Name: overexpressing long noncoding rnas using gene-activating crispr
Uploaded: 2019-03-01T15:00:00
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C.P. est pris en charge par DK60729 RO1 et P30 DK 41301-26. D.P. est pris en charge par un Crohn & Colitis Foundation (CCFA) career development award, CURE : centre de recherches des maladies digestives (DDRC) DK41301 et UCLA clinique et translationnelle Science Institute (ILEC) UL1TR0001881. Le noyau de virologie UCLA a été financé par le centre de recherche sida (CFAR) accorder 5P 30 AI028697. Les Technologies intégrées moléculaire de UCLA core a été pris en charge par CURE/P30 accorder DK041301. Ce travail a été également soutenu par l’Institut de sida de UCLA.

Remarque : Il est important de noter que ce protocole utilise des lentivirus réplication déficient. Effectuer la manipulation virale qu’après la formation de sécurité de laboratoire appropriées. Eau de Javel tous les éléments et les surfaces qui entrent en contact avec des virus vivants pendant au moins 10 min après l’avoir manipulé. Utiliser une laboratoire jetables manteau et visage/lunettes de protection, ainsi que des gants doubles, à tout moment. Virus tâches en biosécurité niveau...

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	<li>Miao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trends+of+long+noncoding+RNA+research+from+2007+to+2016:+a+bibliometric+analysis.">Trends of long noncoding RNA research from 2007 to 2016: a bibliometric analysis.</a> Oncotarget. 8 (47), 83114-83127 (2017).</li><li>Derrien, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+GENCODE+v7+catalog+of+human+long+noncoding+RNAs:+analysis+of+their+gene+structure,+evolution,+and+expression.">The GENCODE v7 catalog of human long noncoding RNAs: analysis of their gene structure, evolution, and expression.</a> Genome Research. 22 (9), 1775-1789 (2012).</li><li>Johnsson, P., Lipovich, L., Grander, D., Morris, K. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Scale+CRISPR-Mediated+Control+of+Gene+Repression+and+Activation.">Genome-Scale CRISPR-Mediated Control of Gene Repression and Activation.</a> Cell. 159 (3), 647-661 (2014).</li><li>Cheng, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+activation+of+endogenous+genes+by+CRISPR-on,+an+RNA-guided+transcriptional+activator+system.">Multiplexed activation of endogenous genes by CRISPR-on, an RNA-guided transcriptional activator system.</a> Cell Research. 23 (10), 1163-1171 (2013).</li><li>Matouskova, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reference+genes+for+real-time+PCR+quantification+of+messenger+RNAs+and+microRNAs+in+mouse+model+of+obesity.">Reference genes for real-time PCR quantification of messenger RNAs and microRNAs in mouse model of obesity.</a> PLoS One. 9 (1), e86033 (2014).</li></ol>

Ce manuscrit présente un protocole permettant d’utiliser l’activation CRISPR pour surexprimer lncRNAs in vitro. Il s’agit d’une technique particulièrement importante lorsque l'on étudie les ARN long non codantes puisque le produit de transcriptomique est l’unité fonctionnelle. Après surexpression, le chercheur peut, ensuite, utiliser ces cellules pour augmenter le rapport signal-bruit lorsque l'on étudie les partenaires de liaison et même de mesurer les conséquences cellulaires d’augmentation du lncRN...

Alors que la recherche biomédicale plus a porté sur transcrits codant pour des protéines, la majorité des gènes transcrits se compose en réalité d’ARN non codants (Ensembl release 93). La recherche actuelle commence à explorer ce domaine, avec le nombre de publications sur lncRNAs dans le processus de la maladie augmente de façon exponentielle entre 2007 et 20171. Ces publications démontrent que de nombreux lncRNAs sont associés aux maladies. Cependant, les mécanismes moléculaires de ces lncRNAs sont difficiles à étudier en raison de leurs fonctions diverses de mRNA. Le problème de la compréhension du rôle de lncRNAs dans la maladie de mélange, lncRNAs s’expriment souvent à des niveaux inférieurs que coding RNAs2. En outre, lncRNAs sont mal conservées, qui limite les études fonctionnelles dans l’homme cellulaire-ligne-techniques basées sur3. Une méthode pour étudier le mécanisme de ces nouveaux gènes consiste à eux surexpriment endogène dans les cellules cultivées. Surexpression études peuvent fournir des renseignements essentiels quant à la fonction des gènes spécifiques et permettre aux chercheurs de disséquer les voies moléculaires clés.
Une nouvelle méthode pour activer la transcription des gènes de lncRNA repose sur les technologies CRISPR développés initialement par le laboratoire de Gersbach4. Ce protocole a été adapté pour une utilisation en biologie de la lncRNA et pour l’expression de ces gènes dans d’autres systèmes de modèle. Dans le CRISPR surexprimant la technique, une protéine appelée protéine associée à la CRISPR 9 (Cas9) peut être dirigée vers une séquence d’ADN via un gRNA antisens qui est reconnu par Cas9. Normalement, Cas9 induira de clivage de l’ADN ; Toutefois, des mutations Cas9, précédemment mis au point pour la technique de la surexpression, désactiver cette étape5. Quand un activateur de la transcription est fusionné à un Cas9 « morts » (dCas9) et transduites dans les lignées cellulaires, la surexpression endogène de lncRNAs peut être obtenu4,6. L’addition de modifications supplémentaires à la gRNA, permettant aux autres facteurs transcriptionnels lier à la gRNA, augmente l’efficacité du système d’activation gène dCas9 10 fois7. Ce qui est important, il a été démontré que l’activation de la transcription exige proximité (< 200 bp) demarre la transcription des gènes de site, ce qui permet une augmentation spécifique dans les zones riches en gènes7. Contrairement aux technologies de knockout CRISPR, dCas9 et gRNA cassettes doivent être intégrés dans le génome permettant aux cellules de conserver une surexpression sur plusieurs générations. Une méthode pour y parvenir consiste à utiliser des lentivirus pour intégrer les cassettes contenant dCas9 et gRNA. Après intégration, on peut déterminer l’expression du gène lncRNA.
Dans cet article, un protocole pour lncRNA surexpression dans un modèle de cellules T Jurkat sera démontré. Une procédure pas à pas apparaît et peut également être adaptée pour les cellules adhérentes.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:837px;" width="837">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:245px;">Ampicillin</td>
			<td style="width:195px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:195px;">BP1760-5</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">CaCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:195px;">C1016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">cDNA synthesis kit (iScript)</td>
			<td style="width:195px;">BioRad</td>
			<td>1708891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">dCas9 forward primer</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:195px;">n/a</td>
			<td>5&#39;-TCGCCACAGCATAAAGAAGA&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">dCas9 reverse primer</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:195px;">n/a</td>
			<td>5&#39;-CTTTTCATGGTACGCCACCT</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">dCas9 vector</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:195px;">50918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM</td>
			<td>Corning</td>
			<td style="width:195px;">10013CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Ethanol</td>
			<td style="width:195px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:195px;">61509-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FBS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">gRNA plasmid</td>
			<td>VectorBuilder</td>
			<td style="width:195px;">VB180119-1195qxv</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEK293T cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td style="width:195px;">&#160;CRL-1573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:195px;">H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HPRT1 forward primer</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:195px;">n/a</td>
			<td>GACCAGTCAACAGGGGACAT&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HPRT1 reverse primer</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:195px;">n/a</td>
			<td>GCTTGCGACCTTGACCATCT</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hygromycin B</td>
			<td>Corning</td>
			<td style="width:195px;">MT3024CR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Isopropanol</td>
			<td style="width:195px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:195px;">BP2618-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Jurkat cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td style="width:195px;">&#160;TIB-152</td>
			<td style="width:203px;">clone E6-1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-glutamine</td>
			<td>Corning</td>
			<td style="width:195px;">25005Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LB agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1425-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LB broth</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1426-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Maxi-prep kit (Plasmid Purification Kit)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td style="width:195px;">12362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Na2HPO4</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:195px;">NIST2186II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Optimem I reduced serum media&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:195px;">31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">p24 elisa</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td style="width:195px;">NEK050B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">PBS</td>
			<td style="width:195px;">Corning</td>
			<td style="width:195px;">21-040-CMR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin and Streptomycin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pMDG2.G</td>
			<td>Addgene &#160;</td>
			<td style="width:195px;">#12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pMDLg/pRRE</td>
			<td>Addgene&#160;</td>
			<td style="width:195px;">#60488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Poly-L-Lysine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:195px;">P-4832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Polybrene</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td style="width:195px;">TR-1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pRSV-REV</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:195px;">#12253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Puromycin dihydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:195px;">P8833</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNA purification kit (Aurum RNA mini)</td>
			<td style="width:195px;">BioRad</td>
			<td>7326820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Butyrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:195px;">B5887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SYBR green (iTaq universal)</td>
			<td style="width:195px;">BioRad</td>
			<td>1725122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:195px;">X100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

overexpressing long noncoding rnas using gene-activating crispr

Longtemps non codante biologie des ARN (lncRNA) est un domaine nouveau et passionnant de recherche, avec le nombre de publications de ce domaine en croissance exponentielle depuis 2007. Ces études ont confirmé que les lncRNAs soient modifiées dans presque toutes les maladies. Toutefois, il reste difficile en raison du manque de produits protéiques, expression tissu-spécifique, les niveaux d’expression faible complexité sous formes d’épissage et de la conservation des espèces d’étudier les rôles fonctionnels pour lncRNAs dans le contexte de la maladie. Compte tenu de l’expression spécifique à l’espèce, lncRNA études se limitent souvent aux contextes de recherche humaine lorsque l'on étudie les processus morbides. Étant donné que lncRNAs fonctionne au niveau moléculaire, disséquer la biologie lncRNA consiste à enlever la lncRNA ou surexpriment les effets cellulaires lncRNA et mesure. Dans cet article, un protocole écrit et visualisé de surexprimer lncRNAs in vitro est présenté. Comme une expérience représentative, une lncRNA associée à la maladie intestinale inflammatoire, l’interféron Gamma antisens 1 (IFNG-AS1), s’est avéré être surexprimé dans un modèle de cellules T Jurkat. Pour ce faire, la technique activateur de régulièrement dois‑je courts palindromes répétitions (CRISPR) en cluster est utilisée pour permettre à la surexpression dans les locus génomiques endogènes. La technique CRISPR activation vise un ensemble de facteurs de transcription sur le site de début de transcription d’un gène, qui permet une surexpression robuste de multiples formes d’épissure de lncRNA. Cette procédure va être décomposée en trois étapes, à savoir (i) guide RNA (gRNA) conception et vector construction, génération de virus (ii) et transduction et criblage de colonie (iii) pour la surexpression. Pour cette expérience représentative, a plus de 20 fois amélioration dans IFNG-AS1 dans les cellules T Jurkat a été observée.

Un système de double vecteur de surexprimer le lncRNA IFNG-AS1 L’expérience de l’exemple dans ce manuscrit est la surexpression d’un système de modèle de cellules T Jurkat exprimant le lncRNA AS1-IFNG9. IFNG-AS1 est un lncRNA associé à la maladie intestinale inflammatoire, qui a été vu à réglementer l’interféron Gamma10. Le gène IFNG-AS1 contient trois variants d’épissage qui utilisent le même site...

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Overexpressing Long Noncoding RNAs Using Gene-activating CRISPR

Techniques traditionnelles axées sur l’ARNC surexpression ont une portée limitée pour la surexpression de l’ARN long non codantes en raison de leurs multiples formes d’épissure avec fonctionnalité potentielle. Cette étude rapporte un protocole utilisant la technologie CRISPR pour surexprimer multiples variants d’épissage d’un ARN long non codant.

Surexprimant ARN Long non codantes en utilisant activation génique CRISPR

Long noncoding RNA (lncRNA) biology is a new and exciting field of research, with the number of publications from this field growing exponentially since ...

Les ARN non codants ont souvent de multiples isoformes. Dans les études in vitro de surexpression, il est souvent difficile d’étudier tous ces isoformes exprimés. Cette technique permet aux utilisateurs de tirer l’expression directement du génome et de permettre aux cellules d’exprimer les isoformes endogènes pour un ARN non codant particulier.Cette technique puissante permet à l’utilisateur de diriger spécifiquement l’expression de n’importe quel gène dans le génome avec fidélité et précision. En concevant des ARN guides vers des gènes spécifiques, on est capable d’utiliser les mécanismes endogènes d’épissage génétique pour exprimer les isoformes naturels dans une cellule donnée. Robert Rankin, post-doc de mon laboratoire, démontrera la procédure.Pour concevoir la séquence d’ARN guide qui se trouve dans 100 paires de base du site de démarrage transcriptionnel, utilisez des bases de données génétiques telles que BLAT pour vous assurer que l’ARN guide est unique au gène d’intérêt. Stockez l’ARN guide et les plasmides Cas9 désactivés à quatre degrés Celsius. Strier E.coli sur une plaque d’agar de bouillon Luria avec de l’ampicilline et faire croître la bactérie pendant la nuit à 37 degrés Celsius.Le lendemain, choisissez une colonie et cultivez la bactérie en cinq millilitres de LB avec de l’ampicilline pendant la nuit, secouant vigoureusement le tube dans un incubateur de 37 degrés Celsius. Le lendemain, ajouter deux millilitres de bactéries à 200 millilitres de LB avec de l’ampicilline dans un flacon de deux litres, en secouant vigoureusement le flacon pendant la nuit dans un incubateur de 37 degrés Celsius. Faites tourner les bactéries à 3 724 g pendant 20 minutes et procédez à la purification de l’ADN.Pour créer le lentivirus contenant dCas9, première couche de 100 millilitres plats de culture tissulaire avec cinq millilitres de 0,01%Poly-L-Lysine et plaque cinq millions de cellules HEK293T par plat en 10 millilitres de dulbecco complète Modified Eagles Medium, préparer ensuite des échantillons de transfection de l’ADN en mélangeant 10 microgrammes d’un vecteur d’ARN guide contenant du LTR ou d’un vecteur Cas9 désactivé contenant du LTR avec des plasmides contenant des composants de virus. Ajouter de l’eau à un volume total de 450 microlitres et filtrer le mélange à l’aide d’une pointe de filtre de 0,2 micron attachée à une seringue. Ensuite, ajoutez 50 microlitres de dichloride de calcium de 2,5 molaires à chaque échantillon de transfection de l’ADN et mélangez doucement.Filtrer le mélange calcium-ADN à l’aide d’une pointe de filtre de 0,2 micron fixée à une seringue. Pipette 500 microlitres de 2X HBS dans un tube de polystyrène de cinq millilitres. Ajouter 500 microlitres du mélange calcium-ADN dans le sens de la goutte et doucement vortex.Incuber à température ambiante pendant trois minutes. Ajoutez un millilitre de la suspension HBS ADN-calcium à chaque plat de culture tissulaire contenant hek293T et incubez-les dans un incubateur de dioxyde de carbone de 5 % à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Le troisième jour, retirer lentement et jeter les médias de la vaisselle.Lavez soigneusement les cellules avec PBS une fois. Ajouter six millilitres de DMEM complet complété par hepes de 20 millimillons et butyrate de sodium de 10 millimlaires. Puis incuber les cellules dans un incubateur de dioxyde de carbone de 5% à 37 degrés Celsius pendant cinq à six heures.Après l’incubation, laver les cellules avec PBS une fois et ajouter cinq millilitres de DMEM complet avec HEPES de 20 millimolaires aux cellules HEK293T. Incuber les cellules dans un incubateur de dioxyde de carbone de 5% à 37 degrés Celsius pendant 12 heures. Le quatrième jour, recueillir les supernatants cellulaires HEK293T et filtrer le supernatant contenant le virus.Pour commencer le dénombrement des particules virales, diluez d’abord le concentré de lavage du kit P24 ELISA en ajoutant 19 parties d’eau distillée et déionisée. Ensuite, diluer le contrôle positif de ce kit à 200 nanogrammes par millilitre en utilisant RPMI 1640 comme diluant et faire des dilutions pour une courbe standard en tubes de 1,5 millilitre selon le tableau de dilution P24 ELISA. Pour mesurer la concentration du virus dans les échantillons, ajouter les dilutions de l’échantillon aux puits désignés d’une plaque de 96 puits, à partir de 1:1000 dilution et modifier le volume au besoin afin d’être dans la fourchette de la courbe standard.Ensuite, diluer les échantillons avec Triton X-100 à une concentration finale de 0,5% et ajouter 200 microlitres de chaque échantillon et RPMI 1640 aux puits désignés. Sceller la plaque et l’incuber à 37 degrés Celsius pendant deux heures. Lavez la plaque avec 300 microlitres par puits du tampon de lavage 1X six fois.Retirez tout excès de liquide en inversant la plaque et en la tapant sur une serviette en papier. Ajouter ensuite 100 microlitres d’anticorps détecteur du kit à tous les puits sauf le substrat vide. Sceller la plaque et l’incuber à 37 degrés Celsius pendant une heure.Lavez la plaque, puis retirez tout excès de liquide en inversant la plaque et en la tapant sur une serviette en papier. Afin de mesurer l’anticorps détecteur, diluer la streptavidine peroxidase raifort à 1:100 dilution avec diluant SA-HRP. Bien mélanger le SA-HRP dilué et ajouter 100 microlitres à tous les puits sauf le blanc.Sceller et incuber la plaque à température ambiante pendant 30 minutes. Ensuite, lavez la plaque avec le tampon de lavage 1X et appuyez sur tout excès de liquide. Déposez un comprimé d’orthophénylènediamine dans 11 millilitres du substrat diluant pour faire suffisamment de solution de substrat pour une assiette.Vortex la solution OPD vigoureusement pour le dissoudre complètement et le protéger de la lumière. Ajouter 100 microlitres de solution de substrat OPD à tous les puits, y compris le vide. À l’aide d’un spectrophotomètre, lisez immédiatement l’absorption à 450 nanomètres.Répétez 10 fois à intervalles d’une seconde et prenez la mesure moyenne. Resuspendre et la culture Jurkat T-cellules dans un flacon T75 avec une densité d’un million de cellules en cinq millilitres de la réduction du sérum avec du polybrene. Ajoutez ensuite des supports conditionnés par HEK293T contenant un million de particules virales contenant du dCas9.Incuber les cellules à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone. Trois jours après l’infection, faire tourner les cellules à 233 g de temps pendant cinq minutes et les résuspendre en 10 millilitres de DMEM complet complété par de la puromycine. Culture des cellules dans les flacons T75 et les incuber à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone.Tous les trois jours pendant une période de neuf jours, faites tourner les cellules à 233 fois g pendant cinq minutes et remplacez le média par le DMEM complet complété par de la puromycine. Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un compteur cellulaire automatisé. Puis, sur une plaque de 96 puits avec des tissus traités par culture tissulaire, ajouter 10 000 cellules dans 100 microlitres du DMEM complet complétés par de la puromycine dans le premier puits.Faire 1:1 dilutions en série du contenu des puits suivants avec le DMEM complet complété par de la puromycine. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone. Étendre les cellules clonales en deux plaques de 24 puits, puis plaquer deux millions de cellules par puits d’une plaque de six puits pour trois des clones.Plaquez les trois autres puits avec des cellules Jurkat non transduced comme contrôles. Enfin, plaquez les cellules dans un flacon T75 et mettez les cellules dans un incubateur de culture cellulaire pendant la nuit. Pour commencer le PCR quantitatif pour mesurer l’expression des gènes, synthétisez d’abord l’ADN complémentaire en ajoutant un microgramme d’ARN, quatre microlitres de tampon de synthèse cDNA, et un microlitre de transcriptase inverse à 250 tubes microlitres, puis ajoutez de l’eau à un volume final de 20 microlitres.Ensuite, utilisez un cycleur thermique à 42 degrés Celsius pendant 30 minutes et à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes pour inactiver la transcriptase inverse. Diluer l’ADNC avec 60 microlitres d’eau après la synthèse. Exécutez des réactions en chaîne de polymése pour les tubes contenant 0,5 microlitres de chaque amorce avant et arrière à la concentration finale de 10 micromolaires, cinq microlitres de vert SYBR et quatre microlitres de cDNA.Enfin sélectionnez les cellules Jurkat-dCas9 dans DMEM complétées par Hygromycin B pendant 10 jours. Faites tourner les cellules et changez les médias tous les trois jours. Purifiez RNAse et passez à RT-qPCR.Dans cette étude, des séquences de gRNA qui étaient dans 10 à 100 paires de base loin du site transcriptionnel de commencement ont été employées pour diriger le complexe cas9-activant au lieu transcriptionnel d’IFNG-AS1, un long ARN non codant lié à la maladie intestinale inflammatoire. Pour permettre la sélection de cellules doubles transduced, un système à deux plasmides a été utilisé pour transduire les exhausteurs dCas9 ou gRNAse en cellules. Ici, les protéines MS2 améliorent la surexpression de l’IFNG-AS1.Cas9 expression a été confirmée pour les deux clones. Des amorces contre HPRT1 ont été employées pour confirmer la présence de l’ARN dans les cellules non transduced. L’expression d’ARNm a été confirmée en omettant la transcriptase inverse de la réaction de cDNA.Trois variantes d’épissage d’IFNG-AS1 ont pu être détectées avec des ensembles d’amorce spécifiques à la transcription ou une amorce contre toutes les transcriptions IFNG-AS1 connues. Toutes les courbes de fluorescence étaient exponentielles, le gène d’entretien ménager HPRT1 atteignant la phase exponentielle en un demi-cycle entre les cellules de contrôle et les cellules exprimant l’ARN IFNG-AS1. Les amorces par rapport à toutes les transcriptions IFNG-AS1 connues étaient les plus détectables entre les expériences, avec des mesures de 20 fois plus d’expression IFNG-AS1.Toutefois, la troisième transcription de l’IFNG-AS1 a montré une augmentation de cinq à dix fois significative des niveaux IFNG-AS1. Pour surexprimer activement le gène désiré, la conception de l’ARN guide à l’étape 2.1 est essentielle au succès du protocole. En outre, la production de particules virales de qualité assurera une expression robuste de vos composants de protocole.Une fois que le gène désiré est surexprimé, des études fonctionnelles peuvent être effectuées pour étudier les mécanismes génétiques. Dans notre exemple, nous avons choisi d’examiner la production de cytokine suite à la surexpression de notre gène d’intérêt. Cette technique a été initialement développée par le Groupe Griesbach en 2013 et a été largement appliquée et élaborée par d’autres groupes.Nous étions ravis d’appliquer cette technique à de longs ARN non codés afin d’explorer leurs fonctions spécifiques. Les lentivirus défectueux par réplication doivent être manipulés dans un laboratoire qui a été approuvé pour des travaux viraux. De plus, les lignées cellulaires humaines et les bactéries E.coli sont considérées comme biodangereuses.Enfin, les plasmides d’ADN recombinants doivent être manipulés par du personnel qualifié.

Research

JoVE Journal

Genetics

Sequence-specific and Selective Recognition of Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs by Chemically Modified Peptide Nucleic Acids

Reconnaissance de séquence-spécifique et sélective d’ARN Double-brin sur ARN monocaténaire par chimiquement modifiées acides nucléiques peptidiques

RNAs are emerging as important biomarkers and therapeutic targets. Thus, there is great potential in developing chemical probes and therapeutic ligands ...

Recherche

Génétique

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

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CRISPR/Cas9-médiation ciblée Integration In Vivo en utilisant une stratégie de base rejoindre fin médiée par homologie

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

Metabolic Labeling and Profiling of Transfer RNAs Using Macroarrays

Marquage métabolique et profilage des ARN de transfert à l’aide de macroréseaux

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A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

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Un rapide et Facile de Pipeline pour générer des Mutants de Point génomique dans c. elegans en utilisant CRISPR/Cas9 ribonucléoprotéines

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CRISPR Guide RNA Cloning for Mammalian Systems

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Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas

Modification du génome dans des lignées de cellules mammifères à l’aide de CRISPR-Cas

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) system functions naturally in bacterial adaptive immunity, but has been ...

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

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Présentation d'un Knockout Génique Directement dans la phase Amastigote de Trypanosoma cruzi à l'aide du système CRISPR/Cas9

Trypanosoma cruzi is a pathogenic protozoan parasite that causes Chagas&#8217; disease mainly in Latin America. In order to identify a novel drug target ...