsen van een lang noncoding RNA.

Overexpressing lang Noncoding RNAs met behulp van gen-activeren CRISPR

Long noncoding RNA (lncRNA) biology is a new and exciting field of research, with the number of publications from this field growing exponentially since ...

Niet-codering RNAs hebben vaak meerdere isovormen. In in vitro overexpressiestudies is het vaak moeilijk om al deze uitgedrukte isovormen te bestuderen. Deze techniek stelt gebruikers in staat om expressie rechtstreeks uit het genoom af te leiden en de cellen in staat te stellen de endogene isovormen uit te drukken voor een bepaald niet-coderend RNA.Deze krachtige techniek stelt de gebruiker in staat om specifiek de expressie van elk gen in het genoom met trouw en nauwkeurigheid te sturen. Door het ontwerpen van gids RNAs naar specifieke genen, is men in staat om de endogene gen-splicing machines te gebruiken om de natuurlijke isovormen in een bepaalde cel uit te drukken. Het aantonen van de procedure zal Robert Rankin zijn, een post-doc uit mijn laboratorium.Als u de RNA-reeks voor gids wilt ontwerpen die zich binnen 100 basisparen van de transcriptiestartsite bevindt, gebruikt u genetische databases zoals BLAT om ervoor te zorgen dat de gids RNA uniek is voor het gen van belang. Bewaar de gids RNA en de gedeactiveerde Cas9 plasmids op vier graden Celsius. Streep E.coli uit op een Luria bouillon agar plaat met ampicilline en laat de bacteriën 's nachts groeien bij 37 graden Celsius.De volgende dag, kies een kolonie en groeien de bacteriën in vijf milliliter LB met ampicilline 's nachts, krachtig schudden van de buis in een 37-graden Celsius incubator. De volgende dag, voeg twee milliliter bacteriën tot 200 milliliter LB met ampicilline in een twee-liter fles, krachtig schudden van de fles 's nachts in een 37-graden Celsius incubator. Draai de bacteriën op 3, 724 keer g gedurende 20 minuten en ga naar DNA-zuivering.Om het dCas9-bevattende lentivirus te maken, eerste laag 100 milliliter weefsel kweekschotels met vijf milliliter van 0,01%Poly-L-Lysine en plaat vijf miljoen HEK293T cellen per schotel in 10 milliliter van volledige Dulbecco's Modified Eagles Medium, bereid vervolgens DNA-transfectiemonsters voor door 10 microgram van een LTR-bevattende gidsRNA-vector of een LTR-bevattende gedeactiveerde Cas9-vector met plasmiden die componenten van virussen bevatten te mengen. Voeg water toe aan een totaal volume van 450 microliters en filtreer het mengsel door een filterpunt van 0,2 micron die aan een spuit is bevestigd. Voeg vervolgens 50 microliter van 2,5-molaire calciumdichloride toe aan elk transfectiemonster van het DNA en meng zachtjes.Filtreer het calcium-DNA mengsel door een 0,2-micron filterpunt aan een spuit. Pipette 500 microliter van 2X HBS in een vijf milliliter polystyreenbuis. Voeg 500 microliters van het calcium-DNA mengsel dropwise en voorzichtig vortex.Incubeer bij kamertemperatuur gedurende drie minuten. Voeg een milliliter van de DNA-calcium HBS suspensie toe aan elke HEK293T-bevattende weefselkweekschotel en broed ze 's nachts uit in een 5%koolstofdioxide-incubator bij 37 graden Celsius. Op dag drie, langzaam verwijderen en gooi de media uit de gerechten.Was de cellen een keer voorzichtig met PBS. Voeg zes milliliter complete DMEM aangevuld met 20-millimolar HEPES en 10-millimolar natrium butyraat. Dan incubeer de cellen in een 5%koolstofdioxide incubator op 37 graden Celsius gedurende vijf tot zes uur.Na de incubatie, was de cellen met PBS een keer en voeg vijf milliliter van volledige DMEM met 20-millimolar HEPES aan de HEK293T cellen. Incubeer de cellen in een 5%koolstofdioxide incubator op 37 graden Celsius gedurende 12 uur. Verzamel op dag vier de HEK293T-celsupernatants en filter de supernatant die het virus bevat.Om te beginnen met de virale deeltjes tellingen, eerst verdunnen de wasconcentraat uit de P24 ELISA kit door het toevoegen van 19 delen van gedestilleerd, gedeïsteerd water. Verdun vervolgens de positieve controle van deze kit tot 200 nanogram per milliliter met RPMI 1640 als verdunningsvat en maak verdunningen voor een standaardcurve in 1,5-milliliter buizen volgens de P24 ELISA verdunningstafel. Om de concentratie van het virus in de monsters te meten, voegen u de monsterverdunningen toe aan de aangewezen putten van een 96-bronplaat, te beginnen met de verdunning van 1:1000 en het volume zo nodig aan te passen om binnen het bereik van de standaardcurve te zijn.Verdun vervolgens de monsters met Triton X-100 tot een uiteindelijke concentratie van 0,5% en voeg 200 microliter van elk monster en RPMI 1640 toe aan de aangewezen putten. Verzegel de plaat en broed het twee uur lang uit op 37 graden Celsius. Was de plaat met 300 microliter per put van de 1X wasbuffer zes keer.Verwijder overtollige vloeistof door het omkeren van de plaat en tikken op een papieren handdoek. Voeg vervolgens 100 microliter detectorantilichaam uit de kit toe aan alle putten, behalve het substraat leeg. Verzegel de plaat en broed het een uur lang uit op 37 graden Celsius.Was de plaat en verwijder vervolgens overtollige vloeistof door de plaat om te keren en op een papieren handdoek te tikken. Om het detectorantilichaam te meten, verdun de streptavidin mierikswortelperoxidase bij 1:100 verdunning met SA-HRP verdunningsmiddel. Meng de verdunde SA-HRP grondig en voeg 100 microliter toe aan alle putten behalve de blanco.Verzegel en ontcubeer de plaat op kamertemperatuur gedurende 30 minuten. Was vervolgens de plaat met de 1X wasbuffer en tik overtollige vloeistof weg. Laat een orthofenylenediaminetablet vallen in 11 milliliter van het substraatverwijdingsmiddel om voldoende substraatoplossing voor één plaat te maken.Vortex de OPD oplossing krachtig om het volledig op te lossen en te beschermen tegen licht. Voeg 100 microliter OPD substraatoplossing toe aan alle putten, inclusief de blanco. Met behulp van een spectrofotometer, lees absorptie op 450 nanometer onmiddellijk.Herhaal 10 keer met intervallen van één seconde en neem de gemiddelde meting. Resuspend en cultuur Jurkat T-cellen in een T75 kolf met een dichtheid van een miljoen cellen in vijf milliliter van de verminderde serummedia met polybrene. Voeg dan HEK293T-geconditioneerde media toe die een miljoen dCas9-bevattende virale deeltjes bevatten.Incubeer de cellen op 37 graden Celsius met 5%kooldioxide. Drie dagen na infectie, spin de cellen op 233 tijd g gedurende vijf minuten en resuspend ze in 10 milliliter van volledige DMEM aangevuld met puromycine. Kweek de cellen in T75 kolven en broed ze uit op 37 graden Celsius met 5% kooldioxide.Elke derde dag gedurende een periode van negen dagen, draai de cellen op 233 keer g gedurende vijf minuten en vervang de media door de volledige DMEM aangevuld met puromycine. Tel de cellen met behulp van een hemocytometer of een geautomatiseerde cel teller. Voeg vervolgens op een plaat met 96-bron met weefselkweek behandeld weefsel 10.000 cellen toe in 100 microliters van de volledige DMEM aangevuld met puromycine in de eerste put.Maak 1:1 seriële verdunningen van de inhoud van de volgende putten met de volledige DMEM aangevuld met puromycine. Incubeer de cellen op 37 graden Celsius met 5%kooldioxide. Vouw klooncellen uit in twee platen met 24-bron en zet vervolgens twee miljoen cellen per put van een zesputige plaat voor drie van de klonen.Plaat de andere drie putten met niet-getransduceerde Jurkat cellen als controles. Ten slotte, plaat de cellen in een T75 kolf en zet de cellen in een cel cultuur incubator 's nachts. Om te beginnen kwantitatieve PCR om genexpressie te meten, eerst complementair DNA synthetiseren door een microgram RNA toe te voegen, vier microliters van cDNA synthesebuffer, en een microliter van omgekeerde transcriptase tot 250 microliter buizen, voeg dan water toe aan een laatste volume van 20 microliter.Gebruik vervolgens gedurende vijf minuten een thermische cycler bij 42 graden Celsius en vijf minuten bij 95 graden Celsius om de omgekeerde transcriptie te activeren. Verdun de cDNA met 60 microliter water na de synthese. Voer polymerasekettingreacties uit voor buizen die 0,5 microliter bevatten van elke voorwaartse en omgekeerde primer bij de uiteindelijke concentratie van 10 micromolar, vijf microliters SYBR-groen en vier microliter van cDNA.Selecteer tenslotte Jurkat-dCas9 cellen in DMEM aangevuld met Hygromycine B gedurende 10 dagen. Draai de cellen naar beneden en verander de media om de drie dagen. Zuiver RNAse en ga naar RT-qPCR.In deze studie werden gRNA-sequenties gebruikt die zich binnen 10 tot 100 basisparen verwijderd waren van de transcriptiestartplaats voor het aansturen van het Cas9-activerende complex naar de transcriptie locus van IFNG-AS1, een lang niet-coderend RNA geassocieerd met inflammatoire darmziekte. Om de selectie van dubbele getransduceerde cellen mogelijk te maken, werd een tweeplasmi systeem gebruikt om dCas9- of gRNAse-versterkers om te zetten in cellen. Hier verbeteren MS2-eiwitten de overexpressie van IFNG-AS1.Cas9 uitdrukking werd bevestigd voor beide klonen. Primers tegen HPRT1 werden gebruikt om de aanwezigheid van RNA in de niet-getransduceerde cellen te bevestigen. mRNA-expressie werd bevestigd door het weglaten van de omgekeerde transcriptase van de cDNA-reactie.Drie splice varianten van IFNG-AS1 kunnen worden gedetecteerd met transcript-specifieke primer sets of een primer set tegen alle bekende IFNG-AS1 transcripties. Alle fluorescentiekrommen waren exponentieel met het huishoudensgen HPRT1 dat de exponentiële fase binnen een halve cyclus tussen controle en IFNG-AS1 gRNA-uitdrukkende cellen bereikt. Primers tegen alle bekende IFNG-AS1 transcripties waren de meest detecteerbare tussen experimenten, met metingen van 20-voudige toename van IFNG-AS1 expressie.Echter, de derde transcriptie van IFNG-AS1 toonde een vijf-tot 10-voudige aanzienlijke toename van IFNG-AS1 niveaus. Om uw gewenste gen actief te overexpressen, is het ontwerpen van het gidsRNA in stap 2.1 van cruciaal belang voor het succes van het protocol. Bovendien zorgt de productie van virale deeltjes van hoge kwaliteit voor een robuuste expressie van uw protocolcomponenten.Zodra het gewenste gen is overuitgedrukt, functionele studies kunnen worden uitgevoerd om de genmechanismen te onderzoeken. In ons voorbeeld hebben we ervoor gekozen om te kijken naar cytokine productie na overexpressie van ons gen van belang. Deze techniek werd in 2013 ontwikkeld door de Griesbach Groep en is breed toegepast en uitgewerkt door andere groepen.We waren enthousiast om deze techniek toe te passen op lange niet-gecodeerde RNAs om hun specifieke functies te verkennen. Replicatie-defecte lentivirussen moeten worden behandeld in een laboratorium dat is goedgekeurd voor viraal werk. Bovendien worden menselijke cellijnen en E.coli-bacteriën als biogevaarlijk beschouwd.Ten slotte moet recombinant DNA plasmiden worden behandeld door opgeleid personeel.

Research

JoVE Journal

Genetics

Sequence-specific and Selective Recognition of Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs by Chemically Modified Peptide Nucleic Acids

Volgorde-specifieke en selectieve erkenning van Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs van chemisch gewijzigd Peptide nucleïnezuren

RNAs are emerging as important biomarkers and therapeutic targets. Thus, there is great potential in developing chemical probes and therapeutic ligands ...

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-gemedieerde gerichte integratie In Vivo met behulp van een homologie-gemedieerde einde deelname aan gebaseerde strategie

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

Metabolic Labeling and Profiling of Transfer RNAs Using Macroarrays

Metabole Labeling en profilering van overdracht RNAs met behulp van Macroarrays

Transfer RNAs (tRNA) are abundant short non-coding RNA species that are typically 76 to 90 nucleotides in length. tRNAs are directly responsible for ...

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

Een snelle en Facile pijpleiding voor het genereren van Genomic punt mutanten in C. elegans met behulp van CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

The clustered regularly interspersed palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (Cas9) prokaryotic adaptive immune defense system has been ...

Dissection of Enhancer Function Using Multiplex CRISPR-based Enhancer Interference in Cell Lines

Dissectie van Enhancer functie met behulp van Multiplex CRISPR gebaseerde Enhancer inmenging in cellijnen

Multiple enhancers often regulate a given gene, yet for most genes, it remains unclear which enhancers are necessary for gene expression, and how these ...

CRISPR Guide RNA Cloning for Mammalian Systems

CRISPR gids RNA klonen voor zoogdieren systemen

The outlined protocol describes streamlined methods for the efficient and cost-effective generation of Cas9-associated guide RNAs. Two alternative ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

Endogene eiwit Tagging in mens geïnduceerde pluripotente stamcellen met behulp van CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas

Genoom bewerken in zoogdieren cellijnen met behulp van CRISPR-Cas

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) system functions naturally in bacterial adaptive immunity, but has been ...

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

Introductie van een gen knock-out direct in het Amastigote stadium van Trypanosoma cruzi met behulp van het crispr/Cas9 systeem

Trypanosoma cruzi is a pathogenic protozoan parasite that causes Chagas&#8217; disease mainly in Latin America. In order to identify a novel drug target ...