Name: overexpressing long noncoding rnas using gene-activating crispr
Uploaded: 2019-03-01T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Overexpressing Long Noncoding RNAs Using Gene-activating CRISPR at JoVE.com

C.P.는 RO1 DK60729 및 P30 DK 41301-26에 의해 지원 됩니다. D.P.는 크 론 & Colitis 재단 (CCFA) 경력 개발 상, 치료에 의해 지원 됩니다: 소화기 질환 연구 센터 (DDRC) DK41301, 그리고 UCLA 임상 및 변환 과학 연구소 (CTSI) UL1TR0001881. Ucla의 바이러스학 코어로는 센터의 에이즈 연구 (CFAR) 투자 되었다 5 P 30 AI028697를 부여. 핵심 치료/P30에 의해 지원 되었다 UCLA 통합 분자 기술 DK041301를 부여 합니다. 이 작품 또한 UCLA 에이즈 연구소에 의해 지원 되었다.

참고: 이 프로토콜에서는 복제 불충분 한 lentiviruses 중요 하다. 적절 한 실험실 안전 훈련 후에 바이러스 처리를 수행 합니다. 모든 항목 및 표면 처리 후 최소 10 분에 대 한 라이브 바이러스 접촉에 표 백제. 사용 일회용 랩 코트와 얼굴/눈 보호로 이중 장갑, 항상. Biosafety 수준 2 + 실험실 바이러스 인증 바이러스 작업을 수행 합니다. 바이러스 성 일 조직 문화 후드와 인큐베이터를 칩니...

<ol>
	<li>Miao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trends+of+long+noncoding+RNA+research+from+2007+to+2016:+a+bibliometric+analysis.">Trends of long noncoding RNA research from 2007 to 2016: a bibliometric analysis.</a> Oncotarget. 8 (47), 83114-83127 (2017).</li><li>Derrien, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+GENCODE+v7+catalog+of+human+long+noncoding+RNAs:+analysis+of+their+gene+structure,+evolution,+and+expression.">The GENCODE v7 catalog of human long noncoding RNAs: analysis of their gene structure, evolution, and expression.</a> Genome Research. 22 (9), 1775-1789 (2012).</li><li>Johnsson, P., Lipovich, L., Grander, D., Morris, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+conservation+of+long+non-coding+RNAs;+sequence,+structure,+function.">Evolutionary conservation of long non-coding RNAs; sequence, structure, function.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1840 (3), 1063-1071 (2014).</li><li>Perez-Pinera, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-guided+gene+activation+by+CRISPR-Cas9-based+transcription+factors.">RNA-guided gene activation by CRISPR-Cas9-based transcription factors.</a> Nature Methods. 10 (10), 973-976 (2013).</li><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity.">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li><li>Maeder, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+RNA-guided+activation+of+endogenous+human+genes.">CRISPR RNA-guided activation of endogenous human genes.</a> Nature Methods. 10 (10), 977-979 (2013).</li><li>Konermann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+transcriptional+activation+by+an+engineered+CRISPR-Cas9+complex.">Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex.</a> Nature. 517 (7536), 583-588 (2015).</li><li>Schmittgen, T. D., Livak, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+real-time+PCR+data+by+the+comparative+C(T)+method.">Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method.</a> Nature Protocols. 3 (6), 1101-1108 (2008).</li><li>Gomez, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NeST+long+ncRNA+controls+microbial+susceptibility+and+epigenetic+activation+of+the+interferon-gamma+locus.">The NeST long ncRNA controls microbial susceptibility and epigenetic activation of the interferon-gamma locus.</a> Cell. 152 (4), 743-754 (2013).</li><li>Padua, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+long+noncoding+RNA+signature+for+ulcerative+colitis+identifies+IFNG-AS1+as+an+enhancer+of+inflammation.">A long noncoding RNA signature for ulcerative colitis identifies IFNG-AS1 as an enhancer of inflammation.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 311 (3), G446-G457 (2016).</li><li>Collier, S. P., Henderson, M. A., Tossberg, J. T., Aune, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+Th1+genomic+locus+from+Ifng+through+Tmevpg1+by+T-bet.">Regulation of the Th1 genomic locus from Ifng through Tmevpg1 by T-bet.</a> Journal of Immunology. 193 (8), 3959-3965 (2014).</li><li>Kotake, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+non-coding+RNA+ANRIL+is+required+for+the+PRC2+recruitment+to+and+silencing+of+p15(INK4B)+tumor+suppressor+gene.">Long non-coding RNA ANRIL is required for the PRC2 recruitment to and silencing of p15(INK4B) tumor suppressor gene.</a> Oncogene. 30 (16), 1956-1962 (2011).</li><li>Gilbert, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Scale+CRISPR-Mediated+Control+of+Gene+Repression+and+Activation.">Genome-Scale CRISPR-Mediated Control of Gene Repression and Activation.</a> Cell. 159 (3), 647-661 (2014).</li><li>Cheng, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+activation+of+endogenous+genes+by+CRISPR-on,+an+RNA-guided+transcriptional+activator+system.">Multiplexed activation of endogenous genes by CRISPR-on, an RNA-guided transcriptional activator system.</a> Cell Research. 23 (10), 1163-1171 (2013).</li><li>Matouskova, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reference+genes+for+real-time+PCR+quantification+of+messenger+RNAs+and+microRNAs+in+mouse+model+of+obesity.">Reference genes for real-time PCR quantification of messenger RNAs and microRNAs in mouse model of obesity.</a> PLoS One. 9 (1), e86033 (2014).</li></ol>

이 원고는 생체 외에서 lncRNAs overexpress를 CRISPR를 활성화 사용 하 여 프로토콜을 선물 한다. 이 긴 noncoding RNAs transcriptomic 제품 기능 단위는 공부를 할 때 특히 중요 한 기술입니다. Overexpression, 후 연구원 수, 다음, 사용 하 여 이러한 셀 바인딩 파트너를 공부를 할 때 신호 대 잡음 비율을 증가 하 여도 세포 lncRNAs의 증가 수준 결과 측정. 또한, lncRNAs 자주 독립-유전자, 행동으로이 생 overexpression 기술을...

가장 생물 의학 연구는 단백질 코딩 성적표를 중점적으로, 베낀된 유전자의 대다수는 실제로 noncoding RNAs (합 자료 93)의 구성 됩니다. 현재 연구는 2007 년과 20171사이 기 하 급수적으로 상승 하는 질병 과정에서 lncRNAs에 간행물의 수와 함께이 필드를 탐험 시작 됩니다. 이 간행물은 많은 lncRNAs 질병와 관련 된 보여 줍니다. 그러나,이 lncRNAs의 분자 메커니즘은 mRNAs에 비해 그들의 다양 한 기능으로 인해 공부 하기가 어렵습니다. LncRNAs 질병에서의 역할 이해의 문제를 다중, lncRNAs 주로 코딩 RNAs2보다 하위 수준에 표시 됩니다. 또한, lncRNAs는 가난 하 게 보존, 인간의 세포 라인 기반 기술3기능 연구를 제한 하. 이 비 발한 유전자의 메커니즘을 연구 한 방법은 endogenously 경작된 한 세포에 overexpress 것입니다. Overexpression 학문 특정 한 유전자의 기능으로 중요 한 정보를 제공 하 고 연구원은 주요 분자 경로 해 부를 수 있도록 수 있습니다.
LncRNA 유전자의 전사를 활성화 하는 새로운 방법은 게르 바흐 연구소4에 의해 처음 개발 하는 CRISPR 기술을 기반으로 합니다. 이 프로토콜은 lncRNA 생물학에서 사용 하 고 다른 모델 시스템에서이 유전자의 표현에 대 한 적응 되었습니다. 기술 overexpressing CRISPR에서 CRISPR 관련 단백질 9 (Cas9) 이라고 불리는 단백질 Cas9에 의해 인식 되는 센스 gRNA 통해 DNA 시퀀스를 향해 이동 수 있습니다. 일반적으로, Cas9 DNA 분열;을 유발 한다 그러나, Cas9, 이전 overexpression 기술에 대 한 개발에 변이이 단계5를 비활성화 합니다. "죽은" Cas9에 transcriptional 활성 제를 융합 하는 때 (dCas9) 셀 라인으로 불리고, lncRNAs의 생 overexpression 수 달성된4,6. DCas9 유전자 활성화 시스템의 효능을 증가 하는 gRNA, gRNA에 바인딩할 추가 transcriptional 요소 사용에 대 한 추가 수정 추가 사진7. 중요 한 것은, 그것 transcriptional 활성화 근접에서는 시연 했다 (< 200 bp)는 transcriptional 시작 사이트 유전자, 유전자 풍부한 지역7에 특정 upregulation를 사용. CRISPR 녹아웃 기술, 달리 dCas9 및 gRNA 카세트는 여러 세대에 걸쳐 overexpression를 유지 하기 위해 셀 수 있도록 게놈으로 통합 될 필요가 있다. 이를 위해 한 가지 방법은 dCas9 및 gRNA 포함 된 카세트를 통합 lentiviruses를 사용 하는 것입니다. 통합 후 lncRNA 유전자 발현을 확인할 수 있습니다.
이 문서에서는, lncRNA overexpression Jurkat T 세포 모델에 대 한 프로토콜 시연 됩니다. 단계별 절차는 표시 되 고 또한 부착 셀에 적용할 수 있습니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:837px;" width="837">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:245px;">Ampicillin</td>
			<td style="width:195px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:195px;">BP1760-5</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">CaCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:195px;">C1016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">cDNA synthesis kit (iScript)</td>
			<td style="width:195px;">BioRad</td>
			<td>1708891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">dCas9 forward primer</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:195px;">n/a</td>
			<td>5&#39;-TCGCCACAGCATAAAGAAGA&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">dCas9 reverse primer</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:195px;">n/a</td>
			<td>5&#39;-CTTTTCATGGTACGCCACCT</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">dCas9 vector</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:195px;">50918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM</td>
			<td>Corning</td>
			<td style="width:195px;">10013CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Ethanol</td>
			<td style="width:195px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:195px;">61509-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FBS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">gRNA plasmid</td>
			<td>VectorBuilder</td>
			<td style="width:195px;">VB180119-1195qxv</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEK293T cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td style="width:195px;">&#160;CRL-1573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:195px;">H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HPRT1 forward primer</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:195px;">n/a</td>
			<td>GACCAGTCAACAGGGGACAT&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HPRT1 reverse primer</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:195px;">n/a</td>
			<td>GCTTGCGACCTTGACCATCT</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hygromycin B</td>
			<td>Corning</td>
			<td style="width:195px;">MT3024CR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Isopropanol</td>
			<td style="width:195px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:195px;">BP2618-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Jurkat cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td style="width:195px;">&#160;TIB-152</td>
			<td style="width:203px;">clone E6-1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-glutamine</td>
			<td>Corning</td>
			<td style="width:195px;">25005Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LB agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1425-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LB broth</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1426-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Maxi-prep kit (Plasmid Purification Kit)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td style="width:195px;">12362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Na2HPO4</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:195px;">NIST2186II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Optimem I reduced serum media&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:195px;">31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">p24 elisa</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td style="width:195px;">NEK050B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">PBS</td>
			<td style="width:195px;">Corning</td>
			<td style="width:195px;">21-040-CMR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin and Streptomycin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pMDG2.G</td>
			<td>Addgene &#160;</td>
			<td style="width:195px;">#12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pMDLg/pRRE</td>
			<td>Addgene&#160;</td>
			<td style="width:195px;">#60488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Poly-L-Lysine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:195px;">P-4832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Polybrene</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td style="width:195px;">TR-1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pRSV-REV</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:195px;">#12253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Puromycin dihydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:195px;">P8833</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNA purification kit (Aurum RNA mini)</td>
			<td style="width:195px;">BioRad</td>
			<td>7326820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Butyrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:195px;">B5887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SYBR green (iTaq universal)</td>
			<td style="width:195px;">BioRad</td>
			<td>1725122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:195px;">X100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

overexpressing long noncoding rnas using gene-activating crispr

긴 noncoding RNA (lncRNA) 생물학 연구, 2007 년 이후 기 하 급수적으로 성장 하는이 분야에서 간행물의 수의 새롭고 흥미로운 분야 이다. 이러한 연구는 lncRNAs 거의 모든 질병에 변경 되는 것 확인 했습니다. 그러나, 질병의 맥락에서 lncRNAs에 대 한 기능적 역할을 공부 하 고 단백질 제품, 조직의 특정 식, 낮은 식 레벨, 결합 한 형태로, 복잡 한의 부족 종 가운데 보존의 부족으로 어려운 남아 있다. 감안할 때 종의 식, lncRNA 연구는 종종 인간의 연구 컨텍스트 제한 질병 과정 공부를 할 때. LncRNAs는 분자 수준에서 작동, 이므로 lncRNA 생물 해 부 방법 중 하나는 lncRNA를 제거 하거나 overexpress lncRNA 및 측정 세포 효과. 이 문서에서는, 생체 외에서 lncRNAs overexpress을 작성 하 고 시각화 된 프로토콜 제공 됩니다. 대표적인 실험으로는 lncRNA 선 동적인 장 질병, 인터페론 감마 Antisense 1 (IFNG-AS1)와 관련 된 Jurkat T 세포 모델에 overexpressed에 표시 됩니다. 이 위해 활성화 클러스터 정기적으로 interspaced 짧은 구조 반복 (CRISPR) 기술은 overexpression 생 게놈 loci에서 사용할 수 있도록 사용 됩니다. 활성화 CRISPR 기술 대상 transcriptional 시작 사이트 여러 lncRNA 결합 형태의 강력한 overexpression를 활성화 한 유전자의 녹음 방송 요인의 집합. 이 절차 3 단계, 즉 (i) 가이드 RNA (gRNA) 디자인 및 벡터 건설, (ii) 바이러스 생성 및 변환, 및 (iii) 식민지 심사 overexpression에 대 한으로 세분화 될 것 이다. 이 대표적인 실험에 대 한 20-fold 향상 IFNG-AS1 Jurkat T 세포에서에서 관찰 되었다 보다는.

Overexpress lncRNA IFNG-AS1 듀얼 벡터 시스템 이 원고에 예제 실험 lncRNA IFNG AS19표현 Jurkat T 세포 모델 시스템의 overexpression입니다. IFNG-AS1 인터페론 감마10규제를 본 선 동적인 장 질병과 관련 된 하는 lncRNA입니다. IFNG-AS1 유전자는 모두 동일한 transcriptional 시작 사이트 (그림 1A)를 사용 하는 3 개의 결합 이체?...

Watch this Scientific Journal Video about Overexpressing Long Noncoding RNAs Using Gene-activating CRISPR at JoVE.com

Overexpressing Long Noncoding RNAs Using Gene-activating CRISPR

전통적인 cDNA 기반 overexpression 기법 때문에 잠재적인 기능을 가진 그들의 여러 결합 형태 긴 noncoding RNAs의 overexpression에 대 한 제한 적용을 했습니다. 이 리뷰 긴 noncoding RNA의 여러 스플라이스 변종 overexpress CRISPR 기술을 사용 하 여 프로토콜을 보고 합니다.

Overexpressing 긴 Noncoding RNAs 유전자 활성화 CRISPR를 사용 하 여

Long noncoding RNA (lncRNA) biology is a new and exciting field of research, with the number of publications from this field growing exponentially since ...

비코딩 RNA에는 여러 동위 형태가 있는 경우가 많습니다. 시험관 내 과발현 연구에서는 이러한 표현된 모든 등소 형태를 연구하기가 종종 어렵습니다. 이 기술은 사용자가 게놈으로부터 직접 발현을 도출하고 세포가 특정 비코딩 RNA에 대한 내인성 동소형을 발현할 수 있게 한다.이 강력한 기술은 사용자가 충실도와 정확도로 게놈내의 모든 유전자의 발현을 구체적으로 지시할 수 있게 합니다. 특정 유전자에 대한 가이드 RNA를 설계함으로써 내인성 유전자 접합 기계를 사용하여 주어진 세포에서 천연 동소형을 발현할 수 있습니다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 박사 후 로버트 랭킨이 될 것입니다.전사 시작 부위의 100개의 기본 쌍 내에 위치한 가이드 RNA 서열을 설계하려면 BLAT와 같은 유전자 데이터베이스를 사용하여 가이드 RNA가 관심 유전자에 고유한지 확인합니다. 가이드 RNA와 비활성화된 Cas9 플라스미드를 섭씨 4도에 저장합니다. 암피실린을 곁들인 루리아 국물 한마접시에 E.coli를 줄이며 하룻밤 사이에 37도에서 박테리아를 재배합니다.다음 날, 식민지를 선택하고 하룻밤 암피실린과 LB의 5 밀리리터에서 박테리아를 성장, 적극적으로 37도 섭씨 인큐베이터에서 튜브를 흔들어. 다음 날, 2 리터 플라스크에 암피실린과 LB의 200 밀리리터에 박테리아의 두 밀리리터를 추가, 적극적으로 37도 섭씨 인큐베이터에서 하룻밤 플라스크를 흔들어. 박테리아를 3, 724시간 g에서 20분 동안 스핀다운하고 DNA 정화로 진행합니다.dCas9 함유 렌즈바이러스를 만들기 위해, 첫 번째 코트 100 밀리리터 조직 배양 접시 와 5 밀리리터 0.01% 폴리-L-리신 및 플레이트 당 5 백만 HEK293T 세포 10 밀리리터의 완전한 덜벡코의 수정 된 독수리 매체, 그런 다음 LTR 함유 가이드 RNA 벡터 의 10 마이크로그램 또는 LTR 함유 비활성화된 Cas9 벡터를 바이러스 성분을 함유한 플라스미드와 혼합하여 DNA 전환 샘플을 준비한다. 총 450마이크로리터에 물을 추가하고 주사기에 부착된 0.2미크론 필터 팁을 통해 혼합물을 필터링합니다. 다음으로, DNA의 각 트랜스펙트 샘플에 2.5-어금니 칼슘 이산화제 50마이크로리터를 추가하고 부드럽게 섞는다.주사기에 부착된 0.2미크론 필터 팁을 통해 칼슘-DNA 혼합물을 걸이합니다. 파이펫 500 마이크로리터 2X HBS를 5밀리리터 폴리스티렌 튜브에 넣습니다. 칼슘-DNA 혼합물 500마이크로리터를 드롭와이즈와 부드럽게 소용돌이에 넣습니다.실온에서 3분간 배양하세요. 각 HEK293T 함유 조직 배양 접시에 DNA 칼슘 HBS 현탁액 1밀리리터를 넣고 하룻밤 사이에 섭씨 37도에서 5%의 이산화탄소 인큐베이터에 배양합니다. 셋째 날에는 천천히 제거하고 접시에서 미디어를 폐기하십시오.조심스럽게 한 번 PBS로 세포를 씻어. 20 밀리머 HEPES와 10 밀리머 나트륨 부티레이트로 보충 된 완전한 DMEM의 6 밀리리터를 추가하십시오. 그런 다음 5~6시간 동안 섭씨 37도에서 5%의 이산화탄소 인큐베이터로 세포를 배양합니다.인큐베이션 후, PBS로 세포를 한 번 세척하고 HEK293T 세포에 20 밀리머 헤페스와 함께 완전한 DMEM의 5 밀리리터를 추가합니다. 12시간 동안 섭씨 37도에서 5%의 이산화탄소 인큐베이터에서 세포를 배양합니다. 4일째에는 HEK293T 세포 수퍼나티를 수집하고 바이러스를 함유하는 수퍼나티를 필터링한다.바이러스 성 입자 수를 시작하려면 먼저 증류수의 19 부분을 추가하여 P24 ELISA 키트에서 세척 농축물을 희석시하십시오. 그런 다음, 이 키트로부터 밀리리터당 200 나노그램으로 희석제로 희석제로 희석제로서 희석제로서 희석제로 희석제를 희석시키고 P24 ELISA 희석 표에 따라 1.5밀리리터 튜브의 표준 곡선에 대한 희석제를 만듭니다. 시료 내의 바이러스의 농도를 측정하기 위해 1:1000 희석부터 시작하여 96웰 플레이트의 지정된 우물에 샘플 희석을 추가하고 표준 곡선의 범위 내에 있기 위해 필요에 따라 부피를 수정한다.그런 다음 트리톤 X-100으로 샘플을 0.5%의 최종 농도로 희석하고 각 샘플의 200 마이크로리터와 RPMI 1640을 지정된 우물에 추가합니다. 접시를 밀봉하고 2 시간 동안 섭씨 37도에서 배양하십시오. 1X 세척 버퍼의 웰 당 300 마이크로 리터로 접시를 6 번 세척하십시오.접시를 반전하고 종이 타월에 눌러 여분의 액체를 제거합니다. 그런 다음 기판 공백을 제외한 모든 우물에 키트에서 검출기 항체 100 마이크로리터를 추가합니다. 접시를 밀봉하고 1 시간 동안 섭씨 37도에서 배양하십시오.접시를 씻은 다음 접시를 반전시키고 종이 타월에 두드려 여분의 액체를 제거하십시오. 검출기 항체를 측정하기 위하여는, SA-HRP 희석으로 1:100 희석에서 스트렙타비딘 고추냉이 과옥시다아제를 희석시 희석한다. 희석된 SA-HRP를 완전히 혼합하고 빈 을 제외한 모든 우물에 100 마이크로리터를 추가합니다.플레이트를 실온에서 30분 동안 밀봉하고 배양합니다. 다음으로, 1X 세척 버퍼로 접시를 씻고 여분의 액체를 두드리고. 1개의 직교-페닐렌디아민 정제를 1플레이트에 충분한 기질 용액을 만들기 위해 기질 희석제의 11밀리리터에 떨어뜨립니다.완전히 용해하고 빛으로부터 보호하기 위해 적극적으로 OPD 솔루션을 소용돌이. 빈 공간을 포함한 모든 웰에 OPD 기판 용액 100마이크로리터를 추가합니다. 분광계를 사용하여 450 나노미터에서 즉시 흡광도를 읽습니다.1초 간격으로 10회 반복하고 평균 측정을 수행합니다. 폴리브레네를 가진 감소된 혈청 매체의 5밀리리터에 있는 백만 세포의 밀도를 가진 T75 플라스크에 있는 Jurkat T 세포를 재중단하고 배양합니다. 그런 다음 백만 dCas9 함유 바이러스 입자를 포함하는 HEK293T 조건부 미디어를 추가합니다.이산화탄소5%로 섭씨 37도에서 세포를 배양합니다. 3 일 감염 후, 5 분 동안 233 시간 g에서 세포를 회전하고 puromycin으로 보충 된 완전한 DMEM의 10 밀리리터에서 다시 중단하십시오. T75 플라스크의 세포를 배양하고 이산화탄소 5%로 섭씨 37도에서 배양합니다.9 일 동안 매 셋째 날마다, 5 분 동안 233 배 g에서 세포를 회전하고 puromycin로 보충 된 완전한 DMEM으로 미디어를 대체합니다. 혈전계 또는 자동화된 세포 카운터를 사용하여 세포를 계산합니다. 이어서, 조직 배양 조직으로 96웰 플레이트에, 첫 번째 우물에서 푸오마이신으로 보충된 완전한 DMEM의 100 마이크로리터에 10, 000세포를 첨가한다.푸오마이신으로 보충된 완전한 DMEM으로 다음 우물의 내용물을 1:1 연속 희석합니다. 이산화탄소5%로 섭씨 37도에서 세포를 배양합니다. 클론 의 세 에 대한 6 웰 플레이트의 웰 당 2 백만 개의 세포를 판두 24 웰 플레이트로 복제 세포를 확장합니다.비 변형 된 Jurkat 세포와 다른 세 개의 우물을 컨트롤로 플레이트. 마지막으로, 세포를 T75 플라스크로 플레이트하고 세포를 세포 배양 인큐베이터에 하룻밤 동안 넣습니다. 유전자 발현을 측정하기 위해 먼저 RNA 1마이크로그램, cDNA 합성 완충제 4마이크로리터, 250마이크로리터 튜브에 역전사 1마이크로리터를 추가하여 보완 DNA를 합성한 다음, 20마이크로리터의 최종 부피에 물을 추가합니다.그런 다음, 42섭씨에서 30분 동안, 95도에서 5분간 열 순환기를 사용하여 역방향 전사를 비활성화합니다. 합성 후 60 마이크로리터의 물로 cDNA를 희석시보시다. 10 마이크로몰라의 최종 농도에서 각 전방 및 역 프라이머의 0.5 마이크로리터를 포함하는 튜브에 대한 폴리머라제 연쇄 반응을 실행, SYBR 녹색의 5 마이크로리터, 및 cDNA의 4 마이크로 리터.마지막으로 10 일 동안 Hygromycin B로 보충 DMEM에서 Jurkat-dCas9 세포를 선택합니다. 세포를 회전하고 3 일마다 미디어를 변경합니다. RNA를 정화하고 RT-qPCR로 진행합니다.본 연구에서는, 전사 시작 부위로부터 10~100개의 염기 쌍 내에 있던 gRNA 서열은 염증성 장 질환과 관련된 긴 비코딩 RNA인 IFNG-AS1의 전사 궤적에 Cas9 활성화 복합체를 지시하는 데 사용되었다. 이중 변환 된 세포의 선택을 가능하게 하기 위해, 2-plasmid 시스템은 세포로 dCas9 또는 gRNAse 증강을 변환하는 데 사용되었다. 여기서 MS2 단백질은 IFNG-AS1의 과발현을 향상시킵니다.Cas9 발현은 두 클론모두에 대해 확인되었다. HPRT1에 대한 프라이머는 비트랜스유도 된 세포에서 RNA의 존재를 확인하는 데 사용되었다. mRNA 발현은 cDNA 반응으로부터 역실체를 생략하여 확인되었다.IFNG-AS1의 3개의 스플라이스 변이체는 알려진 모든 IFNG-AS1 성적증명서에 대해 전사체별 프라이머 세트 또는 프라이머 세트로 검출될 수 있다. 모든 형광 곡선은 제어 와 IFNG-AS1 gRNA 표현 세포 사이의 반 주기 내에서 지수 단계에 도달 하는 하우스키핑 유전자 HPRT1기만하급수적 이었다. 알려진 모든 IFNG-AS1 성적증명서에 대한 프라이머는 IFNG-AS1 발현에서 20배 증가의 측정과 함께 실험 간에 가장 검출가능한 것으로 나타났다.그러나 IFNG-AS1의 세 번째 성적증명서는 IFNG-AS1 수준에서 5-10배 의 유의한 증가를 보였다. 원하는 유전자를 적극적으로 과장하기 위해 2.1 단계에서 가이드 RNA의 설계는 프로토콜의 성공에 매우 중요합니다. 또한 고품질 바이러스 입자를 생산하면 프로토콜 구성 요소를 강력하게 표현할 수 있습니다.일단 원하는 유전자가 과발현되면, 기능성 연구는 유전자 기계장치를 조사하기 위하여 수행될 수 있습니다. 우리의 예에서, 우리는 관심의 유전자의 과발현에 따라 사이토카인 생산을 보기로 결정했습니다. 이 기술은 처음에 2013년에 Griesbach Group에 의해 개발되었으며 다른 그룹에서 광범위하게 적용되고 정교해졌습니다.우리는 그들의 특정 기능을 탐구하기 위해 긴 비코딩 된 RNA에이 기술을 적용하는 것을 기쁘게 했다. 복제 결함이 있는 렌즈바이러스는 바이러스 성 작업에 대해 승인된 실험실에서 처리되어야 합니다. 추가적으로, 인간 적인 세포주 및 E.coli 박테리아는 생물적인 유해한 여겨집니다.마지막으로, 재조합 DNA 플라스미드는 훈련된 직원에 의해 처리되어야 합니다.

Research

JoVE Journal

Genetics

Sequence-specific and Selective Recognition of Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs by Chemically Modified Peptide Nucleic Acids

시퀀스 및 선택적 인식 하 여 단일 가닥 RNAs에 더블-좌초 RNAs의 화학적 펩 티 드 핵 산 수정

RNAs are emerging as important biomarkers and therapeutic targets. Thus, there is great potential in developing chemical probes and therapeutic ligands ...

연구

유전학

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-중재 대상된 통합에서 Vivo에서 Homology 중재 끝에 합류 기반 전략을 사용 하 여

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

Metabolic Labeling and Profiling of Transfer RNAs Using Macroarrays

신진 대사 라벨 및 Macroarrays를 사용 하 여 전송 RNAs의 프로 파일링

Transfer RNAs (tRNA) are abundant short non-coding RNA species that are typically 76 to 90 nucleotides in length. tRNAs are directly responsible for ...

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

빠른 고 손쉬운 파이프라인 C. 선 충 을 사용 하 여 CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins에서 게놈 포인트 돌연변이 생성에 대 한

The clustered regularly interspersed palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (Cas9) prokaryotic adaptive immune defense system has been ...

Dissection of Enhancer Function Using Multiplex CRISPR-based Enhancer Interference in Cell Lines

증강 기능 다중 CRISPR 기반 증강 간섭 셀 라인에서의 해 부

Multiple enhancers often regulate a given gene, yet for most genes, it remains unclear which enhancers are necessary for gene expression, and how these ...

CRISPR Guide RNA Cloning for Mammalian Systems

CRISPR 가이드 RNA 포유류 시스템 복제

The outlined protocol describes streamlined methods for the efficient and cost-effective generation of Cas9-associated guide RNAs. Two alternative ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

인간에서 태그 생 단백질 유도 만능 줄기 세포를 사용 하 여 CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas

포유류 세포 라인 CRISPR Cas를 사용 하 여 게놈 편집

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) system functions naturally in bacterial adaptive immunity, but has been ...

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

CRISPR/Cas9 시스템을 사용하여 트리파노소마 크루지의 아마스티고테 스테이지에 유전자 녹아웃 직접 도입

Trypanosoma cruzi is a pathogenic protozoan parasite that causes Chagas&#8217; disease mainly in Latin America. In order to identify a novel drug target ...