Name: overexpressing long noncoding rnas using gene-activating crispr
Uploaded: 2019-03-01T15:00:00
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C.P. は、RO1 DK60729 と P30 DK 41301-26 によってサポートされます。D. p. は、クローン ・大腸炎財団 (CCFA) キャリア開発賞、治療によってサポートされて: 消化器系疾患研究センター (DDRC) DK41301 とカリフォルニア大学ロサンゼルス校臨床トランスレーショナル科学研究所 (CTSI) UL1TR0001881。エイズ研究センター (CFAR) によって資金が供給された UCLA ウイルス コア 5 P 30 AI028697 を付与します。カリフォルニア大学ロサンゼルス校統合分子技術コアに支えられた治療法/P30 は、DK041301 を付与します。この作品は、カリフォルニア大学ロサンゼルス校エイズ研究所に支えられ。

注:このプロトコルが複製欠損のレンチを使用することに注意してくださいすることが重要です。ラボで適切な安全訓練の後にのみウイルス処理を実行します。すべてのアイテムおよび処理後 10 分の最低の生きているウイルスの接触表面を漂白剤します。使用使い捨て可能な実験室のコートと顔/目の保護だけでなく、二重の手袋はすべての回します。実験室バイオ セーフティ レ...

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	<li>Miao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trends+of+long+noncoding+RNA+research+from+2007+to+2016:+a+bibliometric+analysis.">Trends of long noncoding RNA research from 2007 to 2016: a bibliometric analysis.</a> Oncotarget. 8 (47), 83114-83127 (2017).</li><li>Derrien, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+GENCODE+v7+catalog+of+human+long+noncoding+RNAs:+analysis+of+their+gene+structure,+evolution,+and+expression.">The GENCODE v7 catalog of human long noncoding RNAs: analysis of their gene structure, evolution, and expression.</a> Genome Research. 22 (9), 1775-1789 (2012).</li><li>Johnsson, P., Lipovich, L., Grander, D., Morris, K. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+RNA-guided+activation+of+endogenous+human+genes.">CRISPR RNA-guided activation of endogenous human genes.</a> Nature Methods. 10 (10), 977-979 (2013).</li><li>Konermann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+transcriptional+activation+by+an+engineered+CRISPR-Cas9+complex.">Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex.</a> Nature. 517 (7536), 583-588 (2015).</li><li>Schmittgen, T. D., Livak, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+real-time+PCR+data+by+the+comparative+C(T)+method.">Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method.</a> Nature Protocols. 3 (6), 1101-1108 (2008).</li><li>Gomez, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NeST+long+ncRNA+controls+microbial+susceptibility+and+epigenetic+activation+of+the+interferon-gamma+locus.">The NeST long ncRNA controls microbial susceptibility and epigenetic activation of the interferon-gamma locus.</a> Cell. 152 (4), 743-754 (2013).</li><li>Padua, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+long+noncoding+RNA+signature+for+ulcerative+colitis+identifies+IFNG-AS1+as+an+enhancer+of+inflammation.">A long noncoding RNA signature for ulcerative colitis identifies IFNG-AS1 as an enhancer of inflammation.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 311 (3), G446-G457 (2016).</li><li>Collier, S. P., Henderson, M. A., Tossberg, J. T., Aune, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+Th1+genomic+locus+from+Ifng+through+Tmevpg1+by+T-bet.">Regulation of the Th1 genomic locus from Ifng through Tmevpg1 by T-bet.</a> Journal of Immunology. 193 (8), 3959-3965 (2014).</li><li>Kotake, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+non-coding+RNA+ANRIL+is+required+for+the+PRC2+recruitment+to+and+silencing+of+p15(INK4B)+tumor+suppressor+gene.">Long non-coding RNA ANRIL is required for the PRC2 recruitment to and silencing of p15(INK4B) tumor suppressor gene.</a> Oncogene. 30 (16), 1956-1962 (2011).</li><li>Gilbert, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Scale+CRISPR-Mediated+Control+of+Gene+Repression+and+Activation.">Genome-Scale CRISPR-Mediated Control of Gene Repression and Activation.</a> Cell. 159 (3), 647-661 (2014).</li><li>Cheng, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+activation+of+endogenous+genes+by+CRISPR-on,+an+RNA-guided+transcriptional+activator+system.">Multiplexed activation of endogenous genes by CRISPR-on, an RNA-guided transcriptional activator system.</a> Cell Research. 23 (10), 1163-1171 (2013).</li><li>Matouskova, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reference+genes+for+real-time+PCR+quantification+of+messenger+RNAs+and+microRNAs+in+mouse+model+of+obesity.">Reference genes for real-time PCR quantification of messenger RNAs and microRNAs in mouse model of obesity.</a> PLoS One. 9 (1), e86033 (2014).</li></ol>

この原稿は、ノザン lncRNAs 体外に CRISPR のアクティブ化を使用するためのプロトコルを示します。トランスクリプトーム製品は機能ユニット長鎖非コード Rna を勉強するとき、これは特に重要な手法です。過剰発現後研究者は結合パートナーを勉強して、信号対雑音比を増加も lncRNAs の増加レベルの細胞の結果を測定し、これらの細胞を使用できます。さらに、lncRNAs は、cis 遺伝子頻繁に基づ...

最も生物医学研究、蛋白質のコーディングの成績に焦点を当て、転写されている遺伝子の大半は実際に非翻訳 Rna (Ensembl リリース 93) ので構成されます。現在の研究は、2007 年と 20171間に指数関数的に上昇病気プロセスの lncRNAs の出版物の数と、この分野を開拓し始めています。これらの出版物は、多くの lncRNAs が病気に関連付けられているを示しています。ただし、これらの lncRNAs の分子機構は Mrna と比べて多様な機能のための勉強は難しいです。疾患における lncRNAs の役割を理解することの問題を複合、lncRNAs はコーディング RNAs2よりも低いレベルで表されます。さらに、lncRNAs は、人間のセル行ベース テクニック3機能研究を制限する不完全、保存されます。これらの新規遺伝子のメカニズムを勉強する 1 つの方法は、培養細胞でそれらを内生ノザンすることです。過剰発現研究は特定の遺伝子の機能に関して重要な情報を提供し、重要な分子経路を分析する研究者を有効にできます。
LncRNA 遺伝子の転写をアクティブにする新しいメソッドは、ゲルバッチ研究室4によって最初に開発された CRISPR 技術に基づいています。このプロトコルは、lncRNA 生物学で使用するため、他のモデル システムにおけるこれらの遺伝子の表現のために適応されています。テクニックを過剰発現 CRISPR、CRISPR 関連タンパク質 9 (Cas9) と呼ばれるタンパク質は Cas9 によって認識されるアンチセンス gRNA を介して DNA シーケンスへ送信できます。通常、Cas9 を誘発する DNA 切断;ただし、以前過剰発現手法の開発、Cas9 の突然変異は、このステップ5を非アクティブ化します。「死んだ」Cas9 に転写活性化因子を融合するとき (dCas9) 細胞に導入、lncRNAs の内因性の過剰発現は達成4,6をすることができます。その他の転写因子、gRNA にバインドするを有効にする、gRNA に修正を加える添加 dCas9 遺伝子活性化システムの有効性を増加した 10 倍7。重要なは、近接転写活性化が必要であることを示した (< 200 bp)、転写開始サイト遺伝子、遺伝子の豊富なエリア7で特定アップレギュレーションを有効にします。CRISPR ノックアウト技術とは異なり dCas9 と gRNA のカセットは、複数世代にわたって過剰発現を保持する細胞では、ゲノムに統合する必要があります。これを達成する 1 つの方法は、レンチを使用して dCas9 と gRNA を含むカセットを統合することです。統合後、lncRNA の遺伝子発現を決定できます。
この記事で Jurkat T 細胞モデルにおける lncRNA 発現のためのプロトコルが表示されます。ステップバイ ステップの手順が表示され、また付着性のセルに適応することができます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:837px;" width="837">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:245px;">Ampicillin</td>
			<td style="width:195px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:195px;">BP1760-5</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">CaCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:195px;">C1016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">cDNA synthesis kit (iScript)</td>
			<td style="width:195px;">BioRad</td>
			<td>1708891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">dCas9 forward primer</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:195px;">n/a</td>
			<td>5&#39;-TCGCCACAGCATAAAGAAGA&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">dCas9 reverse primer</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:195px;">n/a</td>
			<td>5&#39;-CTTTTCATGGTACGCCACCT</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">dCas9 vector</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:195px;">50918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM</td>
			<td>Corning</td>
			<td style="width:195px;">10013CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Ethanol</td>
			<td style="width:195px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:195px;">61509-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FBS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">gRNA plasmid</td>
			<td>VectorBuilder</td>
			<td style="width:195px;">VB180119-1195qxv</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEK293T cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td style="width:195px;">&#160;CRL-1573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:195px;">H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HPRT1 forward primer</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:195px;">n/a</td>
			<td>GACCAGTCAACAGGGGACAT&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HPRT1 reverse primer</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:195px;">n/a</td>
			<td>GCTTGCGACCTTGACCATCT</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hygromycin B</td>
			<td>Corning</td>
			<td style="width:195px;">MT3024CR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Isopropanol</td>
			<td style="width:195px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:195px;">BP2618-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Jurkat cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td style="width:195px;">&#160;TIB-152</td>
			<td style="width:203px;">clone E6-1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-glutamine</td>
			<td>Corning</td>
			<td style="width:195px;">25005Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LB agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1425-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LB broth</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1426-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Maxi-prep kit (Plasmid Purification Kit)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td style="width:195px;">12362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Na2HPO4</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:195px;">NIST2186II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Optimem I reduced serum media&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:195px;">31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">p24 elisa</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td style="width:195px;">NEK050B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">PBS</td>
			<td style="width:195px;">Corning</td>
			<td style="width:195px;">21-040-CMR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin and Streptomycin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pMDG2.G</td>
			<td>Addgene &#160;</td>
			<td style="width:195px;">#12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pMDLg/pRRE</td>
			<td>Addgene&#160;</td>
			<td style="width:195px;">#60488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Poly-L-Lysine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:195px;">P-4832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Polybrene</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td style="width:195px;">TR-1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pRSV-REV</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:195px;">#12253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Puromycin dihydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:195px;">P8833</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNA purification kit (Aurum RNA mini)</td>
			<td style="width:195px;">BioRad</td>
			<td>7326820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Butyrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:195px;">B5887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SYBR green (iTaq universal)</td>
			<td style="width:195px;">BioRad</td>
			<td>1725122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:195px;">X100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

overexpressing long noncoding rnas using gene-activating crispr

長鎖非コード RNA (lncRNA) 生物学は 2007 年以来指数関数的に成長しているこの分野の出版物の数との研究の新しいでエキサイティングなフィールドです。これらの研究では、lncRNAs は、ほとんどすべての疾患に変更されてことを確認しました。ただし、疾患のコンテキストで lncRNAs の機能的役割を勉強はスプライス フォームの複雑さ、低発現、組織特異的発現タンパク質製品の欠如と種の保全の欠如のために困難。種特異的な発現を与え、lncRNA 研究が多い人間研究の文脈に制限された病気プロセスを学ぶとき。LncRNAs は、分子レベルで機能するので、lncRNA 生物学を分析する方法の 1 つは、lncRNA を削除または lncRNA とメジャーの細胞効果をノザンです。この記事でノザン lncRNAs 体外に書かれ、可視化プロトコルを提案する.代表的な実験としてインターフェロン ガンマ アンチセンス 1 (IFNG AS1)、炎症性腸疾患に関連付けられている、lncRNA は Jurkat T 細胞モデルで過剰に発現するのに表示されます。これを行うには、アクティブ クラスター化された定期的に空間の短い回文繰り返し (CRISPR) 技術を使用して、内因性のゲノム遺伝子の過剰発現を有効に。活性化の CRISPR 技術目標は複数 lncRNA スプライス フォームの堅牢な過剰発現を有効に、遺伝子の転写開始サイトに転写因子のセット。この手順は、3 つのステップ、すなわち (i) ガイド RNA (gRNA) 設計とベクトル建設、(ii) ウイルス生成と伝達、および (iii) コロニー発現スクリーニングに分解されます。この代表的な実験のため Jurkat T 細胞における IFNG AS1 で造影効果が 20 よりも大きいのです。

ノザン lncRNA IFNG AS1 に二重ベクトル システム 本稿では例の実験は IFNG AS19lncRNA を表現する Jurkat T 細胞系の過剰発現です。IFNG AS1 はインターフェロン γ10を規制する見られている炎症性腸疾患に関連付けられている、lncRNA です。AS1 IFNG 遺伝子には、すべてが同じ遺伝子の転写開始サイト (図 1 a) ?...

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Overexpressing Long Noncoding RNAs Using Gene-activating CRISPR

伝統的な cDNA を用いた発現技術の潜在的な機能を持つ、複数のスプライス フォームによる長鎖非コード Rna 発現限定適用しています。このレビューは、長鎖非コード RNA の複数のスプライスバリアント ノザンに CRISPR 技術を使用してプロトコルを報告します。

CRISPR の遺伝子活性化を使用して長い Rna を過剰発現

Long noncoding RNA (lncRNA) biology is a new and exciting field of research, with the number of publications from this field growing exponentially since ...

非コーディングRNAは、多くの場合、複数のアイソフォームを持っています。インビトロ過剰発現研究では、これらの表現されたアイソフォームをすべて研究することはしばしば困難である。この技術により、ゲノムから直接発現を導き出し、細胞が特定の非コードRNAに対して内在性アイソフォームを発現することを可能にする。この強力な技術により、ユーザーは正確性と正確性を持つゲノム内の任意の遺伝子の発現を特異的に指示することができます。特定の遺伝子に対するガイドRNAを設計することにより、内因性遺伝子スプライシング機械を使用して、所定の細胞内で自然なアイソフォームを発現することができる。手順を実証することは、私の研究室のポストドクターであるロバート・ランキンです。転写開始部位の100塩基対内に位置するガイドRNA配列を設計するには、BLATなどの遺伝データベースを使用して、ガイドRNAが対象遺伝子に固有であることを確認します。ガイドRNAと非活性化Cas9プラスミドを摂氏4度で保存します。アンピシリンとルリアスープ寒天プレートに大腸菌をストリークアウトし、摂氏37度で一晩細菌を成長させます。翌日、コロニーを摘み取り、一晩アンピシリンでLBの5ミリリットルで細菌を増殖させ、37°Cインキュベーターでチューブを激しく振る。翌日、2リットルフラスコにアンピシリンを入したLBの200ミリリットルに2ミリリットルの細菌を加え、37°Cのインキュベーターで一晩フラスコを激しく振る。3,724回gで20分間細菌をスピンダウンし、DNA精製に進みます。dCas9含有レンチウイルスを作成するには、最初に0.01%ポリL-リジンの5ミリリットルで100ミリリットルの組織培養皿をコーティングし、完全なダルベッコの修正イーグルスミディアムの10ミリリットルで1皿あたり500万HEK293T細胞をプレート、 次に、10マイクログラムのLTR含有ガイドRNAベクターまたはLTR含有非活性化Cas9ベクターをウイルスの成分を含むプラスミドと混合してDNAトランスフェクションサンプルを調製する。450マイクロリットルの総体積に水を加え、注射器に取り付けられた0.2ミクロンのフィルターチップを通して混合物を濾過します。次に、DNAのトランスフェクションサンプルごとに2.5モルの二塩化カルシウム50マイクロリットルを加え、穏やかに混ぜます。シリンジに取り付けられた0.2ミクロンのフィルターチップを通してカルシウムとDNAの混合物を濾過します。ピペット500マイクロリットルの2X HBSを5ミリリットルポリスチレンチューブに。カルシウム-DNA混合物の500マイクロリットルを滴下し、穏やかに渦を加えます。室温で3分間インキュベートします。各HEK293T含有組織培養皿にDNA-カルシウムHBS懸濁液を1ミリリットル加え、一晩で摂氏37度で5%の二酸化炭素インキュベーターにインキュベートします。3日目には、ゆっくりと皿からメディアを取り出して捨てます。PBSで細胞を一度慎重に洗ってください。20ミリモルHEPESと10ミリモルのナトリウムブトイレートを補った完全なDMEMの6ミリリットルを追加します。その後、5%の二酸化炭素インキュベーターで5〜6時間摂氏37度で細胞をインキュベートします。インキュベーション後、PBSで細胞を1回洗浄し、HEPESを20ミリモルHEPESで完全なDMEMを5ミリリットル加えてHEK293T細胞に加えます。5%の二酸化炭素インキュベーターで細胞を摂氏37度で12時間インキュベートする。4日目にHEK293T細胞上清を収集し、ウイルスを含む上清をフィルタリングします。ウイルス粒子数を開始するには、まず、蒸留水の19部を加えて、P24 ELISAキットから洗浄濃縮物を希釈する。次に、このキットから200ナノグラムに希釈して、RPMI 1640を希釈剤として使用し、P24 ELISA希釈テーブルに従って1.5ミリリットルチューブの標準曲線の希釈液を作ります。サンプル内のウイルスの濃度を測定するには、サンプル希釈液を96ウェルプレートの指定ウェルに加え、1:1000希釈から始め、必要に応じて体積を変更して標準曲線の範囲内に収まるようにします。その後、トリトンX-100でサンプルを0.5%の最終濃度に希釈し、各サンプルとRPMI 1640の200マイクロリットルを指定されたウェルに加えます。プレートを密封し、摂氏37度で2時間インキュベートします。1X洗浄バッファーのウェルあたり300マイクロリットルでプレートを6回洗います。プレートを反転し、ペーパータオルでタップして余分な液体を取り除きます。次に、キットから100マイクロリットルの検出器抗体を、基板ブランク以外のすべてのウェルに追加します。プレートを密封し、摂氏37度で1時間インキュベートします。プレートを洗い、余分な液体を取り除きます。検出器抗体を測定するために、ストレプトアビジン・ワサビペルオキシダーゼをSA-HRP希釈液で1:100希釈で希釈する。希釈したSA-HRPを十分に混ぜ、ブランクを除くすべてのウェルに100マイクロリットルを加えます。プレートを密封し、室温で30分間インキュベートします。次に、1X洗浄バッファーでプレートを洗浄し、余分な液体をタップします。1つのプレートに十分な基板溶液を作るために、11ミリリットルの基板希釈液にオルソフェニレンジアミン錠剤を1つ落とします。OPD溶液を精力的に渦液にして完全に溶解し、光から保護します。ブランクを含むすべてのウェルにOPD基質溶液の100マイクロリットルを加えます。分光光度計を用いて、450ナノメートルで吸光度を直ちに読み取る。1秒間隔で10回繰り返し、平均測定を行います。再懸濁培養を行い、T75フラスコ内のジュルカットT細胞をポリブレンを用いた血清培地の5ミリリットルに100万個の密度を有する。その後、100万個のdCas9含有ウイルス粒子を含むHEK293Tコンディショネド培地を追加します。5%の二酸化炭素で37°Cで細胞をインキュベートします。感染後3日間、233時間gで細胞を5分間スピンダウンし、ピューロマイシンを補充した完全なDMEMの10ミリリットルでそれらを再中断する。T75フラスコで細胞を培養し、5%の二酸化炭素で摂氏37度で培養します。9日間の3日ごとに、5分間233回gで細胞をスピンダウンし、ピューロマイシンを補充した完全なDMEMで培地を置き換えます。ヘモサイトメーターまたは自動セルカウンターを使用して細胞を数えます。次いで、培養処理組織を有する96ウェルプレート上に、第1ウェルでピューロマイシンを添加した完全なDMEMの100マイクロリットルに10,000個の細胞を加える。ピューロマイシンを補充した完全なDMEMで、以下のウェルの内容物の1:1シリアル希釈を行います。5%の二酸化炭素で37°Cで細胞をインキュベートします。クローン細胞を2つの24ウェルプレートに拡大し、3つのクローンの6ウェルプレートのウェルあたり200万個の細胞をプレートします。他の3つの井戸に非形化されたユルカット細胞をコントロールとしてプレートします。最後に、細胞をT75フラスコにプレートし、細胞を細胞培養インキュベーターに一晩入れます。定量的PCRを開始して遺伝子発現を測定するには、まずRNAのマイクログラム1マイクログラム、cDNA合成バッファー4マイクロリットル、逆転写酵素1マイクロリットルを250マイクロリットルチューブに加えて相補DNAを合成し、次に20マイクロリットルの最終体積に水を加えます。その後、サーマルサイクラーを摂氏42度で30分間、摂氏95度で5分間使用して逆転写酵素を不活性化します。合成後、60マイクロリットルの水でcDNAを希釈します。各前方および逆プライマーの0.5マイクロリットルを含むチューブに対してポリメラーゼ連鎖反応を実行し、最終的な濃度は10マイクロモル、5マイクロリットルのSYBRグリーン、4マイクロリットルのcDNAを使用します。最後に、10日間ハイグロマイシンBを補充DMEMのジュルカットdCas9細胞を選択します。細胞をスピンダウンし、3日ごとにメディアを変更します。RNAse を精製し、RT-qPCR に進みます。本研究では、転写開始部位から離れた10〜100塩基対内にあったgRNA配列を、炎症性腸疾患に関連する長い非コードRNAであるIFNG-AS1の転写軌跡にCas9活性化複合体を導くために使用された。二重導入細胞の選択を可能にするために、2プラスミド系を使用して、dCas9またはgRNAEエンハンサーのいずれかを細胞に入れ移した。ここでMS2タンパク質はIFNG-AS1の過剰発現を増強する。Cas9の発現は両方のクローンについて確認された。HPRT1に対するプライマーを用い、非導入細胞中のRNAの存在を確認した。cDNA反応から逆転写酵素を省略することによりmRNA発現を確認した。IFNG-AS1の3つのスプライス変異体は、全ての既知のIFNG-AS1転写物に対して、転写特異的なプライマーセットまたはプライマーセットのいずれかで検出できる。すべての蛍光曲線は指数関数的であり、ハウスキーピング遺伝子HPRT1は、制御細胞とIFNG-AS1 gRNA発現細胞の間の半サイクル内で指数位相に達した。すべての既知のIFNG-AS1転写物に対するプライマーは、IFNG-AS1発現の20倍の増加の測定で、実験の間に最も検出可能であった。しかし、IFNG-AS1の第3転写産物は、IFNG-AS1レベルの5〜10倍有意な増加を示した。目的の遺伝子を積極的に過剰発現させるためには、ステップ2.1のガイドRNAの設計は、プロトコルの成功にとって非常に重要です。さらに、高品質のウイルス粒子の製造は、プロトコルコンポーネントの堅牢な表現を保証します。所望の遺伝子が過剰発現すると、機能性の研究が行われ、遺伝子機構を調査することができる。我々の例では、関心のある遺伝子の過剰発現に続くサイトカイン産生を見ることを選んだ。この技術は、2013年にグリースバッハグループによって開発され、他のグループによって広く適用され、詳述されています。私たちは、この技術を長い非コード化RNAに適用して、その特定の機能を探求することに興奮しました。複製不良レンチウイルスは、ウイルスの作業のために承認された実験室で処理する必要があります。さらに、ヒト細胞株および大腸菌は、生体有害性と考えられている。最後に、組換えDNAプラスミドは訓練を受けたスタッフによって処理されるべきです。

Research

JoVE Journal

Genetics

Sequence-specific and Selective Recognition of Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs by Chemically Modified Peptide Nucleic Acids

一本鎖 Rna の二重鎖 Rna の特定のシーケンスで選択的な認識化学修飾ペプチド核酸

RNAs are emerging as important biomarkers and therapeutic targets. Thus, there is great potential in developing chemical probes and therapeutic ligands ...

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9 仲介の対象となる統合生体内で相同性を介した終わり参加ベースの戦略を使用して

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

Metabolic Labeling and Profiling of Transfer RNAs Using Macroarrays

代謝ラベリングと Macroarrays を使用して転移 Rna のプロファイリング

Transfer RNAs (tRNA) are abundant short non-coding RNA species that are typically 76 to 90 nucleotides in length. tRNAs are directly responsible for ...

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

迅速かつ安易なパイプラインを生成する突然変異点ゲノムにc. の elegansを用いた CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

The clustered regularly interspersed palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (Cas9) prokaryotic adaptive immune defense system has been ...

Dissection of Enhancer Function Using Multiplex CRISPR-based Enhancer Interference in Cell Lines

細胞を用いた多重 CRISPR ベース エンハンサー干渉エンハンサー機能の解剖

Multiple enhancers often regulate a given gene, yet for most genes, it remains unclear which enhancers are necessary for gene expression, and how these ...

CRISPR Guide RNA Cloning for Mammalian Systems

哺乳類システムのクローン作成 CRISPR ガイド RNA

The outlined protocol describes streamlined methods for the efficient and cost-effective generation of Cas9-associated guide RNAs. Two alternative ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

人間でタグ内因性のタンパク質誘導多能性幹細胞 CRISPR/Cas9 を使用して

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas

CRISPR Cas を用いた哺乳類細胞におけるゲノム編集

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) system functions naturally in bacterial adaptive immunity, but has been ...

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

CRISPR/Cas9システムを用いたトリパノソマ・クルジのアマスティゴットステージに遺伝子ノックアウトを直接導入

Trypanosoma cruzi is a pathogenic protozoan parasite that causes Chagas&#8217; disease mainly in Latin America. In order to identify a novel drug target ...