Name: overexpressing long noncoding rnas using gene-activating crispr
Uploaded: 2019-03-01T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Overexpressing Long Noncoding RNAs Using Gene-activating CRISPR at JoVE.com

C.P. støttes av RO1 DK60729 og P30 DK 41301-26. D.P. støttes av en Crohns og kolitt Foundation (CCFA) karriere development award, CURE: Digestive sykdommer Research Center (DDRC) DK41301, og UCLA kliniske og translasjonsforskning Science Institute (CTSI) UL1TR0001881. UCLA virologi kjernen ble finansiert av senter for AIDS Research (CFAR) gi 5P 30 AI028697. UCLA integrert molekylær teknologiene kjernen ble støttet av kur/P30 gi DK041301. Dette arbeidet ble også støttet av UCLA AIDS Institute.

Merk: Det er viktig å merke seg at denne protokollen bruker replikasjon dårlig lentiviruses. Utføre viral håndtering etter passende lab sikkerhetsopplæring. Bleach alle elementer og overflater som kommer i kontakt med levende virus i minst 10 min etter bruk. Bruk en engangs lab frakk og ansikt/øye beskyttelse, samt doble hansker, hele tiden. Utføre virus arbeid i biosikkerhet nivå 2 + labs med viral sertifisering. Vie vev kultur hetter og inkubatorer viral arbeid.
1. vek...

<ol>
	<li>Miao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trends+of+long+noncoding+RNA+research+from+2007+to+2016:+a+bibliometric+analysis.">Trends of long noncoding RNA research from 2007 to 2016: a bibliometric analysis.</a> Oncotarget. 8 (47), 83114-83127 (2017).</li><li>Derrien, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+GENCODE+v7+catalog+of+human+long+noncoding+RNAs:+analysis+of+their+gene+structure,+evolution,+and+expression.">The GENCODE v7 catalog of human long noncoding RNAs: analysis of their gene structure, evolution, and expression.</a> Genome Research. 22 (9), 1775-1789 (2012).</li><li>Johnsson, P., Lipovich, L., Grander, D., Morris, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+conservation+of+long+non-coding+RNAs;+sequence,+structure,+function.">Evolutionary conservation of long non-coding RNAs; sequence, structure, function.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1840 (3), 1063-1071 (2014).</li><li>Perez-Pinera, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-guided+gene+activation+by+CRISPR-Cas9-based+transcription+factors.">RNA-guided gene activation by CRISPR-Cas9-based transcription factors.</a> Nature Methods. 10 (10), 973-976 (2013).</li><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity.">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li><li>Maeder, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+RNA-guided+activation+of+endogenous+human+genes.">CRISPR RNA-guided activation of endogenous human genes.</a> Nature Methods. 10 (10), 977-979 (2013).</li><li>Konermann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+transcriptional+activation+by+an+engineered+CRISPR-Cas9+complex.">Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex.</a> Nature. 517 (7536), 583-588 (2015).</li><li>Schmittgen, T. D., Livak, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+real-time+PCR+data+by+the+comparative+C(T)+method.">Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method.</a> Nature Protocols. 3 (6), 1101-1108 (2008).</li><li>Gomez, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NeST+long+ncRNA+controls+microbial+susceptibility+and+epigenetic+activation+of+the+interferon-gamma+locus.">The NeST long ncRNA controls microbial susceptibility and epigenetic activation of the interferon-gamma locus.</a> Cell. 152 (4), 743-754 (2013).</li><li>Padua, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+long+noncoding+RNA+signature+for+ulcerative+colitis+identifies+IFNG-AS1+as+an+enhancer+of+inflammation.">A long noncoding RNA signature for ulcerative colitis identifies IFNG-AS1 as an enhancer of inflammation.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 311 (3), G446-G457 (2016).</li><li>Collier, S. P., Henderson, M. A., Tossberg, J. T., Aune, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+Th1+genomic+locus+from+Ifng+through+Tmevpg1+by+T-bet.">Regulation of the Th1 genomic locus from Ifng through Tmevpg1 by T-bet.</a> Journal of Immunology. 193 (8), 3959-3965 (2014).</li><li>Kotake, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+non-coding+RNA+ANRIL+is+required+for+the+PRC2+recruitment+to+and+silencing+of+p15(INK4B)+tumor+suppressor+gene.">Long non-coding RNA ANRIL is required for the PRC2 recruitment to and silencing of p15(INK4B) tumor suppressor gene.</a> Oncogene. 30 (16), 1956-1962 (2011).</li><li>Gilbert, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Scale+CRISPR-Mediated+Control+of+Gene+Repression+and+Activation.">Genome-Scale CRISPR-Mediated Control of Gene Repression and Activation.</a> Cell. 159 (3), 647-661 (2014).</li><li>Cheng, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+activation+of+endogenous+genes+by+CRISPR-on,+an+RNA-guided+transcriptional+activator+system.">Multiplexed activation of endogenous genes by CRISPR-on, an RNA-guided transcriptional activator system.</a> Cell Research. 23 (10), 1163-1171 (2013).</li><li>Matouskova, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reference+genes+for+real-time+PCR+quantification+of+messenger+RNAs+and+microRNAs+in+mouse+model+of+obesity.">Reference genes for real-time PCR quantification of messenger RNAs and microRNAs in mouse model of obesity.</a> PLoS One. 9 (1), e86033 (2014).</li></ol>

Dette manuskriptet presenterer en protokoll for bruk aktivere CRISPR for å overexpress lncRNAs i vitro. Dette er en spesielt viktig teknikk når studere lang noncoding RNAs som transcriptomic produktet er funksjonell enhet. Etter overuttrykte, kan forskeren deretter bruke disse cellene for å øke signal-til-støy forholdet når studere bindende partnere og selv måle mobilnettet konsekvensene av økte nivåer av lncRNAs. I tillegg som lncRNAs ofte handle på cis-gener, kan denne endogene overuttrykte teknikken disse he...

Mens mest biomedisinsk forskning har fokusert på protein-koding transkripsjoner, består fleste transkribert gener av noncoding RNAs (Ensembl release 93). Nåværende forskning begynner å utforske dette feltet med antallet publikasjoner om lncRNAs i sykdom prosesser øker eksponentielt mellom 2007 og 20171. Disse publikasjonene viser at mange lncRNAs er forbundet med sykdom. Molekylære mekanismer av disse lncRNAs er imidlertid vanskelig å studere på grunn av deres forskjellige funksjoner i forhold til mRNAs. Compounding problemet med forståelsen av lncRNAs i sykdom, uttrykkes lncRNAs ofte på lavere nivåer enn koding RNAs2. I tillegg er lncRNAs dårlig bevart, som begrenser den funksjonelle studier i menneske-celle-linje-baserte teknikker3. En metode å studere mekanismen av disse romanen genene er å endogenously overexpress dem i kulturperler celler. Overuttrykte studier kan gi informasjon om funksjonen av bestemte gener og aktiverer forskere å dissekere nøkkel molekylær veier.
En ny metode for å aktivere Transkripsjonen til lncRNA gener er basert på CRISPR teknologi opprinnelig utviklet av Gersbach laboratorium4. Denne protokollen er tilpasset for bruk i lncRNA biologi og uttrykk for disse genene i andre modellsystemer. I CRISPR overexpressing teknikk, kan et protein som kalles CRISPR-assosiert protein 9 (Cas9) rettes mot en DNA sekvens via en antisense gRNA som gjenkjennes av Cas9. Normalt vil Cas9 indusere DNA cleavage; men deaktivere mutasjoner i Cas9, utviklet for det overuttrykte teknikken, denne trinn5. Når en transcriptional aktivator er sammensmeltet med en "dead" Cas9 (dCas9) og transduced i linjer, den endogene overuttrykte lncRNAs kan være oppnådd4,6. Tillegg av ytterligere modifiseringer å gRNA, slik at flere transcriptional faktorer å binde til gRNA, økte effekten av dCas9 genet aktiveringssystemet 10 ganger7. Viktigere, ble det vist at transcriptional aktivering krever nærhet (< 200 bp) den transcriptional start området gener, slik at en bestemt oppregulering i genet-rike områder7. I motsetning til CRISPR knockout teknologier må dCas9 og gRNA kassetter integreres i genomet slik at cellene å beholde en overuttrykte over flere generasjoner. Én metode for å oppnå dette er å bruke lentiviruses for å integrere dCas9 - og gRNA-inneholder kassettene. Etter integrasjon, kan lncRNA genuttrykk bestemmes.
I denne artikkelen, vil en protokoll for lncRNA overuttrykte i en Jurkat T-celle modell bli demonstrert. En fremgangsmåte vises og kan også tilpasses tilhenger celler.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:837px;" width="837">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:245px;">Ampicillin</td>
			<td style="width:195px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:195px;">BP1760-5</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">CaCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:195px;">C1016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">cDNA synthesis kit (iScript)</td>
			<td style="width:195px;">BioRad</td>
			<td>1708891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">dCas9 forward primer</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:195px;">n/a</td>
			<td>5&#39;-TCGCCACAGCATAAAGAAGA&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">dCas9 reverse primer</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:195px;">n/a</td>
			<td>5&#39;-CTTTTCATGGTACGCCACCT</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">dCas9 vector</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:195px;">50918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM</td>
			<td>Corning</td>
			<td style="width:195px;">10013CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Ethanol</td>
			<td style="width:195px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:195px;">61509-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FBS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">gRNA plasmid</td>
			<td>VectorBuilder</td>
			<td style="width:195px;">VB180119-1195qxv</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEK293T cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td style="width:195px;">&#160;CRL-1573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:195px;">H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HPRT1 forward primer</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:195px;">n/a</td>
			<td>GACCAGTCAACAGGGGACAT&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HPRT1 reverse primer</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:195px;">n/a</td>
			<td>GCTTGCGACCTTGACCATCT</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hygromycin B</td>
			<td>Corning</td>
			<td style="width:195px;">MT3024CR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Isopropanol</td>
			<td style="width:195px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:195px;">BP2618-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Jurkat cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td style="width:195px;">&#160;TIB-152</td>
			<td style="width:203px;">clone E6-1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-glutamine</td>
			<td>Corning</td>
			<td style="width:195px;">25005Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LB agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1425-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LB broth</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1426-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Maxi-prep kit (Plasmid Purification Kit)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td style="width:195px;">12362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Na2HPO4</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:195px;">NIST2186II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Optimem I reduced serum media&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:195px;">31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">p24 elisa</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td style="width:195px;">NEK050B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">PBS</td>
			<td style="width:195px;">Corning</td>
			<td style="width:195px;">21-040-CMR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin and Streptomycin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pMDG2.G</td>
			<td>Addgene &#160;</td>
			<td style="width:195px;">#12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pMDLg/pRRE</td>
			<td>Addgene&#160;</td>
			<td style="width:195px;">#60488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Poly-L-Lysine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:195px;">P-4832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Polybrene</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td style="width:195px;">TR-1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pRSV-REV</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:195px;">#12253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Puromycin dihydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:195px;">P8833</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNA purification kit (Aurum RNA mini)</td>
			<td style="width:195px;">BioRad</td>
			<td>7326820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Butyrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:195px;">B5887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SYBR green (iTaq universal)</td>
			<td style="width:195px;">BioRad</td>
			<td>1725122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:195px;">X100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

overexpressing long noncoding rnas using gene-activating crispr

Lang noncoding RNA (lncRNA) biologi er et nytt og spennende forskning, med antall publikasjoner fra dette feltet vokser eksponentielt siden 2007. Disse studiene bekrefter at lncRNAs er endret i nesten alle sykdommer. Studere funksjonsroller for lncRNAs i forbindelse med sykdom imidlertid vanskelig på grunn av mangel på protein produkter, vev-spesifikke uttrykk, lav uttrykk nivåer, kompleksiteten i skjøte former, og mangel på bevaring blant arter. Gitt artsspesifikke uttrykket, er lncRNA studier ofte begrenset til menneskelig forskning sammenhenger når studere sykdom prosesser. Siden lncRNAs fungerer på molekylært nivå, er en måte for dissekere lncRNA biologi å fjerne lncRNA eller overexpress lncRNA og måle mobilnettet effektene. I denne artikkelen presenteres en skriftlig og visualisert protokoll til overexpress lncRNAs i vitro. Som en representant eksperiment vises en lncRNA forbundet med inflammatorisk tarmsykdom, Interferon Gamma Antisense 1 (IFNG-AS1), å være overexpressed i en Jurkat T-celle modell. Dette brukes aktivering gruppert regelmessig interspaced kort palindromic gjentar (CRISPR) teknikken til å aktivere overuttrykte på de endogene genomisk loci. Aktivere CRISPR teknikken mål en rekke transkripsjonsfaktorer til webområdet transcriptional starte med et muliggjør en robust overuttrykte flere lncRNA skjøte skjemaer. Denne fremgangsmåten vil deles inn i tre trinn, nemlig (i) guide RNA (gRNA) design og vektor konstruksjon, (ii) virus generasjon og signaltransduksjon og (iii) kolonien screening for overuttrykte. For dette representant eksperimentet, større enn 20-fold ekstrautstyr i IFNG-AS1 i Jurkat T celler ble observert.

Et dobbelt vektor-system for å overexpress lncRNA IFNG-AS1 Eksempel eksperimentet i dette manuskriptet er overuttrykte en Jurkat T-celle modell systemet uttrykker lncRNA IFNG-AS19. IFNG-AS1 er et lncRNA forbundet med inflammatorisk tarmsykdom, som har blitt sett å regulere Interferon-Gamma10. IFNG-AS1 genet inneholder tre skjøte-varianter som alle bruke de samme transcriptional startwebstedet (figu...

Watch this Scientific Journal Video about Overexpressing Long Noncoding RNAs Using Gene-activating CRISPR at JoVE.com

Overexpressing Long Noncoding RNAs Using Gene-activating CRISPR

Tradisjonelle cDNA-baserte overuttrykte teknikker har et begrenset bruksområde for overuttrykte lang noncoding RNAs på grunn av skjemaene for flere skjøte med mulig funksjonalitet. Denne anmeldelsen rapporterer en protokoll bruker CRISPR teknologi for å overexpress flere skjøte-varianter av en lang noncoding.

Overexpressing lang Noncoding RNAs med aktivering av Gene CRISPR

Long noncoding RNA (lncRNA) biology is a new and exciting field of research, with the number of publications from this field growing exponentially since ...

Ikke-koding RNAs har ofte flere isoformer. I in vitro overuttrykksstudier er det ofte vanskelig å studere alle disse uttrykte isoformene. Denne teknikken gjør det mulig for brukere å utlede uttrykk direkte fra genomet og gjøre det mulig for cellene å uttrykke endogene isoformene for en bestemt ikke-kodende RNA.Denne kraftige teknikken gjør det mulig for brukeren å spesifikt lede uttrykket av ethvert gen i genomet med troskap og nøyaktighet. Ved å designe guide RNA-er til bestemte gener, er man i stand til å bruke det endogene genspleisingsmaskineriet til å uttrykke de naturlige isoformene i en gitt celle. Å demonstrere prosedyren vil være Robert Rankin, en post-doc fra laboratoriet mitt.Hvis du vil utforme guiden RNA-sekvensen som ligger innenfor 100 basispar av transkripsjonsstartstedet, bruker du genetiske databaser som BLAT for å sikre at veiledningen RNA er unik for interessens gen. Oppbevar guiden RNA og de deaktiverte Cas9-plasmidene ved fire grader Celsius. Streak ut E.coli på en Luria kjøttkraft agar plate med ampicillin og vokse bakteriene over natten på 37 grader Celsius.Neste dag, plukke en koloni og vokse bakterier i fem milliliter lb med ampicillin over natten, kraftig risting røret i en 37-graders Celsius inkubator. Neste dag, legge til to milliliter bakterier til 200 milliliter LB med ampicillin i en to-liters kolbe, kraftig risting kolben over natten i en 37-graders Celsius inkubator. Spinn ned bakteriene på 3, 724 ganger g i 20 minutter og fortsett til DNA-rensing.For å lage dCas9-inneholdende lentivirus, første strøk 100-milliliter vev kultur retter med fem milliliter av 0,01% Poly-L-Lysine og plate fem millioner HEK293T celler per tallerken i 10 milliliter med komplett Dulbecco's Modified Eagles Medium, deretter forberede DNA transfection prøver ved å blande 10 mikrogram av en LTR-inneholdende guide RNA vektor eller en LTR-inneholdende deaktivert Cas9 vektor med plasmids som inneholder komponenter av virus. Tilsett vann til et totalt volum på 450 mikroliter og filtrer blandingen gjennom en 0,2-mikron filterspiss festet til en sprøyte. Deretter legger du til 50 mikroliter med 2,5-molar kalsiumdiklorid til hver transfeksjonsprøve av DNA og bland forsiktig.Filtrer kalsium-DNA-blandingen gjennom en 0,2-mikron filterspiss festet til en sprøyte. Pipette 500 mikroliter 2X HBS i et fem milliliter polystyrenrør. Tilsett 500 mikroliter av kalsium-DNA-blandingen dropwise og forsiktig virvel.Inkuber ved romtemperatur i tre minutter. Tilsett en milliliter DNA-kalsium HBS suspensjon til hver HEK293T-inneholdende vev kultur parabolen og inkubere dem i en 5% karbondioksid inkubator ved 37 grader Celsius over natten. På dag tre, sakte fjerne og kaste media fra oppvasken.Vask cellene forsiktig med PBS én gang. Tilsett seks milliliter komplett DMEM supplert med 20-millimolar HEPES og 10-millimolar natrium butyrat. Inkuber deretter cellene i en 5% karbondioksidinkubator ved 37 grader Celsius i fem til seks timer.Etter inkubasjonen vasker du cellene med PBS én gang og legger til fem milliliter komplett DMEM med 20 millimolar HEPES til HEK293T-cellene. Inkuber cellene i en 5% karbondioksidinkubator ved 37 grader Celsius i 12 timer. På dag fire samler du HEK293T-cellesupernativa og filtrerer supernatanten som inneholder viruset.For å starte viruspartikkeltellingene må vaskekonsentratet først fortynnes fra P24 ELISA-settet ved å tilsette 19 deler destillert, deionisert vann. Deretter fortynner du den positive kontrollen fra dette settet til 200 nanogram per milliliter ved hjelp av RPMI 1640 som fortynningsmiddel og fortynninger for en standardkurve i 1,5 milliliter rør i henhold til P24 ELISA fortynningstabellen. For å måle konsentrasjonen av viruset i prøvene, legg til prøvefortynningene til de utpekte brønnene på en 96-brønnsplate, fra 1:1000 fortynning og endre volumet etter behov for å være innenfor standardkurvens rekkevidde.Deretter fortynne prøvene med Triton X-100 til en endelig konsentrasjon på 0,5%og tilsett 200 mikroliter av hver prøve og RPMI 1640 til de angitte brønnene. Forsegle platen og inkuber den ved 37 grader Celsius i to timer. Vask platen med 300 mikroliter per brønn av 1X vaskebuffer seks ganger.Fjern overflødig væske ved å snu platen og banke den på et papirhåndkle. Tilsett deretter 100 mikroliter detektorantistoff fra settet til alle brønner unntatt underlaget tomt. Forsegle platen og inkuber den ved 37 grader Celsius i en time.Vask platen og fjern deretter overflødig væske ved å snu platen og banke den på et papirhåndkle. For å måle detektorantistoffet, fortynne streptavidin pepperrot peroksidase på 1:100 fortynning med SA-HRP fortynningsmiddel. Bland den fortynnede SA-HRP grundig og tilsett 100 mikroliter til alle brønner unntatt det tomme.Forsegle og inkuber platen ved romtemperatur i 30 minutter. Vask deretter platen med 1X-vaskebufferen og bank bort overflødig væske. Slipp en ortho-fenylenediamine tablett i 11 milliliter av substrat fortynningsmiddel for å lage nok substrat løsning for en plate.Vortex OPD-løsningen kraftig for å oppløse den helt og beskytte den mot lys. Tilsett 100 mikroliter OPD-substratløsning til alle brønner, inkludert det tomme. Ved hjelp av et spektrofotometer, les absorbans ved 450 nanometer umiddelbart.Gjenta 10 ganger med ett sekunds intervaller og ta den gjennomsnittlige målingen. Resuspend og kultur Jurkat T-celler i en T75 kolbe med en tetthet på en million celler i fem milliliter av redusert serum media med polybryne. Tilsett deretter HEK293T-bevisste medier som inneholder en million dCas9-inneholdende viruspartikler.Inkuber cellene ved 37 grader Celsius med 5%karbondioksid. Tre dager etter infeksjon, spinne ned cellene ved 233 gang g i fem minutter og gjenbruke dem i 10 milliliter av komplett DMEM supplert med puromycin. Kultur cellene i T75 flasker og inkuber dem på 37 grader Celsius med 5% karbondioksid.Hver tredje dag i en periode på ni dager, spinne ned cellene på 233 ganger g i fem minutter og erstatte media med hele DMEM supplert med puromycin. Telle cellene ved hjelp av et hemocytometer eller en automatisert celleteller. Deretter, på en 96-brønns plate med vevskulturbehandlet vev, tilsett 10.000 celler i 100 mikroliter av hele DMEM supplert med puromycin i den første brønnen.Lag 1:1 seriell fortynning av innholdet i følgende brønner med hele DMEM supplert med puromycin. Inkuber cellene ved 37 grader Celsius med 5%karbondioksid. Utvid kloniske celler til to 24-brønnsplater, og legg deretter to millioner celler per brønn av en seksbrønnsplate for tre av klonene.Plate de tre andre brønnene med ikke-transdusert Jurkat celler som kontroller. Til slutt, plate cellene i en T75 kolbe og sette cellene i en celle kultur inkubator over natten. For å begynne kvantitativ PCR for å måle genuttrykk, syntetiseres først komplementært DNA ved å legge til ett mikrogram RNA, fire mikroliter cDNA-syntesebuffer og en mikroliter omvendt transkripsjon til 250 mikroliters rør, og tilsett deretter vann til et endelig volum på 20 mikroliter.Deretter bruker du en termisk cycler ved 42 grader Celsius i 30 minutter og ved 95 grader Celsius i fem minutter for å inaktivere omvendt transkripsjon. Fortynn cDNA med 60 mikroliter vann etter syntesen. Kjør polymerasekjedereaksjoner for rør som inneholder 0,5 mikroliter av hver forover og omvendt primer ved endelig konsentrasjon på 10 mikromos, fem mikroliter SYBR grønn og fire mikroliter cDNA.Til slutt velger Du Jurkat-dCas9 celler i DMEM supplert med Hygromycin B i 10 dager. Spinn ned cellene og endre media hver tredje dag. Rens RNAse og fortsett til RT-qPCR.I denne studien ble gRNA-sekvenser som var innenfor 10 til 100 basispar unna transkripsjonsstartstedet brukt til å lede Cas9-aktiverende kompleks til transkripsjonslocus av IFNG-AS1, en lang ikke-koding RNA forbundet med inflammatorisk tarmsykdom. For å muliggjøre valg av doble transduserte celler, ble et to-plasmid-system brukt til å transdusere enten dCas9 eller gRNAse enhancers til celler. Her forbedrer MS2-proteiner overuttrykket av IFNG-AS1.Cas9-uttrykket ble bekreftet for begge klonene. Primere mot HPRT1 ble brukt til å bekrefte tilstedeværelsen av RNA i de ikke-transduserte cellene. mRNA-uttrykket ble bekreftet ved å utelate omvendt transkripsjon fra cDNA-reaksjonen.Tre skjøtevarianter av IFNG-AS1 kunne oppdages med enten transkripsjonsspesifikke primersett eller et primersett mot alle kjente IFNG-AS1-transkripsjoner. Alle fluorescenskurver var eksponentielle med rengjøringsgenet HPRT1 som nådde eksponentiell fase innen en halv syklus mellom kontroll og IFNG-AS1 gRNA-uttrykkende celler. Primere mot alle kjente IFNG-AS1-transkripsjoner var de mest påviselige mellom eksperimenter, med målinger av 20 ganger økninger i IFNG-AS1-uttrykk.Den tredje transkripsjonen av IFNG-AS1 viste imidlertid en fem til ti ganger betydelig økning i IFNG-AS1-nivå. For å aktivt overuttrykke ønsket gen, er utformingen av guiden RNA i trinn 2.1 avgjørende for at protokollen skal lykkes. I tillegg vil produksjon av kvalitets viruspartikler sikre et robust uttrykk for protokollkomponentene dine.Når det ønskede genet er overuttrykt, kan funksjonelle studier utføres for å undersøke genmekanismene. I vårt eksempel valgte vi å se på cytokinproduksjon etter overuttrykk av vårt gen av interesse. Denne teknikken ble opprinnelig utviklet av Griesbach Group I 2013 og har blitt bredt brukt og utarbeidet av andre grupper.Vi var glade for å bruke denne teknikken på lange ikke-kodede RNA-er for å utforske deres spesifikke funksjoner. Replikeringsdefektive lentivirus bør håndteres i et laboratorium som er godkjent for virusarbeid. I tillegg anses menneskelige cellelinjer og E.coli-bakterier som biofarlige.Til slutt bør rekombinante DNA-plasmider håndteres av opplært personale.

Research

JoVE Journal

Genetics

Sequence-specific and Selective Recognition of Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs by Chemically Modified Peptide Nucleic Acids

Sekvens-spesifikke og selektiv anerkjennelse av Double-strandet RNAs over Single-strandet RNAs av kjemisk endret peptid nukleinsyrer

RNAs are emerging as important biomarkers and therapeutic targets. Thus, there is great potential in developing chemical probes and therapeutic ligands ...

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-mediert målrettet integrering i Vivo med en homologi-mediert slutten begynte-basert strategi

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

Metabolic Labeling and Profiling of Transfer RNAs Using Macroarrays

Metabolsk merking og profilering av overføring RNAs bruker Macroarrays

Transfer RNAs (tRNA) are abundant short non-coding RNA species that are typically 76 to 90 nucleotides in length. tRNAs are directly responsible for ...

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

En rask og lettvint rørledning for generering Genomic punkt mutanter i C. elegans bruker CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

The clustered regularly interspersed palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (Cas9) prokaryotic adaptive immune defense system has been ...

Dissection of Enhancer Function Using Multiplex CRISPR-based Enhancer Interference in Cell Lines

Disseksjon Enhancer funksjon med Multiplex CRISPR-baserte Enhancer forstyrrelser i linjer

Multiple enhancers often regulate a given gene, yet for most genes, it remains unclear which enhancers are necessary for gene expression, and how these ...

CRISPR Guide RNA Cloning for Mammalian Systems

CRISPR Guide RNA kloning for pattedyr systemer

The outlined protocol describes streamlined methods for the efficient and cost-effective generation of Cas9-associated guide RNAs. Two alternative ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

Endogene Protein merking i menneskelig indusert Pluripotent stilk celler med CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas

Genomet redigering i pattedyr linjer med CRISPR-Cas

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) system functions naturally in bacterial adaptive immunity, but has been ...

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

Vi presenterer en Gene knockout direkte inn i Amastigote Stage av Trypanosoma cruzi bruker CRISPR/Cas9 system

Trypanosoma cruzi is a pathogenic protozoan parasite that causes Chagas&#8217; disease mainly in Latin America. In order to identify a novel drug target ...