Name: overexpressing long noncoding rnas using gene-activating crispr
Uploaded: 2019-03-01T15:00:00
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C.P. è supportato da DK60729 RO1 e P30 DK 41301-26. D.P. è supportato dal career development award di Crohn & colite Foundation (CCFA), cura: centro di ricerca Malattie Digestive (DDRC) DK41301 e UCLA clinica e traslazionale Science Institute (CTSI) UL1TR0001881. Il nucleo di virologia UCLA è stato finanziato dal centro di ricerca del AIDS (CFAR) concedere 5P 30 AI028697. Le tecnologie molecolari integrate di UCLA core è stato sostenuto dalla cura/P30 concedere DK041301. Questo lavoro è stato supportato anche dall'istituto UCLA AIDS.

Nota: È importante notare che questo protocollo usa lentivirus replica-carenti. Eseguire la gestione di virale solo dopo addestramento di sicurezza di laboratorio appropriati. Bleach tutti gli elementi e le superfici che vengono a contatto con virus vivi per un minimo di 10 min dopo la manipolazione. Uso una protezione monouso laboratorio di cappotto e viso e occhi, così come doppie guanti, in ogni momento. Eseguire lavori di virus in biosicurezza livello 2 + laboratori con certificazione virale. Dedic...

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	<li>Miao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trends+of+long+noncoding+RNA+research+from+2007+to+2016:+a+bibliometric+analysis.">Trends of long noncoding RNA research from 2007 to 2016: a bibliometric analysis.</a> Oncotarget. 8 (47), 83114-83127 (2017).</li><li>Derrien, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+GENCODE+v7+catalog+of+human+long+noncoding+RNAs:+analysis+of+their+gene+structure,+evolution,+and+expression.">The GENCODE v7 catalog of human long noncoding RNAs: analysis of their gene structure, evolution, and expression.</a> Genome Research. 22 (9), 1775-1789 (2012).</li><li>Johnsson, P., Lipovich, L., Grander, D., Morris, K. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+real-time+PCR+data+by+the+comparative+C(T)+method.">Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method.</a> Nature Protocols. 3 (6), 1101-1108 (2008).</li><li>Gomez, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NeST+long+ncRNA+controls+microbial+susceptibility+and+epigenetic+activation+of+the+interferon-gamma+locus.">The NeST long ncRNA controls microbial susceptibility and epigenetic activation of the interferon-gamma locus.</a> Cell. 152 (4), 743-754 (2013).</li><li>Padua, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+long+noncoding+RNA+signature+for+ulcerative+colitis+identifies+IFNG-AS1+as+an+enhancer+of+inflammation.">A long noncoding RNA signature for ulcerative colitis identifies IFNG-AS1 as an enhancer of inflammation.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 311 (3), G446-G457 (2016).</li><li>Collier, S. P., Henderson, M. A., Tossberg, J. T., Aune, T. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Scale+CRISPR-Mediated+Control+of+Gene+Repression+and+Activation.">Genome-Scale CRISPR-Mediated Control of Gene Repression and Activation.</a> Cell. 159 (3), 647-661 (2014).</li><li>Cheng, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+activation+of+endogenous+genes+by+CRISPR-on,+an+RNA-guided+transcriptional+activator+system.">Multiplexed activation of endogenous genes by CRISPR-on, an RNA-guided transcriptional activator system.</a> Cell Research. 23 (10), 1163-1171 (2013).</li><li>Matouskova, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reference+genes+for+real-time+PCR+quantification+of+messenger+RNAs+and+microRNAs+in+mouse+model+of+obesity.">Reference genes for real-time PCR quantification of messenger RNAs and microRNAs in mouse model of obesity.</a> PLoS One. 9 (1), e86033 (2014).</li></ol>

Questo manoscritto presenta un protocollo per l'utilizzo di attivazione CRISPR per overexpress lncRNAs in vitro. Si tratta di una tecnica particolarmente importante quando si studia a lungo non codificanti RNA come il prodotto di trascrittomica è l'unità funzionale. Dopo sovraespressione, il ricercatore può, quindi, utilizzare queste cellule per aumentare il rapporto segnale-rumore quando lo studio partner di legame e anche misurare le conseguenze cellulari di aumento dei livelli di lncRNAs. Come lncRNAs frequentement...

Mentre la ricerca biomedica più è incentrato su trascrizioni di proteina-codificazione, la maggior parte dei geni trascritti in realtà consiste di RNA non codificanti (Ensembl rilascio 93). La ricerca attuale sta cominciando ad esplorare questo campo, con il numero di pubblicazioni su lncRNAs nei processi di malattia aumenta in modo esponenziale tra 2007 e 20171. Queste pubblicazioni dimostrano che molti lncRNAs sono associate con la malattia. Tuttavia, i meccanismi molecolari di questi lncRNAs sono difficili da studiare a causa di loro diverse funzioni rispetto al mRNA. Ad aggravare il problema della comprensione del ruolo di lncRNAs nella malattia, lncRNAs sono spesso espressi a livelli inferiori a codificazione RNAs2. Inoltre, lncRNAs sono mal conservati, che limita gli studi funzionali in umani-cell-linea-based tecniche3. Un metodo per studiare il meccanismo di questi nuovi geni consiste in modo endogeno iperesprimono li in cellule coltivate. Sovraespressione studi possono fornire le principali informazioni per quanto riguarda la funzione dei geni specifici e consentire ai ricercatori di sezionare vie molecolari chiave.
Un nuovo metodo per attivare la trascrizione dei geni di lncRNA si basa su tecnologie CRISPR sviluppati inizialmente da Gersbach laboratorio4. Questo protocollo è stato adattato per uso in biologia di lncRNA e per l'espressione di questi geni in altri sistemi-modello. In CRISPR che overexpressing tecnica, una proteina chiamata proteina CRISPR 9 (Cas9) può essere diretto verso una sequenza di DNA tramite una gRNA antisenso che viene riconosciuto da Cas9. Normalmente, Cas9 indurranno la fenditura del DNA; Tuttavia, mutazioni in Cas9, precedentemente sviluppato per la tecnica di sovraespressione, disattivare questo passaggio5. Quando un attivatore trascrizionale è fusa ad un "morto" Cas9 (dCas9) e trasformata in linee cellulari, la sovraespressione endogena di lncRNAs può essere raggiunto4,6. L'aggiunta di ulteriori modifiche per il gRNA, consentendo ulteriori fattori trascrizionali di associare il gRNA, aumentato l'efficacia del sistema di attivazione del gene di dCas9 10 volte7. D'importanza, è stato dimostrato che l'attivazione trascrizionale richiede vicinanza (< 200 bp) iniziare la trascrizione geni sito, consentendo un upregulation specifici in aree ricche di gene7. A differenza delle tecnologie di knockout CRISPR, dCas9 e gRNA cassette devono essere integrati nel genoma per consentire le cellule a mantenere una sovraespressione nel corso di più generazioni. Un metodo per raggiungere questo obiettivo è utilizzare lentivirus per integrare le cassette contenenti dCas9 e gRNA. Dopo l'integrazione, l'espressione del gene di lncRNA può essere determinato.
In questo articolo, verrà dimostrato un protocollo per la sovraespressione di lncRNA in un modello di T-cellula di Jurkat. Una procedura dettagliata viene visualizzata e può essere adattata anche a cellule aderenti.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:837px;" width="837">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:245px;">Ampicillin</td>
			<td style="width:195px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:195px;">BP1760-5</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">CaCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:195px;">C1016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">cDNA synthesis kit (iScript)</td>
			<td style="width:195px;">BioRad</td>
			<td>1708891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">dCas9 forward primer</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:195px;">n/a</td>
			<td>5&#39;-TCGCCACAGCATAAAGAAGA&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">dCas9 reverse primer</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:195px;">n/a</td>
			<td>5&#39;-CTTTTCATGGTACGCCACCT</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">dCas9 vector</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:195px;">50918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM</td>
			<td>Corning</td>
			<td style="width:195px;">10013CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Ethanol</td>
			<td style="width:195px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:195px;">61509-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FBS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">gRNA plasmid</td>
			<td>VectorBuilder</td>
			<td style="width:195px;">VB180119-1195qxv</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEK293T cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td style="width:195px;">&#160;CRL-1573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:195px;">H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HPRT1 forward primer</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:195px;">n/a</td>
			<td>GACCAGTCAACAGGGGACAT&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HPRT1 reverse primer</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:195px;">n/a</td>
			<td>GCTTGCGACCTTGACCATCT</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hygromycin B</td>
			<td>Corning</td>
			<td style="width:195px;">MT3024CR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Isopropanol</td>
			<td style="width:195px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:195px;">BP2618-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Jurkat cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td style="width:195px;">&#160;TIB-152</td>
			<td style="width:203px;">clone E6-1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-glutamine</td>
			<td>Corning</td>
			<td style="width:195px;">25005Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LB agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1425-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LB broth</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1426-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Maxi-prep kit (Plasmid Purification Kit)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td style="width:195px;">12362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Na2HPO4</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:195px;">NIST2186II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Optimem I reduced serum media&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:195px;">31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">p24 elisa</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td style="width:195px;">NEK050B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">PBS</td>
			<td style="width:195px;">Corning</td>
			<td style="width:195px;">21-040-CMR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin and Streptomycin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pMDG2.G</td>
			<td>Addgene &#160;</td>
			<td style="width:195px;">#12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pMDLg/pRRE</td>
			<td>Addgene&#160;</td>
			<td style="width:195px;">#60488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Poly-L-Lysine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:195px;">P-4832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Polybrene</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td style="width:195px;">TR-1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pRSV-REV</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:195px;">#12253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Puromycin dihydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:195px;">P8833</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNA purification kit (Aurum RNA mini)</td>
			<td style="width:195px;">BioRad</td>
			<td>7326820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Butyrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:195px;">B5887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SYBR green (iTaq universal)</td>
			<td style="width:195px;">BioRad</td>
			<td>1725122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:195px;">X100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

overexpressing long noncoding rnas using gene-activating crispr

Lungo non codificanti RNA (lncRNA) biologia è un nuovo ed eccitante campo di ricerca, con il numero di pubblicazioni da questo settore in crescita esponenziale dal 2007. Questi studi hanno confermato che lncRNAs sono alterati in quasi tutte le malattie. Tuttavia, studiando i ruoli funzionali per lncRNAs nel contesto della malattia rimane difficile a causa della mancanza di prodotti proteici, espressione tessuto-specifica, i livelli di espressione bassa complessità nelle forme della giuntura e mancanza di conservazione tra specie. Dato l'espressione specie-specifica, gli studi lncRNA sono spesso limitati ai contesti di ricerca umana quando lo studio dei processi di malattia. Poiché lncRNAs funzionare a livello molecolare, un modo di sezionare lncRNA biologia è di rimuovere il lncRNA o dei overexpress gli effetti cellulari lncRNA e misura. In questo articolo, è presentato un protocollo scritto e visualizzato in quel momento ai overexpress lncRNAs in vitro. Come un esperimento rappresentanza, un lncRNA associato a malattia infiammatoria intestinale, l'interferone Gamma antisenso 1 (IFNG-AS1), è indicato per essere sovraespresso in un modello di T-cellula di Jurkat. A tale scopo, l'attivazione tecnica regolarmente interspaziati breve palindromi ripetizioni (CRISPR) cluster è possibile abilitare sovraespressione ai loci genomici endogeni. La tecnica d'attivazione di CRISPR si rivolge a un insieme di fattori di trascrizione per il sito di inizio trascrizionale di un gene, consentendo una robusta sovraespressione di molteplici forme di giuntura lncRNA. Questa procedura verrà essere suddivisi in tre passi, vale a dire (i) guida RNA (gRNA) progettazione e vettore di costruzione, (ii) virus generazione e trasduzione e screening (iii) Colonia per sovraespressione. Per questo esperimento rappresentanza, un maggiore di 20 volte aumento in IFNG-AS1 in cellule di T di Jurkat è stato osservato.

Un sistema di doppio vettore ai overexpress lncRNA IFNG-AS1 L'esperimento di esempio in questo manoscritto è la sovraespressione di un sistema di modello di T-cellula di Jurkat esprimendo il lncRNA IFNG-AS19. IFNG-AS1 è un lncRNA associato a malattia infiammatoria intestinale, che è stato visto per regolare il Gamma interferone10. Il gene di IFNG-AS1 contiene tre varianti di splicing che tutti utilizzare lo stesso sito...

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Overexpressing Long Noncoding RNAs Using Gene-activating CRISPR

Tecniche tradizionali basati su cDNA sovraespressione hanno una limitata applicabilità per la sovraespressione di RNA lunghi non codificanti a causa del loro più moduli di giunzione con funzionalità potenziale. Questa revisione segnala un protocollo utilizzando la tecnologia CRISPR per overexpress più varianti di splicing di un RNA lunghi non codificante.

Che overexpressing lunghi non codificanti RNA utilizzando CRISPR Gene-attivante

Long noncoding RNA (lncRNA) biology is a new and exciting field of research, with the number of publications from this field growing exponentially since ...

Gli RNA non di codifica hanno spesso più isoforme. Negli studi di sovraespressione in vitro, è spesso difficile studiare tutte queste isoforme espresse. Questa tecnica consente agli utenti di derivare l'espressione direttamente dal genoma e consentire alle cellule di esprimere le isoforme endogene per un particolare RNA non codificante.Questa potente tecnica consente all'utente di dirigere specificamente l'espressione di qualsiasi gene nel genoma con fedeltà e precisione. Progettando RNA guida a geni specifici, si è in grado di utilizzare i macchinari endogeni di splicing genico per esprimere le isoforme naturali in una data cellula. A dimostrare la procedura sarà Robert Rankin, un post-doc del mio laboratorio.Per progettare la sequenza di RNA guida che si trova all'interno di 100 coppie di basi del sito di partenza trascrizionale, utilizzare database genetici come BLAT per assicurarsi che l'RNA guida sia unico per il gene di interesse. Conservare l'RNA guida e i plasmidi Cas9 disattivati a quattro gradi Celsius. Striati E.coli su una piastra di agar di brodo Luria con ampicillina e fai crescere i batteri durante la notte a 37 gradi Celsius.Il giorno dopo, scegli una colonia e fai crescere i batteri in cinque millilitri di LB con ampicillina durante la notte, scuotendo vigorosamente il tubo in un incubatore Celsius di 37 gradi. Il giorno dopo, aggiungere due millilitri di batteri a 200 millilitri di LB con ampicillina in un pallone da due litri, scuotendo vigorosamente il pallone durante la notte in un incubatore di 37 gradi Celsius. Far girare i batteri a 3.724 volte g per 20 minuti e procedere alla purificazione del DNA.Per creare il lentivirus contenente dCas9, rivestire prima piatti di coltura tissutale da 100 millilitri con cinque millilitri dello 0,01% di poli-L-lisina e piatto cinque milioni di cellule HEK293T per piatto in 10 millilitri di Dulbecco Modificato Eagles Medium, quindi preparare campioni di trasfezione del DNA mescolando 10 microgrammi di un vettore di RNA guida contenente LTR o un vettore Cas9 disattivato contenente LTR con plasmidi contenenti componenti di virus. Aggiungere acqua a un volume totale di 450 microlitri e filtrare la miscela attraverso una punta filtrante da 0,2 micron attaccata a una siringa. Successivamente, aggiungere 50 microlitri di cloruro di calcio 2,5 molare ad ogni campione di trasfezione del DNA e mescolare delicatamente.Filtrare la miscela calcio-DNA attraverso una punta filtrante da 0,2 micron attaccata a una siringa. Pipetta 500 microlitri di 2X HBS in un tubo di polistirolo da cinque millilitri. Aggiungere 500 microlitri della miscela calcio-DNA dropwise e delicatamente vortice.Incubare a temperatura ambiente per tre minuti. Aggiungere un millilitro della sospensione HBS DNA-calcio a ogni piatto di coltura tissutale contenente HEK293T e incubarli in un incubatore di anidride carbonica al 5% a 37 gradi Celsius durante la notte. Il terzo giorno, rimuovere e scartare lentamente i supporti dai piatti.Lavare accuratamente le cellule con PBS una volta. Aggiungere sei millilitri di DMEM completo integrato con HEPES da 20 millimolare e butirato di sodio da 10 millimolare. Quindi incubare le cellule in un incubatore di anidride carbonica al 5% a 37 gradi Celsius per cinque o sei ore.Dopo l'incubazione, lavare le cellule con PBS una volta e aggiungere cinque millilitri di DMEM completo con HEPES da 20 millimolare alle cellule HEK293T. Incubare le cellule in un incubatore di anidride carbonica al 5% a 37 gradi Celsius per 12 ore. Il quarto giorno, raccogliere i supernatanti cellulari HEK293T e filtrare il supernatante contenente il virus.Per iniziare il conteggio delle particelle virali, diluire prima il concentrato di lavaggio dal kit P24 ELISA aggiungendo 19 parti di acqua distillata e deionizzata. Quindi, diluire il controllo positivo da questo kit a 200 nanogrammi per millilitro usando RPMI 1640 come diluente e fare diluizioni per una curva standard in tubi da 1,5 millilitri secondo la tabella di diluizione P24 ELISA. Per misurare la concentrazione del virus all'interno dei campioni aggiungere le diluizioni del campione ai pozzi designati di una piastra da 96 pozza, a partire dalla diluizione 1:1000 e modificare il volume se necessario per essere entro l'intervallo della curva standard.Quindi diluire i campioni con Triton X-100 a una concentrazione finale dello 0,5% e aggiungere 200 microlitri di ciascun campione e RPMI 1640 ai pozzi designati. Sigillare il piatto e incubarlo a 37 gradi Celsius per due ore. Lavare la piastra con 300 microlitri per pozzo del tampone di lavaggio 1X sei volte.Rimuovere il liquido in eccesso invertendo la piastra e toccandolo su un tovagliolo di carta. Quindi aggiungere 100 microlitri di anticorpo rivelatore dal kit a tutti i pozzi tranne il vuoto del substrato. Sigillare il piatto e incubarlo a 37 gradi Celsius per un'ora.Lavare la piastra e quindi rimuovere il liquido in eccesso invertendo la piastra e toccandolo su un tovagliolo di carta. Per misurare l'anticorpo rivelatore, diluire la perossidasi del rafano streptavidina a 1:100 diluizione con diluente SA-HRP. Mescolare accuratamente il SA-HRP diluito e aggiungere 100 microlitri a tutti i pozzi ad eccezione dello spazio vuoto.Sigillare e incubare la piastra a temperatura ambiente per 30 minuti. Quindi, lavare la piastra con il tampone di lavaggio 1X e toccare via il liquido in eccesso. Lasciare cadere una compressa di ortofenilendiammina in 11 millilitri del diluente del substrato per creare una soluzione di substrato sufficiente per una piastra.Vortice la soluzione OPD vigorosamente per scioglierla completamente e proteggerla dalla luce. Aggiungere 100 microlitri di soluzione di substrato OPD a tutti i pozzi compreso il vuoto. Utilizzando uno spettrofotometro, leggere immediatamente l'assorbanza a 450 nanometri.Ripetere 10 volte a intervalli di un secondo e prendere la misurazione media. Resuspend e coltura Jurkat T-cells in un pallone T75 con una densità di un milione di cellule in cinque millilitri del mezzo siero ridotto con polibrene. Quindi aggiungere supporti condizionati con HEK293T contenenti un milione di particelle virali contenenti dCas9.Incubare le cellule a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica. Tre giorni dopo l'infezione, spingi le cellule a 233 g per cinque minuti e le rimospendi in 10 millilitri di DMEM completo integrato con puromicina. Coltura delle cellule nei contenitori T75 e incubarle a 37 gradi Celsius con anidride carbonica al 5%.Ogni terzo giorno per un periodo di nove giorni, far girare le cellule a 233 volte g per cinque minuti e sostituire il supporto con il DMEM completo integrato con puromicina. Contare le cellule utilizzando un emocitometro o un contatore di celle automatizzato. Quindi, su una piastra da 96 porri con tessuto trattato con coltura tissutale, aggiungere 10.000 cellule in 100 microlitri del DMEM completo integrato con puromicina nel primo pozzo.Effettuare diluizioni seriali 1:1 del contenuto dei seguenti pozzi con il DMEM completo integrato con puromicina. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica. Espandere le cellule clonali in due piastre da 24 po ', quindi placcare due milioni di cellule per pozzo di una piastra di sei po 'per tre dei cloni.Placcare gli altri tre pozzi con celle di Jurkat non trasdotto come controlli. Infine, placcare le cellule in un pallone T75 e mettere le cellule in un incubatore di coltura cellulare durante la notte. Per iniziare la PCR quantitativa per misurare l'espressione genica, sintetizzare prima il DNA complementare aggiungendo un microgrammo di RNA, quattro microlitri del buffer di sintesi cDNA e un microliter di trascrittasi inversa a 250 tubi di microlitri, quindi aggiungere acqua a un volume finale di 20 microlitri.Quindi, utilizzare un ciclore termico a 42 gradi Celsius per 30 minuti e a 95 gradi Celsius per cinque minuti per inattivare la transcriptasi inversa. Diluire il cDNA con 60 microlitri di acqua dopo la sintesi. Eseguire reazioni a catena della polimerasi per tubi contenenti 0,5 microlitri di ciascun primer avanti e indietro alla concentrazione finale di 10 micromolari, cinque microlitri di verde SIBR e quattro microlitri di cDNA.Infine selezionare le celle Jurkat-dCas9 in DMEM integrate con igromicina B per 10 giorni. Spin giù le celle e cambiare il supporto ogni tre giorni. Purificare la RNAsi e procedere a RT-qPCR.In questo studio, sequenze di gRNA che si trovavano entro 10-100 coppie di basi lontano dal sito di partenza trascrizionale sono state utilizzate per dirigere il complesso ad attivazione Cas9 al locus trascrizionale di IFNG-AS1, un lungo RNA non di coingere associato alla malattia infiammatoria intestinale. Per consentire la selezione di cellule doppie trasdutte, è stato utilizzato un sistema a due plasmidi per trasdurre gli esaltatori dCas9 o gRNAse nelle cellule. Qui le proteine MS2 migliorano la sovraespressione di IFNG-AS1.L'espressione Cas9 è stata confermata per entrambi i cloni. I primer contro HPRT1 sono stati utilizzati per confermare la presenza di RNA nelle cellule non trasdotto. L'espressione di mRNA è stata confermata omettendo la transcriptasi inversa dalla reazione cDNA.Tre varianti di giunzione di IFNG-AS1 potrebbero essere rilevate con set di primer specifici della trascrizione o un primer impostato su tutte le trascrizioni IFNG-AS1 note. Tutte le curve di fluorescenza erano esponenziali con il gene delle pulizie HPRT1 che raggiungeva la fase esponenziale entro un mezzo ciclo tra il controllo e le cellule che esprimevano gRNA IFNG-AS1. I primer contro tutte le trascrizioni IFNG-AS1 conosciute erano i più rilevabili tra gli esperimenti, con misurazioni di aumenti di 20 volte nell'espressione IFNG-AS1.Tuttavia, la terza trascrizione di IFNG-AS1 ha mostrato un aumento significativo da cinque a 10 volte dei livelli IFNG-AS1. Per sovraesprimere attivamente il gene desiderato, la progettazione dell'RNA guida nel passaggio 2.1 è fondamentale per il successo del protocollo. Inoltre, la produzione di particelle virali di qualità garantirà una solida espressione dei componenti del protocollo.Una volta che il gene desiderato è sovraespresso, possono essere eseguiti studi funzionali per indagare i meccanismi genici. Nel nostro esempio, abbiamo scelto di esaminare la produzione di citochine in seguito alla sovraespressione del nostro gene di interesse. Questa tecnica è stata inizialmente sviluppata dal Gruppo Griesbach Nel 2013 ed è stata ampiamente applicata ed elaborata da altri gruppi.Eravamo entusiasti di applicare questa tecnica a lunghe RNA non codificate per esplorare le loro funzioni specifiche. I lentivirus difettosi alla replicazione devono essere trattati in un laboratorio che è stato approvato per il lavoro virale. Inoltre, le linee cellulari umane e i batteri E.coli sono considerati pericolosi per la vita.Infine, i plasmidi del DNA ricombinante devono essere maneggiati da personale addestrato.

Research

JoVE Journal

Genetics

Sequence-specific and Selective Recognition of Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs by Chemically Modified Peptide Nucleic Acids

Riconoscimento di sequenza-specifico e selettivo di Double-stranded RNA sopra Single-stranded RNA da modificati chimicamente acidi peptido nucleici

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Ricerca

Genetica

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