Name: overexpressing long noncoding rnas using gene-activating crispr
Uploaded: 2019-03-01T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Overexpressing Long Noncoding RNAs Using Gene-activating CRISPR at JoVE.com

C.P. поддерживается RO1 DK60729 и P30 ДК 41301-26. Д.п. поддерживается крона и колит фонда (CCFA) карьеры премии в области развития, лечения: DK41301 центр исследований пищеварением заболеваний (DDRC) и клинических UCLA на всей территории отеля и в трансляционной институт науки (CTSI) UL1TR0001881. UCLA вирусологии ядро финансировалась центром СПИДа исследований (CFAR) предоставить 5P 30 AI028697. UCLA комплексной молекулярных технологий, которую ядро было поддержано CURE/P30 Грант DK041301. Эта работа также была поддержана UCLA СПИДа института.

Примечание: Важно отметить, что этот протокол использует репликацию недостаточным lentiviruses. Вирусная обработки только после соответствующей лаборатории безопасности подготовки. Блич все предметы и поверхности, которые вступают в контакт с живые вирусы как минимум 10 минут посл...

<ol>
	<li>Miao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trends+of+long+noncoding+RNA+research+from+2007+to+2016:+a+bibliometric+analysis.">Trends of long noncoding RNA research from 2007 to 2016: a bibliometric analysis.</a> Oncotarget. 8 (47), 83114-83127 (2017).</li><li>Derrien, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+GENCODE+v7+catalog+of+human+long+noncoding+RNAs:+analysis+of+their+gene+structure,+evolution,+and+expression.">The GENCODE v7 catalog of human long noncoding RNAs: analysis of their gene structure, evolution, and expression.</a> Genome Research. 22 (9), 1775-1789 (2012).</li><li>Johnsson, P., Lipovich, L., Grander, D., Morris, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+conservation+of+long+non-coding+RNAs;+sequence,+structure,+function.">Evolutionary conservation of long non-coding RNAs; sequence, structure, function.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1840 (3), 1063-1071 (2014).</li><li>Perez-Pinera, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-guided+gene+activation+by+CRISPR-Cas9-based+transcription+factors.">RNA-guided gene activation by CRISPR-Cas9-based transcription factors.</a> Nature Methods. 10 (10), 973-976 (2013).</li><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity.">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li><li>Maeder, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+RNA-guided+activation+of+endogenous+human+genes.">CRISPR RNA-guided activation of endogenous human genes.</a> Nature Methods. 10 (10), 977-979 (2013).</li><li>Konermann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+transcriptional+activation+by+an+engineered+CRISPR-Cas9+complex.">Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex.</a> Nature. 517 (7536), 583-588 (2015).</li><li>Schmittgen, T. D., Livak, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+real-time+PCR+data+by+the+comparative+C(T)+method.">Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method.</a> Nature Protocols. 3 (6), 1101-1108 (2008).</li><li>Gomez, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NeST+long+ncRNA+controls+microbial+susceptibility+and+epigenetic+activation+of+the+interferon-gamma+locus.">The NeST long ncRNA controls microbial susceptibility and epigenetic activation of the interferon-gamma locus.</a> Cell. 152 (4), 743-754 (2013).</li><li>Padua, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+long+noncoding+RNA+signature+for+ulcerative+colitis+identifies+IFNG-AS1+as+an+enhancer+of+inflammation.">A long noncoding RNA signature for ulcerative colitis identifies IFNG-AS1 as an enhancer of inflammation.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 311 (3), G446-G457 (2016).</li><li>Collier, S. P., Henderson, M. A., Tossberg, J. T., Aune, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+Th1+genomic+locus+from+Ifng+through+Tmevpg1+by+T-bet.">Regulation of the Th1 genomic locus from Ifng through Tmevpg1 by T-bet.</a> Journal of Immunology. 193 (8), 3959-3965 (2014).</li><li>Kotake, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+non-coding+RNA+ANRIL+is+required+for+the+PRC2+recruitment+to+and+silencing+of+p15(INK4B)+tumor+suppressor+gene.">Long non-coding RNA ANRIL is required for the PRC2 recruitment to and silencing of p15(INK4B) tumor suppressor gene.</a> Oncogene. 30 (16), 1956-1962 (2011).</li><li>Gilbert, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Scale+CRISPR-Mediated+Control+of+Gene+Repression+and+Activation.">Genome-Scale CRISPR-Mediated Control of Gene Repression and Activation.</a> Cell. 159 (3), 647-661 (2014).</li><li>Cheng, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+activation+of+endogenous+genes+by+CRISPR-on,+an+RNA-guided+transcriptional+activator+system.">Multiplexed activation of endogenous genes by CRISPR-on, an RNA-guided transcriptional activator system.</a> Cell Research. 23 (10), 1163-1171 (2013).</li><li>Matouskova, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reference+genes+for+real-time+PCR+quantification+of+messenger+RNAs+and+microRNAs+in+mouse+model+of+obesity.">Reference genes for real-time PCR quantification of messenger RNAs and microRNAs in mouse model of obesity.</a> PLoS One. 9 (1), e86033 (2014).</li></ol>

Эта рукопись представляет собой протокол для использования активации ТРИФОСФАТЫ для overexpress lncRNAs в пробирке. Это особенно важно техника при изучении длиной некодирующих РНК как продукт транскриптомики является функциональное подразделение. После гиперэкспрессия исследователь может ?...

Хотя наиболее биомедицинских исследований сосредоточено на кодирвоания протеина стенограммы, большинство транскрипции генов на самом деле состоит из некодирующих РНК (Ensembl релиз 93). Текущие исследования начинают исследовать это поле, количество публикаций по lncRNAs в процессах заболеваний растет экспоненциально между 2007 и 2017-1. Эти публикации показывают, что многие lncRNAs, связанные с болезнью. Однако молекулярные механизмы этих lncRNAs трудно учиться из-за их различных функций по сравнению с мРНК. Усугубляет проблему понимания роли lncRNAs в болезни, lncRNAs часто выражаются на более низких уровнях, чем кодирования RNAs2. Кроме того lncRNAs плохо сохраняются, что ограничивает функциональные исследования в3человека клетки линии-на основе методов. Один из способов изучить механизм этих новых генов является эндогенно overexpress их в культивируемых клеток. Гиперэкспрессия исследования может предоставить ключевую информацию о функции специфических генов и позволяют исследователям анализировать основные молекулярные пути.
Новый метод для того чтобы активировать транскрипцию генов lncRNA основана на ТРИФОСФАТЫ технологий, первоначально разработанных в лаборатории Gersbach4. Этот протокол был адаптирован для использования в lncRNA биологии и экспрессии этих генов в других системах модель. В ТРИФОСФАТЫ, экспрессирующих технику белок, называемый ТРИФОСФАТЫ связанные белком 9 (Cas9) могут быть направлены на последовательность ДНК через антисмысловых gRNA, который распознается Cas9. Как правило Cas9 будет стимулировать расщепления ДНК; Однако мутации в Cas9, ранее разработанных для гиперэкспрессия технику, деактивировать этот шаг5. Когда transcriptional активатор сливается с «мертвых» Cas9 (dCas9) и преобразованы в клеточных линий, эндогенного Сверхэкспрессия lncRNAs может быть достигнуто в4,6. Добавление дополнительных изменений gRNA, включение дополнительных транскрипционный анализ факторов для привязки к gRNA, повышает эффективность активации системы dCas9 гена десятикратного7. Важно отметить, что было продемонстрировано, что transcriptional активации требует непосредственной близости (< 200 bp) для transcriptional запустить сайт генов, включение конкретных upregulation в Джин богатые районы7. В отличие от ТРИФОСФАТЫ нокаут технологий dCas9 и gRNA кассеты должны быть интегрированы в геном для клеток сохранить гиперэкспрессия через несколько поколений. Один из способов добиться этого заключается в использовании lentiviruses для интеграции dCas9 и содержащих gRNA кассеты. После интеграции можно определить выражение гена lncRNA.
В этой статье будет продемонстрирована протокол для lncRNA гиперэкспрессия в модели Jurkat Т-клеток. Пошаговая процедура показана и также может быть адаптирована для адэрентных клеток.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:837px;" width="837">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:245px;">Ampicillin</td>
			<td style="width:195px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:195px;">BP1760-5</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">CaCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:195px;">C1016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">cDNA synthesis kit (iScript)</td>
			<td style="width:195px;">BioRad</td>
			<td>1708891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">dCas9 forward primer</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:195px;">n/a</td>
			<td>5&#39;-TCGCCACAGCATAAAGAAGA&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">dCas9 reverse primer</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:195px;">n/a</td>
			<td>5&#39;-CTTTTCATGGTACGCCACCT</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">dCas9 vector</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:195px;">50918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM</td>
			<td>Corning</td>
			<td style="width:195px;">10013CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Ethanol</td>
			<td style="width:195px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:195px;">61509-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FBS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">gRNA plasmid</td>
			<td>VectorBuilder</td>
			<td style="width:195px;">VB180119-1195qxv</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEK293T cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td style="width:195px;">&#160;CRL-1573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:195px;">H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HPRT1 forward primer</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:195px;">n/a</td>
			<td>GACCAGTCAACAGGGGACAT&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HPRT1 reverse primer</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:195px;">n/a</td>
			<td>GCTTGCGACCTTGACCATCT</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hygromycin B</td>
			<td>Corning</td>
			<td style="width:195px;">MT3024CR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Isopropanol</td>
			<td style="width:195px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:195px;">BP2618-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Jurkat cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td style="width:195px;">&#160;TIB-152</td>
			<td style="width:203px;">clone E6-1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-glutamine</td>
			<td>Corning</td>
			<td style="width:195px;">25005Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LB agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1425-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LB broth</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1426-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Maxi-prep kit (Plasmid Purification Kit)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td style="width:195px;">12362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Na2HPO4</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:195px;">NIST2186II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Optimem I reduced serum media&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:195px;">31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">p24 elisa</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td style="width:195px;">NEK050B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">PBS</td>
			<td style="width:195px;">Corning</td>
			<td style="width:195px;">21-040-CMR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin and Streptomycin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pMDG2.G</td>
			<td>Addgene &#160;</td>
			<td style="width:195px;">#12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pMDLg/pRRE</td>
			<td>Addgene&#160;</td>
			<td style="width:195px;">#60488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Poly-L-Lysine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:195px;">P-4832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Polybrene</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td style="width:195px;">TR-1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pRSV-REV</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:195px;">#12253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Puromycin dihydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:195px;">P8833</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNA purification kit (Aurum RNA mini)</td>
			<td style="width:195px;">BioRad</td>
			<td>7326820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Butyrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:195px;">B5887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SYBR green (iTaq universal)</td>
			<td style="width:195px;">BioRad</td>
			<td>1725122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:195px;">X100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

overexpressing long noncoding rnas using gene-activating crispr

Длиной некодирующих биологии РНК (lncRNA) является новой и интересной области исследований, количество публикаций из этой области растет экспоненциально с 2007 года. Эти исследования подтвердили, что lncRNAs изменяются в практически всех заболеваний. Однако изучая функциональные роли для lncRNAs в контексте болезнь остается сложным вследствие нехватки белковых продуктов, ткани конкретного выражения, низкой выражение уровня, сложностей в сращивания формы и отсутствие сохранения среди видов. Учитывая вегетационных выражение, lncRNA исследования, часто ограничиваются исследований человеческого контекста при изучении процессов болезни. Поскольку lncRNAs функционировать на молекулярном уровне, одним из способов вскрыть lncRNA Биология является либо удалить lncRNA или overexpress lncRNA и измерения клеточном эффекты. В этой статье представлены письменные и визуализировать протокол к overexpress lncRNAs в пробирке. Как представитель эксперимент lncRNA, связанных с воспалительным заболеванием кишечника, интерферон гамма Antisense 1 (IFNG-AS1), показано оверэкспрессировали в модели Jurkat Т-клеток. Для этого, активируя кластерных регулярно interspaced короткие палиндром повторяется (ТРИФОСФАТЫ) техника используется для включения гиперэкспрессия на эндогенных локусов генома. Метод активации ТРИФОСФАТЫ цели набор факторов транскрипции на сайт transcriptional начала гена, позволяя надежные гиперэкспрессия множественных форм сплайс lncRNA. Эта процедура будет разбить на три этапа, а именно (i) руководство РНК (gRNA) дизайн и вектор строительства, (ii) вирус поколения и трансдукции и (iii) колонии скрининга для гиперэкспрессия. Для этого представитель эксперимента больше чем кратной повышение в IFNG-AS1 в Jurkat Т-клеток наблюдалось.

Система двойной Векторный overexpress lncRNA IFNG-AS1 Например эксперимент в этой рукописи является гиперэкспрессия модель системы Jurkat Т-клеток, выражая lncRNA IFNG-AS19. IFNG-AS1 является lncRNA, связанных с воспалительным заболеванием кишечника, что видел регулироват...

Watch this Scientific Journal Video about Overexpressing Long Noncoding RNAs Using Gene-activating CRISPR at JoVE.com

Overexpressing Long Noncoding RNAs Using Gene-activating CRISPR

Традиционные на основе cDNA гиперэкспрессия методы имеют ограниченную применимость для гиперэкспрессия длиной некодирующих РНК за счет их несколько форм сращивания с потенциальными возможностями. Этот обзор докладов протокол, с помощью технологии ТРИФОСФАТЫ для overexpress несколько вариантов соединения длиной некодирующих РНК.

Экспрессирующих длиной некодирующих РНК с помощью активации генов ТРИФОСФАТЫ

Long noncoding RNA (lncRNA) biology is a new and exciting field of research, with the number of publications from this field growing exponentially since ...

Некодирующие РНК часто имеют несколько изоформ. В исследованиях экстракорпорального переэкспрессии часто бывает трудно изучить все эти выраженные изоформы. Этот метод позволяет пользователям получать экспрессию непосредственно из генома и позволяет клеткам выражать эндогенные изоформы для конкретной некодирующей РНК.Этот мощный метод позволяет пользователю специально направлять экспрессию любого гена в геноме с точностью и точностью. Проектирует направляющие РНК к конкретным генам, можно использовать эндогенные генно-сращивания машины, чтобы выразить естественные изоформы в данной клетке. Демонстрацией процедуры будет Роберт Рэнкин, пост-док из моей лаборатории.Для разработки руководства РНК последовательность, которая находится в пределах 100 базовых пар транскрипционные начала сайта, использовать генетические базы данных, такие как BLAT, чтобы убедиться, что руководство РНК является уникальным для гена интереса. Храните направляющий РНК и деактивированные плазмиды Cas9 при четырех градусах Цельсия. Streak из E.coli на лурии бульон агар пластины с ампициллином и расти бактерии ночь на 37 градусов по Цельсию.На следующий день, выбрать колонии и расти бактерии в пяти миллилитров LB с ампициллином ночь, энергично встряхивая трубку в 37-градусный инкубатор по Цельсию. На следующий день добавьте два миллилитров бактерий в 200 миллилитров ЛБ с ампициллином в двухлитровую колбу, энергично встряхивая колбу на ночь в 37-градусном инкубаторе по Цельсию. Спин вниз бактерий на 3, 724 раз г в течение 20 минут и приступить к очистке ДНК.Для создания dCas9-содержащих лентивирус, первый слой 100-миллилитровой ткани культуры блюда с пятью миллилитров 0,01% Поли-L-лизин и пластины пять миллионов HEK293T клеток на блюдо в 10 миллилитров полного Dulbecco в модифицированных орлов среднего, затем подготовьте образцы трансфекции ДНК, смешивая 10 микрограммов ЛТР-содержащего направляющий РНК-вектор или LTR-содержащий деактивированный вектор Cas9 с плазмидами, содержащими компоненты вирусов. Добавьте воду в общий объем 450 микролитров и отфильтруйте смесь через наконечник фильтра 0,2 микрона, прикрепленный к шприцу. Затем добавьте 50 микролитров 2,5-молярного дихлорида кальция в каждый образец трансфекции ДНК и смешайте осторожно.Фильтр смеси кальция-ДНК через 0,2-микрон фильтр наконечник прилагается к шприцу. Пипетт 500 микролитров 2X HBS в пятими миллилитровую полистироловую трубку. Добавьте 500 микролитров смеси кальция-ДНК по капле и мягко вихрем.Инкубировать при комнатной температуре в течение трех минут. Добавьте один миллилитр подвески HBS ДНК-кальция к каждому блюду культуры тканей HEK293T и инкубировать их в инкубаторе двуокиси углерода 5%при 37 градусах По Цельсию за одну ночь. На третий день, медленно удалить и отказаться от средств массовой информации из посуды.Тщательно мыть клетки с PBS один раз. Добавьте шесть миллилитров полного DMEM, дополненного 20-миллимолярной HEPES и 10-миллимолярной бутиратом натрия. Затем инкубировать клетки в 5%углекислого газа инкубатор при 37 градусов по Цельсию в течение пяти-шести часов.После инкубации, мыть клетки с PBS один раз и добавить пять миллилитров полного DMEM с 20-миллимолярной HEPES в HEK293T клеток. Инкубировать клетки в 5%carbon диоксида инкубатора при 37 градусов по Цельсию в течение 12 часов. На четвертый день соберите супернатанты heK293T и отфильтруй супернатант, содержащий вирус.Для начала количество вирусных частиц сначала разбавляйте концентрат для мытья из комплекта P24 ELISA, добавляя 19 частей дистиллированной, деионизированной воды. Затем разбавьте положительный контроль от этого комплекта до 200 нанограмм на миллилитр, используя RPMI 1640 в качестве разбавления и сделайте разбавления для стандартной кривой в 1,5-миллилитровых трубках в соответствии с таблицей разбавления P24 ELISA. Для измерения концентрации вируса в образцах добавьте разбавления образца к назначенным скважинам пластины 96 скважин, начиная с 1:1000 разбавления и изменить объем по мере необходимости, чтобы быть в пределах стандартной кривой.Затем разбавьте образцы с Triton X-100 до конечной концентрации 0,5% и добавьте 200 микролитров каждого образца и RPMI 1640 к назначенным скважинам. Печать пластины и инкубировать его при 37 градусов по Цельсию в течение двух часов. Вымойте пластину с 300 микролитров на колодец буфера 1X мыть шесть раз.Удалите излишки жидкости, инвертирование пластины и постукивая его на бумажное полотенце. Затем добавьте 100 микролитров детекторных антител из комплекта во все скважины, кроме субстрата пустым. Печать пластины и инкубировать его при 37 градусов по Цельсию в течение одного часа.Вымойте тарелку, а затем удалить излишки жидкости, инвертирование пластины и нажав его на бумажное полотенце. Для того, чтобы измерить антитела детектора, разбавить стрептавидин хрен пероксидазы в 1:100 разбавления с SA-HRP разбавляют. Тщательно смешайте разбавленный SA-HRP и добавьте 100 микролитров ко всем скважинам, кроме пустых.Печать и инкубировать пластину при комнатной температуре в течение 30 минут. Затем вымойте тарелку буфером для мытья 1X и оттехав любую лишнюю жидкость. Бросьте одну таблетку ортофенилендиамина в 11 миллилитров разбомбового субстрата, чтобы сделать достаточное количество субстратного раствора для одной пластины.Vortex OPD решение энергично растворить его полностью и защитить его от света. Добавьте 100 микролитров субстратного раствора OPD ко всем скважинам, включая заготовок. Используя спектрофотометр, немедленно прочитайте абсорбанс на 450 нанометров.Повторите 10 раз с интервалом в одну секунду и сделайте среднее измерение. Resuspend и культуры Jurkat Т-клеток в колбе T75 с плотностью одного миллиона клеток в пяти миллилитров уменьшенных средств сыворотки с полибреном. Затем добавьте HEK293T-кондиционированные средства массовой информации, содержащие один миллион dCas9-содержащих вирусных частиц.Инкубировать клетки при 37 градусах по Цельсию с 5%углекислым газом. Три дня после заражения, спина вниз клетки в 233 времени г в течение пяти минут и повторно их в 10 миллилитров полного DMEM дополняется пуромицином. Культура клеток в колбы T75 и инкубировать их при 37 градусов по Цельсию с 5%углекислого газа.Каждый третий день в течение девяти дней, спина вниз клетки в 233 раза г в течение пяти минут и заменить средства массовой информации с полным DMEM дополнен пуромицин. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра или автоматизированного счетчика клеток. Затем, на 96-хорошо пластины с тканью культуры обработанных тканей, добавить 10000 клеток в 100 микролитров полного DMEM дополняется пуромицином в первой хорошо.Сделать 1:1 серийных разбавления содержимого следующих скважин с полным DMEM дополняется пуромицином. Инкубировать клетки при 37 градусах по Цельсию с 5%углекислым газом. Расширьте клональные клетки на две пластины из 24 колодец, затем пластина два миллиона клеток на колодец из шести хорошо пластины для трех клонов.Плита других трех скважин с не-транс индуцированных клеток Jurkat в качестве элементов управления. Наконец, пластины клеток в колбу T75 и положить клетки в инкубатор культуры клеток на ночь. Чтобы начать количественный ПЦР для измерения экспрессии генов, сначала синтезировать комплементарную ДНК, добавив один микрограмм РНК, четыре микролитров буфера синтеза кДНК и один микролитр обратной транскриптазы до 250 микролитровых трубок, а затем добавить воду к окончательному объему 20 микролитров.Затем используйте тепловой циклер при 42 градусах По Цельсию в течение 30 минут и при 95 градусах По Цельсию в течение пяти минут, чтобы инактивировать обратную транскриптазу. Разбавить кДНК 60 микролитров воды после синтеза. Запуск полимеразных цепных реакций для трубок, содержащих 0,5 микролитров каждого вперед и обратного грунтовки при конечной концентрации 10 микромолящих, пяти микролитров зеленого SYBR и четырех микролитров cDNA.Наконец, выберите клетки Jurkat-dCas9 в DMEM, дополненные гигромицином B в течение 10 дней. Вращай клетки и меняй мультимедиа каждые три дня. Очисти RNAse и перейти к RT-qPCR.В этом исследовании, gRNA последовательности, которые были в пределах от 10 до 100 базовых пар от транскрипционные стартовые площадки были использованы для направления Cas9-активации комплекса транскрипционные локус IFNG-AS1, долго некодирования РНК, связанные с воспалительными заболеваниями кишечника. Для выбора двойных трансдуцированных клеток использовалась двухплазмидная система для трансдукций усилителей dCas9 или gRNAse в клетки. Здесь белки MS2 усиливают переэкспрессию IFNG-AS1.Выражение Cas9 было подтверждено для обоих клонов. Праймеры против HPRT1 были использованы для подтверждения наличия РНК в нетрансфюсированных клетках. выражение мРНК было подтверждено, опустив обратную транскриптазу из реакции cDNA.Три варианта сращивания IFNG-AS1 могут быть обнаружены либо с транскрипцией конкретных наборов грунтовки или грунтовки набор против всех известных IFNG-AS1 стенограммы. Все кривые флуоресценции были экспоненциальными с геном домашнего хозяйства HPRT1, достигающий экспоненциальной фазы в течение половины цикла между контроль и клетками, выражаюми МФНГ-AS1. Праймеры против всех известных транскриптов IFNG-AS1 были наиболее обнаруживаемыми между экспериментами, с измерениями 20-кратного увеличения экспрессии IFNG-AS1.Однако третья стенограмма IFNG-AS1 показала пяти-10-кратное значительное увеличение уровня IFNG-AS1. Чтобы активно переэкспрессировать желаемый ген, дизайн направляющий РНК в шаге 2.1 имеет решающее значение для успеха протокола. Кроме того, производство качественных вирусных частиц обеспечит надежное выражение компонентов протокола.После того, как желаемый ген переэкспрессирован, функциональные исследования могут быть выполнены для исследования генных механизмов. В нашем примере мы решили посмотреть на производство цитокинов после переэкспрессии нашего гена интереса. Этот метод был первоначально разработан Griesbach Group в 2013 году и широко применялся и разрабатывался другими группами.Мы были рады применить этот метод к длинным некодируемых РНК для того, чтобы изучить их конкретные функции. Репликационно-дефектные лентивирусы должны быть обработаны в лаборатории, которая была одобрена для вирусной работы. Кроме того, клеточные линии человека и бактерии E.coli считаются биологически случайными.Наконец, рекомбинантные плазмиды ДНК должны обрабатываться квалифицированным персоналом.

Research

JoVE Journal

Genetics

Sequence-specific and Selective Recognition of Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs by Chemically Modified Peptide Nucleic Acids

Последовательность конкретных и избирательное признание двуцепочечной РНК над одноцепочечной РНК, химически изменены пептид нуклеиновых кислот

RNAs are emerging as important biomarkers and therapeutic targets. Thus, there is great potential in developing chemical probes and therapeutic ligands ...

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

ТРИФОСФАТЫ/Cas9-опосредованной целенаправленной интеграции в естественных условиях с помощью стратегию на основе присоединения гомологии опосредованной конец

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

Metabolic Labeling and Profiling of Transfer RNAs Using Macroarrays

Метаболические маркировки и профилирование передачи РНК с помощью Macroarrays

Transfer RNAs (tRNA) are abundant short non-coding RNA species that are typically 76 to 90 nucleotides in length. tRNAs are directly responsible for ...

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

Быстрое и поверхностным трубопровода для генерации геномной мутантов точки в C. elegans с помощью ТРИФОСФАТЫ/Cas9 Ribonucleoproteins

The clustered regularly interspersed palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (Cas9) prokaryotic adaptive immune defense system has been ...

Dissection of Enhancer Function Using Multiplex CRISPR-based Enhancer Interference in Cell Lines

Рассечение Enhancer функции мультиплексной основанный ТРИФОСФАТЫ Enhancer вмешательства в клеточных линиях

Multiple enhancers often regulate a given gene, yet for most genes, it remains unclear which enhancers are necessary for gene expression, and how these ...

CRISPR Guide RNA Cloning for Mammalian Systems

ТРИФОСФАТЫ руководство РНК клонирования млекопитающих систем

The outlined protocol describes streamlined methods for the efficient and cost-effective generation of Cas9-associated guide RNAs. Two alternative ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

Эндогенного белка, пометки в человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток с использованием ТРИФОСФАТЫ/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas

Геном редактирование в Mammalian клеток линии, используя ТРИФОСФАТЫ-Cas

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) system functions naturally in bacterial adaptive immunity, but has been ...

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

Представляя ген нокаут непосредственно в Amastigote Этап trypanosoma cruzi Использование CRISPR / Cas9 системы

Trypanosoma cruzi is a pathogenic protozoan parasite that causes Chagas&#8217; disease mainly in Latin America. In order to identify a novel drug target ...