Name: overexpressing long noncoding rnas using gene-activating crispr
Uploaded: 2019-03-01T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Overexpressing Long Noncoding RNAs Using Gene-activating CRISPR at JoVE.com

סי. פי נתמך ע י 41301 RO1 DK60729 ו- P30 DK-26. D.P. נתמך על-ידי קרוהן & קוליטיס קרן (CCFA) הקריירה פיתוח פרס, התרופה: מרכז מחקר מחלות עיכול (DDRC) DK41301, UCLA קליני ואת מכון המדע Translational (CTSI) UL1TR0001881. ליבת וירולוגיה UCLA מומן על ידי מרכז של איידס המחקר (כפר) להעניק 30 P 5 AI028697. UCLA משולב מולקולרית טכנולוגיות הליבה נתמכה על ידי התרופה/P30 הענק DK041301. עבודה זו גם נתמך על ידי המכון איידס UCLA.

הערה: חשוב לציין כי פרוטוקול זה משתמש בשכפול לקויה lentiviruses. לבצע טיפול ויראלי רק לאחר בטיחות במעבדה המתאים. אקונומיקה כל הפריטים של משטחים יבואו במגע עם וירוסים חיים למשך תקופה מינימלית של 10 דקות לאחר טיפול. שימוש מעיל המעבדה חד פעמיות והגנה הפנים/עין, כמו גם כפפות כפול, בכל עת. ביצו...

<ol>
	<li>Miao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trends+of+long+noncoding+RNA+research+from+2007+to+2016:+a+bibliometric+analysis.">Trends of long noncoding RNA research from 2007 to 2016: a bibliometric analysis.</a> Oncotarget. 8 (47), 83114-83127 (2017).</li><li>Derrien, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+GENCODE+v7+catalog+of+human+long+noncoding+RNAs:+analysis+of+their+gene+structure,+evolution,+and+expression.">The GENCODE v7 catalog of human long noncoding RNAs: analysis of their gene structure, evolution, and expression.</a> Genome Research. 22 (9), 1775-1789 (2012).</li><li>Johnsson, P., Lipovich, L., Grander, D., Morris, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+conservation+of+long+non-coding+RNAs;+sequence,+structure,+function.">Evolutionary conservation of long non-coding RNAs; sequence, structure, function.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1840 (3), 1063-1071 (2014).</li><li>Perez-Pinera, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-guided+gene+activation+by+CRISPR-Cas9-based+transcription+factors.">RNA-guided gene activation by CRISPR-Cas9-based transcription factors.</a> Nature Methods. 10 (10), 973-976 (2013).</li><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity.">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li><li>Maeder, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+RNA-guided+activation+of+endogenous+human+genes.">CRISPR RNA-guided activation of endogenous human genes.</a> Nature Methods. 10 (10), 977-979 (2013).</li><li>Konermann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+transcriptional+activation+by+an+engineered+CRISPR-Cas9+complex.">Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex.</a> Nature. 517 (7536), 583-588 (2015).</li><li>Schmittgen, T. D., Livak, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+real-time+PCR+data+by+the+comparative+C(T)+method.">Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method.</a> Nature Protocols. 3 (6), 1101-1108 (2008).</li><li>Gomez, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NeST+long+ncRNA+controls+microbial+susceptibility+and+epigenetic+activation+of+the+interferon-gamma+locus.">The NeST long ncRNA controls microbial susceptibility and epigenetic activation of the interferon-gamma locus.</a> Cell. 152 (4), 743-754 (2013).</li><li>Padua, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+long+noncoding+RNA+signature+for+ulcerative+colitis+identifies+IFNG-AS1+as+an+enhancer+of+inflammation.">A long noncoding RNA signature for ulcerative colitis identifies IFNG-AS1 as an enhancer of inflammation.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 311 (3), G446-G457 (2016).</li><li>Collier, S. P., Henderson, M. A., Tossberg, J. T., Aune, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+Th1+genomic+locus+from+Ifng+through+Tmevpg1+by+T-bet.">Regulation of the Th1 genomic locus from Ifng through Tmevpg1 by T-bet.</a> Journal of Immunology. 193 (8), 3959-3965 (2014).</li><li>Kotake, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+non-coding+RNA+ANRIL+is+required+for+the+PRC2+recruitment+to+and+silencing+of+p15(INK4B)+tumor+suppressor+gene.">Long non-coding RNA ANRIL is required for the PRC2 recruitment to and silencing of p15(INK4B) tumor suppressor gene.</a> Oncogene. 30 (16), 1956-1962 (2011).</li><li>Gilbert, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Scale+CRISPR-Mediated+Control+of+Gene+Repression+and+Activation.">Genome-Scale CRISPR-Mediated Control of Gene Repression and Activation.</a> Cell. 159 (3), 647-661 (2014).</li><li>Cheng, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+activation+of+endogenous+genes+by+CRISPR-on,+an+RNA-guided+transcriptional+activator+system.">Multiplexed activation of endogenous genes by CRISPR-on, an RNA-guided transcriptional activator system.</a> Cell Research. 23 (10), 1163-1171 (2013).</li><li>Matouskova, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reference+genes+for+real-time+PCR+quantification+of+messenger+RNAs+and+microRNAs+in+mouse+model+of+obesity.">Reference genes for real-time PCR quantification of messenger RNAs and microRNAs in mouse model of obesity.</a> PLoS One. 9 (1), e86033 (2014).</li></ol>

כתב יד זה מציג פרוטוקול להצפנה באמצעות הפעלת CRISPR overexpress lncRNAs במבחנה. זוהי טכניקה חשובה במיוחד כאשר ללמוד RNAs noncoding זמן כפי שהמוצר transcriptomic היא היחידה הפונקציונלית. לאחר ביטוי, החוקר יכול, ואז להשתמש תאים אלה להגדיל את יחס אות לרעש כשלמדתי האיגוד שותפים, אפילו למדוד את התוצאות הסלולר של רמות גב...

בעוד המחקר הביו-רפואי ביותר התמקדה תעתיקים חלבונים, רוב הגנים משועתקים למעשה מורכבת noncoding RNAs (שחרור Ensembl 93). המחקר הנוכחי מתחיל לחקור את השדה עם מספר פרסומים על lncRNAs בתהליכי מחלה עולה אקספוננציאלית בין 2007 ו 20171. פרסומים אלה מדגימים כי lncRNAs רבים הקשורים במחלה. עם זאת, המנגנון המולקולרי של lncRNAs האלה קשים ללמוד בשל הפונקציות מגוונות שלהם לעומת mRNAs. הרכבה הבעיה של להבין את התפקיד של lncRNAs במחלה, lncRNAs מבוטאים לעיתים קרובות ברמות נמוכות יותר קידוד RNAs2. בנוסף, lncRNAs לקוי נשמרים, אשר מגביל את המחקרים פונקציונלי טכניקות האדם תא קו-מבוססת על3. שיטה אחת כדי לחקור את המנגנון של הגנים האלה הרומן היא endogenously overexpress אותם בתאים בתרבית. מחקרים ביטוי יכול לספק מידע מפתח הפונקציה של גנים ספציפיים ולאפשר חוקרים לנתח מפתח מסלולים מולקולריים.
שיטה חדשה להפעלת שעתוק של גנים lncRNA מבוססת על טכנולוגיות CRISPR שפותחה בתחילה על ידי מעבדה Gersbach4. פרוטוקול זה כבר מותאם לשימוש בביולוגיה lncRNA והן עבור הביטוי של גנים אלה במערכות אחרות מודל. ב- CRISPR overexpressing טכניקה, חלבון הנקרא CRISPR-הקשורים חלבון 9 (Cas9) יכול להיות מופנה כלפי רצף הדנ א באמצעות gRNA antisense מזוהה על-ידי Cas9. בדרך כלל, Cas9 יניעו ביקוע DNA; עם זאת, מוטציות בגן Cas9, שפותחו בעבר ביטוי הטכניקה, לבטל את שלב5. מתי מפעיל גנים ברמת השעתוק היא דבוקה של Cas9 "מת" (dCas9) transduced לתוך שורות תאים, ביטוי אנדוגני של lncRNAs יכול להיות מושגת4,6. התוספת של שינויים נוספים gRNA, הפעלת גורמים נוספים תעתיק לקשור gRNA, הגדילו את היעילות של מערכת ההפעלה של הגן dCas9 10-fold7. חשוב, הוכח כי הפעלת גנים ברמת השעתוק דורשת הקרבה (< 200 bp) תעתיק להפעיל אתר הגנים, הפעלת קולטנים upregulation ספציפיים של ג'ין עשיר אזורים7. בניגוד CRISPR טכנולוגיות נוקאאוט, קלטות dCas9 ו- gRNA צריך להיות משולב לתוך הגנום כדי לאפשר תאים לשמור על ביטוי דורות מרובים. שיטה אחת כדי להשיג זאת היא להשתמש lentiviruses כדי לשלב את dCas9 ואת gRNA-המכילים הקלטות. לאחר שילוב, בביטוי הגן lncRNA יכול להיקבע.
במאמר זה, תודגמנה פרוטוקול עבור ביטוי lncRNA במודל Jurkat T-cell. הליך שלב אחר שלב מוצג, ניתן להתאים גם תאים חסיד.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:837px;" width="837">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:245px;">Ampicillin</td>
			<td style="width:195px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:195px;">BP1760-5</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">CaCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:195px;">C1016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">cDNA synthesis kit (iScript)</td>
			<td style="width:195px;">BioRad</td>
			<td>1708891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">dCas9 forward primer</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:195px;">n/a</td>
			<td>5&#39;-TCGCCACAGCATAAAGAAGA&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">dCas9 reverse primer</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:195px;">n/a</td>
			<td>5&#39;-CTTTTCATGGTACGCCACCT</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">dCas9 vector</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:195px;">50918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM</td>
			<td>Corning</td>
			<td style="width:195px;">10013CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Ethanol</td>
			<td style="width:195px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:195px;">61509-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FBS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">gRNA plasmid</td>
			<td>VectorBuilder</td>
			<td style="width:195px;">VB180119-1195qxv</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEK293T cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td style="width:195px;">&#160;CRL-1573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:195px;">H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HPRT1 forward primer</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:195px;">n/a</td>
			<td>GACCAGTCAACAGGGGACAT&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HPRT1 reverse primer</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:195px;">n/a</td>
			<td>GCTTGCGACCTTGACCATCT</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hygromycin B</td>
			<td>Corning</td>
			<td style="width:195px;">MT3024CR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Isopropanol</td>
			<td style="width:195px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:195px;">BP2618-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Jurkat cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td style="width:195px;">&#160;TIB-152</td>
			<td style="width:203px;">clone E6-1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-glutamine</td>
			<td>Corning</td>
			<td style="width:195px;">25005Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LB agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1425-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LB broth</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1426-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Maxi-prep kit (Plasmid Purification Kit)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td style="width:195px;">12362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Na2HPO4</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:195px;">NIST2186II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Optimem I reduced serum media&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:195px;">31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">p24 elisa</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td style="width:195px;">NEK050B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">PBS</td>
			<td style="width:195px;">Corning</td>
			<td style="width:195px;">21-040-CMR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin and Streptomycin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pMDG2.G</td>
			<td>Addgene &#160;</td>
			<td style="width:195px;">#12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pMDLg/pRRE</td>
			<td>Addgene&#160;</td>
			<td style="width:195px;">#60488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Poly-L-Lysine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:195px;">P-4832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Polybrene</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td style="width:195px;">TR-1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pRSV-REV</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:195px;">#12253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Puromycin dihydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:195px;">P8833</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNA purification kit (Aurum RNA mini)</td>
			<td style="width:195px;">BioRad</td>
			<td>7326820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Butyrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:195px;">B5887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SYBR green (iTaq universal)</td>
			<td style="width:195px;">BioRad</td>
			<td>1725122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:195px;">X100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

overexpressing long noncoding rnas using gene-activating crispr

זמן noncoding RNA (lncRNA) ביולוגיה היא שדה חדש ומרגש של מחקר, עם מספר פרסומים משדה זה גדלה אקספוננציאלית מאז 2007. מחקרים אלה אישרו כי lncRNAs הם שינו כמעט כל מחלות. עם זאת, ללמוד את התפקידים פונקציונלי עבור lncRNAs בהקשר של מחלה נשאר קשה עקב חוסר חלבון מוצרים, ביטוי רקמות ספציפיות, רמות הביטוי נמוך, המורכבויות טפסים splice, חוסר שימור בין המינים. נתון הביטוי תלויי מין, מחקרים lncRNA מוגבלים לעיתים קרובות מחקר האנושית בהקשרים כשלמדתי תהליכי מחלה. מאז lncRNAs לתפקד ברמה המולקולרית, אחת הדרכים לנתח lncRNA ביולוגיה היא להסיר את lncRNA או overexpress ההשפעות הסלולר lncRNA ולמדוד. במאמר זה, מוצג פרוטוקול בכתב, דמיינו overexpress lncRNAs במבחנה. בתור ניסוי נציג lncRNA הקשורים עם מחלות מעי דלקתיות, אינטרפרון גמא Antisense 1 (IFNG-AS1), מוצג כדי להיות overexpressed במודל Jurkat T-cell. כדי לעשות זאת, הטכניקה הפעלת באשכולות חזרה palindromic קצר באופן קבוע interspaced (CRISPR) משמש כדי לאפשר ביטוי-לוקוסים גנומית אנדוגני. הפעלת הטכניקה CRISPR מטרות ערכה של גורמי שעתוק לאתר התחלה תעתיק של הגן, מתן אפשרות של ביטוי חזקים של טפסים splice lncRNA מרובים. הליך זה ניתן לפרק לתוך שלושה שלבים, כלומר RNA (gRNA) (i) מדריך בנייה ועיצוב וקטור, דור (ii) וירוס, התמרה חושית ו- (iii) המושבה הקרנה של ביטוי. עבור ניסוי נציג של יותר מאשר שיפור 20-fold IFNG-AS1 בתאי Jurkat T נצפתה.

מערכת כפולה וקטורית כדי overexpress את lncRNA IFNG-AS1 הניסוי דוגמה כתב יד זה הוא ביטוי של מערכת מודל Jurkat T-cell לבטא את lncRNA IFNG-AS19. IFNG-AS1 הוא lncRNA הקשורים עם מחלות מעי דלקתיות, כי כבר ראיתי לווסת אינטרפרון גמא10. הגן IFNG-AS1 מכיל שלוש גרסאות splice כי כל שימוש ב?...

Watch this Scientific Journal Video about Overexpressing Long Noncoding RNAs Using Gene-activating CRISPR at JoVE.com

Overexpressing Long Noncoding RNAs Using Gene-activating CRISPR

טכניקות ביטוי מסורתיים מבוססי cDNA יש של תחולה מוגבלת עבור ביטוי של RNAs noncoding זמן עקב שלהם טפסים splice מרובים עם פונקציונליות פוטנציאליים. ביקורת זו דוחות באמצעות טכנולוגיית CRISPR את overexpress וריאציות splice מרובים של RNA זמן noncoding פרוטוקול.

Overexpressing RNAs Noncoding זמן באמצעות הפעלת גנים CRISPR

Long noncoding RNA (lncRNA) biology is a new and exciting field of research, with the number of publications from this field growing exponentially since ...

ל- RNAs שאינם קידוד יש לעתים קרובות צורות מרובות. במחקרי דיכוי יתר במבחנה, לעתים קרובות קשה ללמוד את כל אלה isoforms לידי ביטוי. טכניקה זו מאפשרת למשתמשים להפיק ביטוי ישירות מן הגנום ולאפשר לתאים לבטא את isoforms אנדוגני עבור RNA מסוים שאינו קידוד.טכניקה רבת עוצמה זו מאפשרת למשתמש לכוון באופן ספציפי את הביטוי של כל גן בגנום בנאמנות ובדיוק. על ידי תכנון RNAs מדריך לגנים ספציפיים, אחד הוא מסוגל להשתמש במכונות שידוך גנים אנדוגני לבטא את isoforms הטבעי בתא נתון. הדגמת ההליך תהיה רוברט רנקין, פוסט-דוקטורט מהמעבדה שלי.כדי לעצב את רצף RNA המדריך אשר ממוקם בתוך 100 זוגות בסיס של אתר ההתחלה שעתוק, להשתמש במסדי נתונים גנטיים כגון BLAT כדי לוודא כי RNA המדריך הוא ייחודי לגן של עניין. אחסן את המדריך RNA ואת פלסמיד Cas9 מנוטרל בארבע מעלות צלזיוס. פסים החוצה E.coli על צלחת אגר מרק לוריא עם אמפיצילין ולגדל את החיידקים לילה ב 37 מעלות צלזיוס.למחרת, לבחור מושבה ולגדל את החיידקים בחמישה מיליליטר של LB עם אמפיצילין לילה, במרץ לנער את הצינור באינקובטור 37 מעלות צלזיוס. למחרת, להוסיף שני מיליליטר של חיידקים ל 200 מיליליטר של LB עם אמפיצילין בבקבוק שני ליטר, במרץ לנער את הבקבוק לילה באינקובטור 37 מעלות צלזיוס. לסובב את החיידקים ב 3, 724 פעמים g במשך 20 דקות ולהמשיך לטיהור DNA.כדי ליצור את dCas9 המכיל lentivirus, המעיל הראשון 100 מיליליטר רקמת תכלת מנות עם חמישה מיליליטר של 0.01% פולי-L-ליזין צלחת חמישה מיליון תאי HEK293T לכל מנה ב 10 מיליליטר של מלא של דולבקו שונה נשרים בינוני, לאחר מכן להכין דגימות transfection DNA על ידי ערבוב 10 מיקרוגרם של וקטור RNA מדריך המכיל LTR או וקטור Cas9 מושבת המכיל LTR עם פלסמידים המכילים רכיבים של וירוסים. מוסיפים מים לנפח כולל של 450 מיקרוליטרים ומסננים את התערובת דרך קצה מסנן 0.2 מיקרון המחובר למזרק. לאחר מכן, מוסיפים 50 מיקרוליטרים של 2.5-דיכלוריד סידן טוחן לכל דגימת transfection של ה-DNA ומערבבים בעדינות.מסננים את תערובת הסידן-DNA דרך קצה מסנן 0.2 מיקרון המחובר למזרק. פיפטה 500 מיקרוליטרים של HBS 2X לתוך צינור פוליסטירן חמישה מיליליטר. מוסיפים 500 מיקרוליטרים של תערובת הסידן-DNA dropwise ומערבולת בעדינות.דגירה בטמפרטורת החדר במשך שלוש דקות. הוסיפו מיליליטר אחד של מתלי ה-DNA-סידן HBS לכל צלחת תרבות רקמות המכילה HEK293T והדגירה אותם באינקובטור של 5% פחמן דו חמצני ב-37 מעלות צלזיוס במהלך הלילה. ביום השלישי, לאט להסיר ולהשליך את התקשורת מן הכלים.בזהירות לשטוף את התאים עם PBS פעם אחת. הוסף שישה מיליליטר של DMEM מלא בתוספת HEPES 20 מילימולרים ו 10 מילימולר נתרן butyrate. ואז להתבגר בתאים באינקובטור 5%פחמן דו חמצני ב 37 מעלות צלזיוס במשך חמש עד שש שעות.לאחר הדגירה, לשטוף את התאים עם PBS פעם אחת ולהוסיף חמישה מיליליטר של DMEM מלא עם HEPES 20 מילימולרי לתאי HEK293T. אין לארוב את התאים באינקובטור של 5% פחמן דו חמצני ב-37 מעלות צלזיוס למשך 12 שעות. ביום הרביעי, לאסוף את HEK293T תא supernatants ולסנן את supernatant המכיל את הנגיף.כדי להתחיל את ספירת החלקיקים הנגיפיים, תחילה לדלל את תרכיז לשטוף מערכת P24 ELISA על ידי הוספת 19 חלקים של מים מזוקקים, deionized. לאחר מכן, לדלל את השליטה החיובית ערכה זו ל 200 ננוגרם למיליליטר באמצעות RPMI 1640 כמו diluent ולעשות דילול עבור עקומה סטנדרטית צינורות 1.5 מיליליטר על פי טבלת דילול P24 ELISA. כדי למדוד את ריכוז הנגיף בתוך הדגימות להוסיף את דילול המדגם ל בארות המיועדות של צלחת 96 באר, החל 1:1000 דילול ולשנות את הנפח לפי הצורך על מנת להיות בטווח של העקומה הסטנדרטית.לאחר מכן לדלל את הדגימות עם טריטון X-100 לריכוז סופי של 0.5%, ולהוסיף 200 microliters של כל מדגם ו RPMI 1640 ל בארות המיועדות. לאטום את הצלחת ולהדיגר אותו ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעתיים. לשטוף את הצלחת עם 300 microliters לכל באר של חיץ לשטוף 1X שש פעמים.הסר כל נוזל עודף על ידי היפוך הצלחת והקשה עליו על מגבת נייר. לאחר מכן להוסיף 100 microliters של נוגדן גלאי מהערכה לכל בארות למעט המצע ריק. לאטום את הצלחת ו דגירה אותו ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת.לשטוף את הצלחת ולאחר מכן להסיר כל נוזל עודף על ידי היפוך הצלחת הקשה על מגבת נייר. על מנת למדוד את הנוגדן גלאי, לדלל את חזרת סטרפטבידין peroxidase ב 1:100 דילול עם DILUENT SA-HRP. מערבבים את SA-HRP מדולל ביסודיות ולהוסיף 100 microliters לכל בארות למעט ריק.לאטום ולהדרור את הצלחת בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות. לאחר מכן, לשטוף את הצלחת עם חיץ לשטוף 1X ולהברז משם כל נוזל עודף. זרוק טבליה אחת אורתו-פנילנדיאמין ב 11 מיליליטר של דילואנט המצע כדי להפוך את פתרון מצע מספיק עבור צלחת אחת.Vortex פתרון OPD במרץ כדי להמיס אותו לחלוטין ולהגן עליו מפני אור. הוסף 100 מיקרוליטרים של פתרון מצע OPD לכל בארות כולל הריק. באמצעות ספקטרופוטומטר, יש לקרוא את הספיגה ב-450 ננומטר באופן מיידי.חזור על 10 פעמים במרווחים של שנייה אחת וקח את המדידה הממוצעת. Resuspend ותרבות Jurkat T-תאים בבקבוק T75 עם צפיפות של מיליון תאים בחמישה מיליליטר של מדיה סרום מופחת עם פוליברן. לאחר מכן הוסיפו מדיה המותנה ב-HEK293T המכילה מיליון חלקיקים נגיפיים המכילים dCas9.דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני. שלושה ימים לאחר ההדבקה, לסובב את התאים ב 233 זמן g במשך חמש דקות ו resuspend אותם 10 מיליליטר של DMEM מלא בתוספת puromycin. תרבו את התאים בבקבוקי T75 ודגירה אותם ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני.כל יום שלישי לתקופה של תשעה ימים, לסובב את התאים ב 233 פעמים g במשך חמש דקות ולהחליף את המדיה עם DMEM מלא בתוספת puromycin. ספור את התאים באמצעות מד חמוציט או מונה תאים אוטומטי. לאחר מכן, על צלחת 96 באר עם רקמה שטופלה בתרבות הרקמה, להוסיף 10, 000 תאים ב 100 microliters של DMEM מלא בתוספת puromycin ב ובכר הראשונה.בצע דילול סדרתי של 1:1 של התוכן של הבארות הבאות עם DMEM מלא בתוספת puromycin. דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני. הרחב את תאי שיבוט לשתי צלחות 24 בארות, ולאחר מכן צלחת שני מיליון תאים לכל באר של צלחת שש באר עבור שלושה שיבוטים.צלחת שלוש בארות אחרות עם תאי Jurkat שאינם מתומרים כמו פקדים. לבסוף, צלחת התאים לתוך בקבוק T75 ולשים את התאים באינקובטור תרבות התא לילה. כדי להתחיל PCR כמותי כדי למדוד ביטוי גנים, תחילה לסנתז DNA משלים על ידי הוספת מיקרוגרם אחד של RNA, ארבעה microliters של מאגר סינתזה cDNA, ומיקרוליטר אחד של תעתיק הפוך ל 250 צינורות microliter, ולאחר מכן להוסיף מים לנפח הסופי של 20 microliters.לאחר מכן, השתמש במחזור תרמי ב 42 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות וב 95 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות כדי להשבית את התמלול ההפוך. לדלל את cDNA עם 60 microliters של מים לאחר הסינתזה. הפעל תגובות שרשרת פולימראז עבור צינורות המכילים 0.5 microliters של כל פריימר קדימה ואחורי בריכוז הסופי של 10 micromolar, חמישה microliters של ירוק SYBR, וארבעה microliters של cDNA.לבסוף בחר בתאי Jurkat-dCas9 ב- DMEM בתוספת Hygromycin B במשך 10 ימים. סובב את התאים ושנה את המדיה כל שלושה ימים. לטהר RNAse ולהמשיך RT-qPCR.במחקר זה, רצפי gRNA שהיו במרחק של 10 עד 100 זוגות בסיסים מאתר ההתחלה של שעתוק שימשו להכוונת המתחם המופעל על ידי Cas9 אל הארבה התמלולית של IFNG-AS1, RNA ארוך שאינו קידוד הקשור למחלות מעי דלקתיות. כדי לאפשר את הבחירה של תאים כפולים שהתווספו, נעשה שימוש במערכת דו-פלסמיד כדי להתגנות משפרי dCas9 או gRNAse לתאים. כאן חלבוני MS2 משפרים את לחץ-יתר של IFNG-AS1.ביטוי Cas9 אושר עבור שני השיבוטים. פריימרים נגד HPRT1 שימשו לאישור נוכחות של RNA בתאים שאינם מתמרים. ביטוי mRNA אושר על ידי השמטת התמלול ההפוך מתגובת cDNA.ניתן לזהות שלוש גרסאות splice של IFNG-AS1 עם ערכות פריימר ספציפיות לתעתיק או ערכת פריימר כנגד כל תעתיקי IFNG-AS1 הידועים. כל עקומות הפלואורסצנטיות היו אקספוננציאליות כאשר גן משק הבית HPRT1 הגיע לשלב המעריכי בתוך חצי מחזור בין שליטה לתאי ביטוי של IFNG-AS1 gRNA. פריימרים כנגד כל התמלילים הידועים של IFNG-AS1 היו הבולטים ביותר בין הניסויים, עם מדידות של גידולים של פי 20 בביטוי IFNG-AS1.עם זאת, התמליל השלישי של IFNG-AS1 הראה עלייה משמעותית של פי חמישה עד עשרה ברמות IFNG-AS1. כדי להדחיק באופן פעיל את הגן הרצוי, העיצוב של המדריך RNA בשלב 2.1 הוא קריטי להצלחת הפרוטוקול. בנוסף, ייצור של חלקיקים נגיפיים איכותיים יבטיח ביטוי חזק של רכיבי הפרוטוקול שלך.לאחר שהגן הרצוי מדוכא יתר על כן, ניתן לבצע מחקרים תפקודיים כדי לחקור את מנגנוני הגנים. בדוגמה שלנו, בחרנו להסתכל על ייצור ציטוקין בעקבות לחץ יתר של הגן שלנו של עניין. טכניקה זו פותחה בתחילה על ידי קבוצת גריסבאך בשנת 2013 והוחלה בהרחבה והורחבה על ידי קבוצות אחרות.התרגשנו ליישם טכניקה זו על RNAs ארוכים שאינם מקודדים על מנת לחקור את הפונקציות הספציפיות שלהם. lentiviruses פגום שכפול צריך להיות מטופל במעבדה שאושרה לעבודה ויראלית. בנוסף, קווי תאים אנושיים וחיידקי E.coli נחשבים biohazardous.לבסוף, פלסמיד DNA רקומביננטי צריך להיות מטופל על ידי צוות מיומן.

Research

JoVE Journal

Genetics

Sequence-specific and Selective Recognition of Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs by Chemically Modified Peptide Nucleic Acids

זיהוי רצף ספציפי, סלקטיבי של גדילי כפול RNAs מעל חד גדילי RNAs על ידי שינוי כימי חומצות גרעין פפטיד

RNAs are emerging as important biomarkers and therapeutic targets. Thus, there is great potential in developing chemical probes and therapeutic ligands ...

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-מתווכת אינטגרציה יישוב In Vivo באמצעות אסטרטגיה מבוסס על הצטרפות סוף בתיווך הומולוגיה

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

Metabolic Labeling and Profiling of Transfer RNAs Using Macroarrays

תיוג מטבולית, יצירת פרופילים של RNAs העברה באמצעות Macroarrays

Transfer RNAs (tRNA) are abundant short non-coding RNA species that are typically 76 to 90 nucleotides in length. tRNAs are directly responsible for ...

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

מהירה עם צינור נתיישב עבור יצירת מוטציות נקודה גנומית ב- C. elegans באמצעות CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

The clustered regularly interspersed palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (Cas9) prokaryotic adaptive immune defense system has been ...

Dissection of Enhancer Function Using Multiplex CRISPR-based Enhancer Interference in Cell Lines

דיסקציה של משפר תפקוד באמצעות הפרעות משפר מבוססי CRISPR מולטיפלקס בשורות תא

Multiple enhancers often regulate a given gene, yet for most genes, it remains unclear which enhancers are necessary for gene expression, and how these ...

CRISPR Guide RNA Cloning for Mammalian Systems

CRISPR מדריך ה-RNA שיבוט בתרבית של מערכות

The outlined protocol describes streamlined methods for the efficient and cost-effective generation of Cas9-associated guide RNAs. Two alternative ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

חלבון אנדוגני תיוג-אנוש המושרה בתאי גזע Pluripotent באמצעות CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas

הגנום עריכה בשורות תאים בתרבית של שימוש CRISPR-Cas

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) system functions naturally in bacterial adaptive immunity, but has been ...

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

היכרות גנטית הסתרה ישירות לתוך השלב Amastigote של טריאנוסומה cruzi באמצעות מערכת CRISPR/Cas9

Trypanosoma cruzi is a pathogenic protozoan parasite that causes Chagas&#8217; disease mainly in Latin America. In order to identify a novel drug target ...