Name: overexpressing long noncoding rnas using gene-activating crispr
Uploaded: 2019-03-01T15:00:00
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C.P. é apoiado por RO1 DK60729 e P30 DK 41301-26. D.P. é suportado por um de Crohn e colite Foundation (CCFA) carreira desenvolvimento award, cura: centro de investigação de doenças digestivas (DDRC) DK41301 e UCLA clínica e Instituto de ciência translacional (CTSI) UL1TR0001881. O núcleo de virologia da UCLA foi financiado pelo centro de pesquisa AIDS (CFAR) conceder 5P 30 AI028697. As tecnologias de Molecular integrada da UCLA núcleo foi apoiado pela cura/P30 conceder DK041301. Este trabalho também foi apoiado pelo Instituto de AIDS da UCLA.

Nota: É importante notar que este protocolo usa replicação deficiente lentivírus. Execute manipulação viral somente após o treinamento de segurança do laboratório apropriado. Bleach todos os itens e as superfícies que entram em contacto com o vírus vivo por um período mínimo de 10 min após o manuseio. Uso uma proteção descartável laboratório de casaco e rosto/olhos, bem como luvas duplas, em todos os momentos. Realizar o trabalho de vírus em Biossegurança nível 2 + laboratórios com ...

<ol>
	<li>Miao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trends+of+long+noncoding+RNA+research+from+2007+to+2016:+a+bibliometric+analysis.">Trends of long noncoding RNA research from 2007 to 2016: a bibliometric analysis.</a> Oncotarget. 8 (47), 83114-83127 (2017).</li><li>Derrien, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+GENCODE+v7+catalog+of+human+long+noncoding+RNAs:+analysis+of+their+gene+structure,+evolution,+and+expression.">The GENCODE v7 catalog of human long noncoding RNAs: analysis of their gene structure, evolution, and expression.</a> Genome Research. 22 (9), 1775-1789 (2012).</li><li>Johnsson, P., Lipovich, L., Grander, D., Morris, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+conservation+of+long+non-coding+RNAs;+sequence,+structure,+function.">Evolutionary conservation of long non-coding RNAs; sequence, structure, function.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1840 (3), 1063-1071 (2014).</li><li>Perez-Pinera, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-guided+gene+activation+by+CRISPR-Cas9-based+transcription+factors.">RNA-guided gene activation by CRISPR-Cas9-based transcription factors.</a> Nature Methods. 10 (10), 973-976 (2013).</li><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity.">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li><li>Maeder, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+RNA-guided+activation+of+endogenous+human+genes.">CRISPR RNA-guided activation of endogenous human genes.</a> Nature Methods. 10 (10), 977-979 (2013).</li><li>Konermann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+transcriptional+activation+by+an+engineered+CRISPR-Cas9+complex.">Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex.</a> Nature. 517 (7536), 583-588 (2015).</li><li>Schmittgen, T. D., Livak, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+real-time+PCR+data+by+the+comparative+C(T)+method.">Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method.</a> Nature Protocols. 3 (6), 1101-1108 (2008).</li><li>Gomez, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NeST+long+ncRNA+controls+microbial+susceptibility+and+epigenetic+activation+of+the+interferon-gamma+locus.">The NeST long ncRNA controls microbial susceptibility and epigenetic activation of the interferon-gamma locus.</a> Cell. 152 (4), 743-754 (2013).</li><li>Padua, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+long+noncoding+RNA+signature+for+ulcerative+colitis+identifies+IFNG-AS1+as+an+enhancer+of+inflammation.">A long noncoding RNA signature for ulcerative colitis identifies IFNG-AS1 as an enhancer of inflammation.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 311 (3), G446-G457 (2016).</li><li>Collier, S. P., Henderson, M. A., Tossberg, J. T., Aune, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+Th1+genomic+locus+from+Ifng+through+Tmevpg1+by+T-bet.">Regulation of the Th1 genomic locus from Ifng through Tmevpg1 by T-bet.</a> Journal of Immunology. 193 (8), 3959-3965 (2014).</li><li>Kotake, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+non-coding+RNA+ANRIL+is+required+for+the+PRC2+recruitment+to+and+silencing+of+p15(INK4B)+tumor+suppressor+gene.">Long non-coding RNA ANRIL is required for the PRC2 recruitment to and silencing of p15(INK4B) tumor suppressor gene.</a> Oncogene. 30 (16), 1956-1962 (2011).</li><li>Gilbert, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Scale+CRISPR-Mediated+Control+of+Gene+Repression+and+Activation.">Genome-Scale CRISPR-Mediated Control of Gene Repression and Activation.</a> Cell. 159 (3), 647-661 (2014).</li><li>Cheng, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+activation+of+endogenous+genes+by+CRISPR-on,+an+RNA-guided+transcriptional+activator+system.">Multiplexed activation of endogenous genes by CRISPR-on, an RNA-guided transcriptional activator system.</a> Cell Research. 23 (10), 1163-1171 (2013).</li><li>Matouskova, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reference+genes+for+real-time+PCR+quantification+of+messenger+RNAs+and+microRNAs+in+mouse+model+of+obesity.">Reference genes for real-time PCR quantification of messenger RNAs and microRNAs in mouse model of obesity.</a> PLoS One. 9 (1), e86033 (2014).</li></ol>

Este manuscrito apresenta um protocolo para usar ativação CRISPR para overexpress lncRNAs in vitro. Esta é uma técnica especialmente importante quando estudar há muito tempo não codificante RNAs como o produto do transcriptomic é a unidade funcional. Depois superexpressão, o pesquisador pode, então, usar essas células para aumentar a relação sinal-ruído quando estudar parceiros de ligação e nem medir as consequências celulares de aumento dos níveis de lncRNAs. Além disso, como lncRNAs frequentemente age...

Enquanto investigação biomédica mais concentrou-se transcritos codificantes de proteínas, a maioria dos genes transcritos na verdade consiste de RNA não-codificante (liberação de Ensembl 93). A pesquisa atual está começando a explorar este campo, com o número de publicações sobre lncRNAs em processos de doença crescente exponencialmente entre 2007 e 20171. Estas publicações demonstram que muitos lncRNAs estão associados com doença. No entanto, os mecanismos moleculares de lncRNAs estes são difíceis de estudar devido a suas diversas funções em comparação com os mRNAs. Compondo o problema de compreender o papel da lncRNAs na doença, lncRNAs exprimem-se frequentemente a codificação RNAs2níveis inferiores. Além disso, lncRNAs são mal conservadas, que limita os estudos funcionais na célula linha-humanas técnicas3. Um método para estudar o mecanismo destes genes romance é endogenamente overexpress-los em pilhas cultivadas. Estudos de superexpressão podem fornecer informações chaves sobre a função dos genes específicos e permitir aos investigadores principais vias moleculares de dissecar.
Um novo método para ativar a transcrição de genes lncRNA é baseado em tecnologias CRISPR desenvolvidas inicialmente pela Gersbach laboratório4. Este protocolo foi adaptado para uso em lncRNA biologia e para a expressão destes genes em outros sistemas de modelo. No CRISPR superexpressão técnica, uma proteína chamada proteína associada CRISPR 9 (Cas9) pode ser direcionada para uma sequência de DNA através de uma gRNA antisentido é reconhecido por Cas9. Normalmente, Cas9 induzirá a clivagem de DNA; no entanto, mutações em Cas9, anteriormente desenvolvido para a técnica de superexpressão, desativar esta etapa5. Quando um ativador transcricional é fundido a uma Cas9 "morto" (dCas9) e transformados em linhas de células, a superexpressão endógena de lncRNAs pode ser alcançado4,6. A adição de modificações adicionais para a gRNA, permitindo que fatores transcricionais adicionais ligar a gRNA, aumentou a eficácia do sistema de ativação do gene dCas9 10 vezes7. Importante, foi demonstrado que a ativação transcricional requer proximidade (< 200 bp) para o transcriptional começar genes local, permitindo uma upregulation específica em áreas ricas gene7. Ao contrário de tecnologias de nocaute CRISPR, dCas9 e gRNA cassettes precisam ser integrado no genoma para permitir células reter uma superexpressão ao longo de várias gerações. Um método para alcançar este objectivo é usar lentivírus para integrar as fitas dCas9 e gRNA-contendo. Após a integração, a expressão do gene de lncRNA pode ser determinada.
Neste artigo, será demonstrado um protocolo para superexpressão de lncRNA em um modelo de células Jurkat T. Um procedimento passo a passo é mostrado e também pode ser adaptado para células aderentes.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:837px;" width="837">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:245px;">Ampicillin</td>
			<td style="width:195px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:195px;">BP1760-5</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">CaCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:195px;">C1016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">cDNA synthesis kit (iScript)</td>
			<td style="width:195px;">BioRad</td>
			<td>1708891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">dCas9 forward primer</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:195px;">n/a</td>
			<td>5&#39;-TCGCCACAGCATAAAGAAGA&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">dCas9 reverse primer</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:195px;">n/a</td>
			<td>5&#39;-CTTTTCATGGTACGCCACCT</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">dCas9 vector</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:195px;">50918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM</td>
			<td>Corning</td>
			<td style="width:195px;">10013CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Ethanol</td>
			<td style="width:195px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:195px;">61509-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FBS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">gRNA plasmid</td>
			<td>VectorBuilder</td>
			<td style="width:195px;">VB180119-1195qxv</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEK293T cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td style="width:195px;">&#160;CRL-1573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:195px;">H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HPRT1 forward primer</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:195px;">n/a</td>
			<td>GACCAGTCAACAGGGGACAT&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HPRT1 reverse primer</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:195px;">n/a</td>
			<td>GCTTGCGACCTTGACCATCT</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hygromycin B</td>
			<td>Corning</td>
			<td style="width:195px;">MT3024CR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Isopropanol</td>
			<td style="width:195px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:195px;">BP2618-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Jurkat cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td style="width:195px;">&#160;TIB-152</td>
			<td style="width:203px;">clone E6-1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-glutamine</td>
			<td>Corning</td>
			<td style="width:195px;">25005Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LB agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1425-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LB broth</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1426-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Maxi-prep kit (Plasmid Purification Kit)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td style="width:195px;">12362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Na2HPO4</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:195px;">NIST2186II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Optimem I reduced serum media&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:195px;">31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">p24 elisa</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td style="width:195px;">NEK050B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">PBS</td>
			<td style="width:195px;">Corning</td>
			<td style="width:195px;">21-040-CMR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin and Streptomycin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pMDG2.G</td>
			<td>Addgene &#160;</td>
			<td style="width:195px;">#12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pMDLg/pRRE</td>
			<td>Addgene&#160;</td>
			<td style="width:195px;">#60488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Poly-L-Lysine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:195px;">P-4832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Polybrene</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td style="width:195px;">TR-1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pRSV-REV</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:195px;">#12253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Puromycin dihydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:195px;">P8833</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNA purification kit (Aurum RNA mini)</td>
			<td style="width:195px;">BioRad</td>
			<td>7326820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Butyrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:195px;">B5887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SYBR green (iTaq universal)</td>
			<td style="width:195px;">BioRad</td>
			<td>1725122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:195px;">X100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

overexpressing long noncoding rnas using gene-activating crispr

Há muito tempo não codificante biologia do RNA (lncRNA) é um novo e excitante campo de pesquisa, com o número de publicações deste campo crescendo exponencialmente desde 2007. Estes estudos têm confirmado que os lncRNAs sejam alteradas em quase todas as doenças. No entanto, estudar as funções funcionais para lncRNAs no contexto da doença continua a ser difícil devido à falta de produtos proteicos, expressão tecido-específica, níveis baixos de expressão, complexidades em formulários da tala e falta de conservação entre espécies. Dada a expressão espécie-específicas, estudos lncRNA são restritos aos contextos de investigação humana quando estudando processos de doença. Desde que lncRNAs funcionar a nível molecular, uma maneira de dissecar lncRNA biologia é para remover o lncRNA ou overexpress os efeitos celulares lncRNA e medida. Neste artigo, é apresentado um protocolo escrito e visualizado a overexpress lncRNAs in vitro. Como um experimento de representante, um lncRNA associado com doença inflamatória intestinal, Interferon gama antisentido 1 (IFNG-AS1), é mostrado para ser overexpressed em um modelo de células Jurkat T. Para fazer isso, a técnica de regularmente intercaladas curta palíndromo repetições (CRISPR) em cluster de activação é usada para habilitar a superexpressão no locus genômicos endógenas. A técnica CRISPR activação destina-se um conjunto de factores de transcrição para o site iniciar transcricional de um gene, permitindo um robusto superexpressão de múltiplas formas de tala de lncRNA. Este procedimento irá ser dividido em três etapas, ou seja (i) guia construção design e vetor de RNA (gRNA), (ii) o vírus a geração e transdução e triagem (iii) a colônia para superexpressão. Para esta experiência representativa, um maior do que 20-fold realce em IFNG-AS1 em células Jurkat T foi observada.

Um sistema dual de vetor para overexpress o lncRNA IFNG-AS1 O experimento de exemplo neste manuscrito é a superexpressão de um sistema de células Jurkat T modelo expressando a lncRNA IFNG-AS19. IFNG-AS1 é um lncRNA associado com doença inflamatória intestinal, que tem sido vista regular de interferão gama10. O gene IFNG-AS1 contém três variantes da tala, que todos usam o mesmo site iniciar transcriptional (<stron...

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Overexpressing Long Noncoding RNAs Using Gene-activating CRISPR

Técnicas tradicionais baseados em cDNA superexpressão têm uma aplicabilidade limitada para a superexpressão de tempo não-codificante RNAs devido às suas múltiplas formas de tala com funcionalidade potencial. Esta revisão relata um protocolo utilizando tecnologia CRISPR para overexpress múltiplas variantes da tala de um RNA não-codificante longo.

Superexpressão de tempo não-codificante RNAs usando CRISPR ativando o Gene

Long noncoding RNA (lncRNA) biology is a new and exciting field of research, with the number of publications from this field growing exponentially since ...

RNAs não codificadoras geralmente têm isoforms múltiplos. Em estudos in vitro de superexpressão, muitas vezes é difícil estudar todas essas isoformas expressas. Esta técnica permite que os usuários obtenham expressão diretamente do genoma e permitam que as células expressem as isoformas endógenas para um RNA não codificador específico.Esta técnica poderosa permite que o usuário direcione especificamente a expressão de qualquer gene no genoma com fidelidade e precisão. Ao projetar o guia RNAs para genes específicos, é capaz de usar as máquinas endógenas de splicing de genes para expressar as isóformas naturais em uma determinada célula. Demonstrando o procedimento será Robert Rankin, um pós-doutor do meu laboratório.Para projetar a sequência de RNA guia que está localizada dentro de 100 pares base do local de início transcricional, use bancos de dados genéticos como o BLAT para garantir que o RNA guia seja exclusivo do gene de interesse. Armazene o guia RNA e os plasmídeos Cas9 desativados a quatro graus Celsius. Passe e.coli em uma placa de ágar de caldo de Luria com ampicillina e cresça a bactéria durante a noite a 37 graus Celsius.No dia seguinte, escolha uma colônia e plante as bactérias em cinco mililitros de LB com ampicilina durante a noite, sacudindo vigorosamente o tubo em uma incubadora Celsius de 37 graus. No dia seguinte, adicione dois mililitros de bactérias a 200 mililitros de LB com ampicillina em um frasco de dois litros, sacudindo vigorosamente o frasco durante a noite em uma incubadora Celsius de 37 graus. Gire a bactéria a 3.724 vezes g por 20 minutos e prossiga para a purificação do DNA.Para criar o lentivírus contendo dCas9, primeiro cubra pratos de cultura de tecido de 100 mililitros com cinco mililitros de 0,01% Poly-L-Lysine e placa de cinco milhões de células HEK293T por prato em 10 mililitros de completo Dulbecco's Modified Eagles Medium, em seguida, prepare amostras de transfecção de DNA misturando 10 microgramas de um vetor de RNA guia contendo LTR ou um vetor Cas9 desativado contendo LTR com plasmídeos contendo componentes de vírus. Adicione água a um volume total de 450 microliters e filtre a mistura através de uma ponta de filtro de 0,2 mícrons presa a uma seringa. Em seguida, adicione 50 microlitadores de 2,5-molar de cálcio dichlorida a cada amostra de transfecção do DNA e misture suavemente.Filtre a mistura cálcio-DNA através de uma ponta de filtro de 0,2 mícrons presa a uma seringa. Pipeta 500 microliters de 2X HBS em um tubo de poliestireno de cinco mililitros. Adicione 500 microliters da mistura cálcio-DNA dropwise e suavemente vórtice.Incubar em temperatura ambiente por três minutos. Adicione um mililitro da suspensão HBS dna-cálcio a cada prato de cultura de tecido contendo HEK293T e incuba-os em uma incubadora de dióxido de carbono de 5% a 37 graus Celsius durante a noite. No terceiro dia, retire lentamente e descarte a mídia dos pratos.Lave cuidadosamente as células com PBS uma vez. Adicione seis mililitros de DMEM completo suplementado com HEPES de 20 mililitros e butara de sódio de 10 mililitros. Em seguida, incubar as células em uma incubadora de dióxido de carbono de 5% a 37 graus Celsius por cinco a seis horas.Após a incubação, lave as células com PBS uma vez e adicione cinco mililitros de DMEM completos com HEPES de 20 milimões às células HEK293T. Incubar as células em uma incubadora de dióxido de carbono de 5% a 37 graus Celsius por 12 horas. No quarto dia, colete os supernacantes celulares HEK293T e filtre o supernante contendo o vírus.Para iniciar a contagem de partículas virais, primeiro diluir o concentrado de lavagem do kit P24 ELISA adicionando 19 partes de água destilada e desionizada. Em seguida, diluir o controle positivo deste kit para 200 nanogramas por mililitro usando RPMI 1640 como diluente e fazer diluições para uma curva padrão em tubos de 1,5 mililitro de acordo com a tabela de diluição P24 ELISA. Para medir a concentração do vírus dentro das amostras adicione as diluições amostrais aos poços designados de uma placa de 96 poços, a partir de 1:1000 diluição e modifique o volume conforme necessário, a fim de estar dentro do intervalo da curva padrão.Em seguida, diluir as amostras com Triton X-100 para uma concentração final de 0,5% e adicionar 200 microliters de cada amostra e RPMI 1640 aos poços designados. Sele a placa e incuba-a a 37 graus Celsius por duas horas. Lave a placa com 300 microliters por poço do tampão de lavagem 1X seis vezes.Remova qualquer excesso de fluido invertendo a placa e batendo-a em uma toalha de papel. Em seguida, adicione 100 microliters de anticorpo detector do kit a todos os poços, exceto o substrato em branco. Sele a placa e incuba-a a 37 graus Celsius por uma hora.Lave a placa e, em seguida, remova qualquer excesso de fluido invertendo a placa e batendo-a em uma toalha de papel. Para medir o anticorpo detector, dilui o peroxidase de rabanete streptavidin à 1:100 diluição com diluente SA-HRP. Misture bem o SA-HRP diluído e adicione 100 microliters a todos os poços, exceto o em branco.Lacre e incubar a placa em temperatura ambiente por 30 minutos. Em seguida, lave a placa com o tampão de lavagem 1X e bata fora qualquer excesso de líquido. Solte um comprimido de orto-fenilediamina em 11 mililitros do diluente do substrato para fazer solução de substrato suficiente para uma placa.Vórtice a solução OPD vigorosamente para dissolvê-lo completamente e protegê-lo da luz. Adicione 100 microliters de solução de substrato OPD a todos os poços, incluindo o em branco. Usando um espectrofotômetro, leia a absorvência em 450 nanômetros imediatamente.Repita 10 vezes em intervalos de um segundo e faça a medição média. Resuspend e cultura Jurkat T-cells em um frasco T75 com uma densidade de um milhão de células em cinco mililitros da mídia de soro reduzido com polibrene. Em seguida, adicione a mídia hek293T condicionada contendo um milhão de partículas virais contendo dCas9.Incubar as células a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Três dias após a infecção, gire as células a 233 vezes g por cinco minutos e resuspensá-las em 10 mililitros de DMEM completo suplementado com puramicina. Cultue as células em frascos T75 e incuba-as a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono.A cada três dias por um período de nove dias, gire as células a 233 vezes g por cinco minutos e substitua a mídia pelo DMEM completo complementado com puromicina. Conte as células usando um hemócito ou um contador automatizado de células. Em seguida, em uma placa de 96 poços com tecido tratado com cultura tecidual, adicione 10.000 células em 100 microliters do DMEM completo suplementado com puromicina no primeiro poço.Faça diluições seriais 1:1 do conteúdo dos seguintes poços com o DMEM completo complementado com puromicina. Incubar as células a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Expanda as células clonais em duas placas de 24 poços, em seguida, placa dois milhões de células por poço de uma placa de seis poços para três dos clones.Aplaque os outros três poços com células jurkat não transduzidas como controles. Finalmente, coloque as células em um frasco T75 e coloque as células em uma incubadora de cultura celular durante a noite. Para iniciar o PCR quantitativo para medir a expressão genética, primeiro síntese de DNA complementar adicionando um micrograma de RNA, quatro microliters de tampão de síntese de CDNA, e um microliter de transcriptase reversa a 250 tubos microliteres, em seguida, adicionar água a um volume final de 20 microlitres.Em seguida, use um cicloviário térmico a 42 graus Celsius por 30 minutos e a 95 graus Celsius por cinco minutos para inativar a transcriptase reversa. Diluir o cDNA com 60 microlitres de água após a síntese. Execute reações em cadeia de polimerase para tubos contendo 0,5 microliters de cada primer dianteiro e reverso na concentração final de 10 micromolar, cinco microliters de verde SYBR e quatro microliters de cDNA.Por fim, selecione células Jurkat-dCas9 em DMEM suplementadas com Hygromicina B por 10 dias. Gire as células e mude a mídia a cada três dias. Purifique RNAse e prossiga para RT-qPCR.Neste estudo, sequências de gRNA que estavam dentro de 10 a 100 pares base longe do local de início transcricional foram utilizadas para direcionar o complexo de ativação Cas9 para o lócus transcricional de IFNG-AS1, um RNA de longo não codificação associado à doença inflamatória intestinal. Para permitir a seleção de células transduzidas duplas, um sistema de dois plasmídeos foi usado para transduzir os intensificadores dCas9 ou gRNAse para as células. Aqui as proteínas MS2 aumentam a superexpressão do IFNG-AS1.A expressão cas9 foi confirmada para ambos os clones. Primers contra HPRT1 foram usados para confirmar a presença de RNA nas células não transduzidas. a expressão mRNA foi confirmada omitindo a transcriptase reversa da reação cDNA.Três variantes de emendas de IFNG-AS1 podem ser detectadas com conjuntos de primer específicos de transcrição ou um primer definido contra todas as transcrições IFNG-AS1 conhecidas. Todas as curvas de fluorescência foram exponenciais com o gene de limpeza HPRT1 atingindo a fase exponencial dentro de meio ciclo entre o controle e as células expressas por gRNA IFNG-AS1. Os primers contra todas as transcrições ifng-AS1 conhecidas foram os mais detectáveis entre os experimentos, com medições de aumentos de 20 vezes na expressão IFNG-AS1.No entanto, a terceira transcrição do IFNG-AS1 mostrou um aumento significativo de cinco a dez vezes nos níveis ifng-AS1. Para expressar ativamente o gene desejado, o design do RNA guia na etapa 2.1 é fundamental para o sucesso do protocolo. Além disso, a produção de partículas virais de qualidade garantirá uma expressão robusta de seus componentes de protocolo.Uma vez que o gene desejado seja superexpresso, estudos funcionais podem ser realizados para investigar os mecanismos genéticos. Em nosso exemplo, optamos por olhar para a produção de citocinas após a superexpressão do nosso gene de interesse. Esta técnica foi inicialmente desenvolvida pelo Grupo Griesbach em 2013 e foi amplamente aplicada e elaborada por outros grupos.Estávamos entusiasmados em aplicar essa técnica a RNAs há muito não codificados, a fim de explorar suas funções específicas. Lentivírus defeituosos em replicação devem ser tratados em um laboratório que foi aprovado para trabalho viral. Além disso, as linhas celulares humanas e as bactérias E.coli são consideradas biohazardous.Por fim, plasmídeos de DNA recombinante devem ser manipulados por equipes treinadas.

Research

JoVE Journal

Genetics

Sequence-specific and Selective Recognition of Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs by Chemically Modified Peptide Nucleic Acids

Reconhecimento de sequência específica e seletivo de RNAs Double-stranded sobre Single-stranded RNA por modificados quimicamente ácidos nucleicos de peptídeo

RNAs are emerging as important biomarkers and therapeutic targets. Thus, there is great potential in developing chemical probes and therapeutic ligands ...

Genética

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

Integração de alvo CRISPR/Cas9-mediada na Vivo usando uma estratégia de baseada em juntar-se mediada por homologia final

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

Metabolic Labeling and Profiling of Transfer RNAs Using Macroarrays

Etiquetando metabólica e caracterização das RNAs de transferência usando Macroarrays

Transfer RNAs (tRNA) are abundant short non-coding RNA species that are typically 76 to 90 nucleotides in length. tRNAs are directly responsible for ...

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

Uma rápida e superficial Pipeline para gerar Genomic ponto mutantes em c. elegans usando CRISPR/Cas9 ribonucleoproteínas

The clustered regularly interspersed palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (Cas9) prokaryotic adaptive immune defense system has been ...

Dissection of Enhancer Function Using Multiplex CRISPR-based Enhancer Interference in Cell Lines

Dissecação do Enhancer função usando interferência Multiplex Enhancer CRISPR-baseado em linhas de células

Multiple enhancers often regulate a given gene, yet for most genes, it remains unclear which enhancers are necessary for gene expression, and how these ...

CRISPR Guide RNA Cloning for Mammalian Systems

Guia de Clonagem de RNA para Sistemas de Mamíferos por CRISPR

The outlined protocol describes streamlined methods for the efficient and cost-effective generation of Cas9-associated guide RNAs. Two alternative ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

Proteína endógena de marcação em humanos induzida por células-tronco pluripotentes usando CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas

Edição do genoma em linhas de células de mamíferos usando CRISPR-Cas

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) system functions naturally in bacterial adaptive immunity, but has been ...

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

Introduzindo um nocaute genético diretamente no estágio Amastigote do Trypanosoma cruzi usando o sistema crispr/Cas9

Trypanosoma cruzi is a pathogenic protozoan parasite that causes Chagas&#8217; disease mainly in Latin America. In order to identify a novel drug target ...