Name: overexpressing long noncoding rnas using gene-activating crispr
Uploaded: 2019-03-01T15:00:00
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C.P. es apoyado por DK60729 to1 y P30 DK 41301-26. D.P. es apoyado por un Crohn & Colitis Foundation (CCFA) de carrera Premio desarrollo, curación: DK41301 centro de investigación de enfermedades digestivas (DDRC) y clínica de UCLA y UL1TR0001881 Instituto de ciencia traslacional (CTSI). El centro de virología de la UCLA fue financiado por el centro de investigación del SIDA (CFAR) concede 30 P 5 AI028697. Las tecnologías moleculares integradas de UCLA núcleo fue apoyado por curación/P30 conceder DK041301. Este trabajo fue apoyado también por el Instituto de SIDA de UCLA.

Nota: Es importante señalar que este protocolo utiliza replicación deficiente lentivirus. Realizar manejo viral sólo después del entrenamiento de seguridad de laboratorio apropiado. Bleach todos los artículos y las superficies que entran en contacto con virus vivos para un mínimo de 10 minutos después de manipularlo. Uso una protección de la capa y el ojo de la cara de laboratorio desechables, así como guantes dobles, en todo momento. Realizar el trabajo de virus en bioseguridad nivel 2 + labora...

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	<li>Miao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trends+of+long+noncoding+RNA+research+from+2007+to+2016:+a+bibliometric+analysis.">Trends of long noncoding RNA research from 2007 to 2016: a bibliometric analysis.</a> Oncotarget. 8 (47), 83114-83127 (2017).</li><li>Derrien, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+GENCODE+v7+catalog+of+human+long+noncoding+RNAs:+analysis+of+their+gene+structure,+evolution,+and+expression.">The GENCODE v7 catalog of human long noncoding RNAs: analysis of their gene structure, evolution, and expression.</a> Genome Research. 22 (9), 1775-1789 (2012).</li><li>Johnsson, P., Lipovich, L., Grander, D., Morris, K. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Scale+CRISPR-Mediated+Control+of+Gene+Repression+and+Activation.">Genome-Scale CRISPR-Mediated Control of Gene Repression and Activation.</a> Cell. 159 (3), 647-661 (2014).</li><li>Cheng, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+activation+of+endogenous+genes+by+CRISPR-on,+an+RNA-guided+transcriptional+activator+system.">Multiplexed activation of endogenous genes by CRISPR-on, an RNA-guided transcriptional activator system.</a> Cell Research. 23 (10), 1163-1171 (2013).</li><li>Matouskova, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reference+genes+for+real-time+PCR+quantification+of+messenger+RNAs+and+microRNAs+in+mouse+model+of+obesity.">Reference genes for real-time PCR quantification of messenger RNAs and microRNAs in mouse model of obesity.</a> PLoS One. 9 (1), e86033 (2014).</li></ol>

Este manuscrito presenta un protocolo para utilizar activar CRISPR para sobreexpresar lncRNAs in vitro. Se trata de una técnica especialmente importante al estudiar la larga noncoding RNAs como producto transcriptómicos es la unidad funcional. Después de sobreexpresión, el investigador puede, entonces, utilizar estas células para aumentar la relación señal a ruido al estudiar a socios de enlace y medir incluso las consecuencias celulares de aumento de los niveles de lncRNAs. Además, como lncRNAs con frecuencia ac...

Mientras que la investigación biomédica más se ha centrado en la codificación de proteínas transcripción, la mayoría de los genes transcritos consiste en realmente de noncoding RNAs (comunicado 93 de Ensembl). La investigación actual está empezando a explorar este campo, con el número de publicaciones en lncRNAs en procesos de la enfermedad aumentando exponencialmente entre 2007 y 20171. Estas publicaciones muestran que muchos lncRNAs se asocian con la enfermedad. Sin embargo, los mecanismos moleculares de estas lncRNAs son difíciles de estudiar debido a sus diversas funciones en comparación con los mRNAs. Agrava el problema de entender el papel de lncRNAs en la enfermedad, lncRNAs a menudo se expresan a niveles inferiores a codificación RNAs2. Además, lncRNAs se conservan mal, que limita los estudios funcionales en humanos célula-línea-técnicas basadas en3. Un método para estudiar el mecanismo de estos nuevos genes es endógeno los sobreexpresan en células cultivadas. Estudios de sobreexpresión pueden proporcionar información clave sobre la función de genes específicos y permiten a los investigadores a diseccionar las vías moleculares claves.
Un nuevo método para activar la transcripción de genes lncRNA se basa en tecnologías CRISPR desarrolladas inicialmente por el laboratorio de Gersbach4. Este protocolo ha sido adaptado para el uso en biología lncRNA y para la expresión de estos genes en otros sistemas del modelo. En el CRISPR overexpressing técnica, una proteína llamada proteína CRISPR 9 (Cas9) puede estar dirigida hacia una secuencia de ADN a través de un gRNA antisentido que es reconocido por Cas9. Normalmente, Cas9 inducirá la hendidura de la DNA; sin embargo, las mutaciones en el Cas9, desarrollada previamente en la técnica de sobreexpresión, desactivarán este paso5. Cuando un activador transcripcional está fusionado a un Cas9 «muertos» (dCas9) y transduced en líneas celulares, la sobreexpresión endógena de lncRNAs puede ser alcanzado4,6. La adición de modificaciones adicionales a la gRNA, permitiendo otros factores transcripcionales enlazar a la gRNA, aumentó la eficacia del sistema de activación de gen dCas9 10 veces7. Lo importante, se demostró que la activación transcripcional requiere proximidad (< 200 bp) empezar el transcripcional genes de sitio, lo que permite un upregulation específico en zonas ricas en genes7. A diferencia de tecnologías de nocaut CRISPR, cintas dCas9 y gRNA necesitan integrarse en el genoma para permitir para que las células conservan un énfasis excesivo sobre varias generaciones. Un método para lograrlo es utilizar lentiviruses para integrar los casetes que contienen la dCas9 y la gRNA. Tras la integración, la expresión del gen lncRNA puede ser determinada.
En este artículo, se demostrará un protocolo para lncRNA sobreexpresión en un modelo de Jurkat T-cell. Un procedimiento paso a paso se muestra y puede ser adaptado también a células adherentes.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:837px;" width="837">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:245px;">Ampicillin</td>
			<td style="width:195px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:195px;">BP1760-5</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">CaCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:195px;">C1016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">cDNA synthesis kit (iScript)</td>
			<td style="width:195px;">BioRad</td>
			<td>1708891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">dCas9 forward primer</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:195px;">n/a</td>
			<td>5&#39;-TCGCCACAGCATAAAGAAGA&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">dCas9 reverse primer</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:195px;">n/a</td>
			<td>5&#39;-CTTTTCATGGTACGCCACCT</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">dCas9 vector</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:195px;">50918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM</td>
			<td>Corning</td>
			<td style="width:195px;">10013CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Ethanol</td>
			<td style="width:195px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:195px;">61509-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FBS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">gRNA plasmid</td>
			<td>VectorBuilder</td>
			<td style="width:195px;">VB180119-1195qxv</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEK293T cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td style="width:195px;">&#160;CRL-1573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:195px;">H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HPRT1 forward primer</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:195px;">n/a</td>
			<td>GACCAGTCAACAGGGGACAT&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HPRT1 reverse primer</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:195px;">n/a</td>
			<td>GCTTGCGACCTTGACCATCT</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hygromycin B</td>
			<td>Corning</td>
			<td style="width:195px;">MT3024CR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Isopropanol</td>
			<td style="width:195px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:195px;">BP2618-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Jurkat cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td style="width:195px;">&#160;TIB-152</td>
			<td style="width:203px;">clone E6-1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-glutamine</td>
			<td>Corning</td>
			<td style="width:195px;">25005Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LB agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1425-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LB broth</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1426-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Maxi-prep kit (Plasmid Purification Kit)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td style="width:195px;">12362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Na2HPO4</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:195px;">NIST2186II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Optimem I reduced serum media&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:195px;">31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">p24 elisa</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td style="width:195px;">NEK050B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">PBS</td>
			<td style="width:195px;">Corning</td>
			<td style="width:195px;">21-040-CMR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin and Streptomycin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pMDG2.G</td>
			<td>Addgene &#160;</td>
			<td style="width:195px;">#12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pMDLg/pRRE</td>
			<td>Addgene&#160;</td>
			<td style="width:195px;">#60488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Poly-L-Lysine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:195px;">P-4832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Polybrene</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td style="width:195px;">TR-1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pRSV-REV</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:195px;">#12253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Puromycin dihydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:195px;">P8833</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNA purification kit (Aurum RNA mini)</td>
			<td style="width:195px;">BioRad</td>
			<td>7326820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Butyrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:195px;">B5887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SYBR green (iTaq universal)</td>
			<td style="width:195px;">BioRad</td>
			<td>1725122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:195px;">X100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

overexpressing long noncoding rnas using gene-activating crispr

Durante mucho tiempo los RNA (lncRNA) biología es un campo nuevo y emocionante de la investigación, con el número de publicaciones de este campo crece de manera exponencial desde el año 2007. Estos estudios han confirmado que lncRNAs se alteran en casi todas las enfermedades. Sin embargo, estudiando los roles funcionales de lncRNAs en el contexto de la enfermedad sigue siendo difícil debido a la falta de expresión tejido específica, niveles de expresión baja, productos proteicos, complejidades en formas de empalme y la falta de conservación entre las especies. Dada la expresión propios de cada especie, lncRNA estudios son a menudo restringidos a contextos de investigación al estudio de procesos de la enfermedad. Ya que lncRNAs la función a nivel molecular, una forma de diseccionar lncRNA biología es quitar el lncRNA o sobreexpresan los efectos celulares lncRNA y medida. En este artículo, se presenta un protocolo escrito y visualizar que sobreexpresan la lncRNAs in vitro. Como un experimento representativo, un lncRNA asociada a enfermedad inflamatoria intestinal, 1 de antisentido interferón Gamma (IFNG-AS1), muestra que es overexpressed en un modelo de Jurkat T-cell. Para lograr esto, la técnica activa de regularmente otro corto repite palindrómico (CRISPR) agrupado se utiliza para permitir que la sobreexpresión en los lugares geométricos genomic endógenas. La técnica CRISPR activa apunta a un conjunto de factores de transcripción a la página de inicio transcripcional de un gen, lo que permite una fuerte sobreexpresión de múltiples formas de empalme lncRNA. Este procedimiento se divide en tres pasos, a saber (i) guía RNA (gRNA) diseño y vector construcción, generación (ii) virus y transducción de señales y proyección (iii) Colonia de sobreexpresión. Para este experimento representativo, un mayor de 20-fold mejora en AS1 de IFNG en células Jurkat T se observó.

Un sistema de doble vector para sobreexpresar lncRNA interferon-AS1 El experimento de ejemplo en este manuscrito es la sobreexpresión de un sistema de modelo de células Jurkat T expresando lncRNA interferon-AS19. Interferon-AS1 es un lncRNA asociada a enfermedad inflamatoria intestinal, que se ha visto regular interferón Gamma10. El gen del IFNG-AS1 contiene tres variantes de empalme que todos utilizan el mismo sitio d...

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Overexpressing Long Noncoding RNAs Using Gene-activating CRISPR

Las técnicas tradicionales basados en cDNA sobreexpresión tienen una aplicabilidad limitada para la sobreexpresión de larga noncoding RNAs debido a sus múltiples formas de empalme con la funcionalidad potencial. Esta revisión informa un protocolo usando tecnología de CRISPR para sobreexpresar múltiples variantes de empalme de un ARN largo cubierta.

Overexpressing larga Noncoding RNAs mediante activación de gen CRISPR

Long noncoding RNA (lncRNA) biology is a new and exciting field of research, with the number of publications from this field growing exponentially since ...

Los ARN no cosidos a menudo tienen varias isoformas. En estudios de sobreexpresión in vitro, a menudo es difícil estudiar todas estas isoformas expresadas. Esta técnica permite a los usuarios derivar la expresión directamente del genoma y permitir que las células expresen las isoformas endógenas para un ARN no codificante en particular.Esta potente técnica permite al usuario dirigir específicamente la expresión de cualquier gen en el genoma con fidelidad y precisión. Mediante el diseño de ARN guía a genes específicos, uno es capaz de utilizar la maquinaria de división genética endógena para expresar las isoformas naturales en una célula dada. Demostrando el procedimiento estará Robert Rankin, un post-doc de mi laboratorio.Para diseñar la secuencia de ARN guía que se encuentra dentro de 100 pares base del sitio de inicio transcripcional, utilice bases de datos genéticas como BLAT para asegurarse de que el ARN guía es único para el gen de interés. Almacene el ARN guía y los plásmidos Cas9 desactivados a cuatro grados centígrados. Estirar E.coli en un plato de agar de caldo de Luria con ampicilina y hacer crecer la bacteria durante la noche a 37 grados centígrados.Al día siguiente, escoge una colonia y haz crecer las bacterias en cinco mililitros de LB con ampicilina durante la noche, agitando vigorosamente el tubo en una incubadora de 37 grados Celsius. Al día siguiente, añadir dos mililitros de bacterias a 200 mililitros de LB con ampicilina en un matraz de dos litros, agitando vigorosamente el matraz durante la noche en una incubadora de 37 grados Celsius. Girar hacia abajo las bacterias a 3, 724 veces g durante 20 minutos y proceder a la purificación del ADN.Para crear el lentivirus que contiene dCas9, primero cubra los platos de cultivo de tejido de 100 mililitros con cinco mililitros de 0.01%Poly-L-Lisine y cubra cinco millones de células HEK293T por plato en 10 mililitros de medio completo de águilas modificadas de Dulbecco, a continuación, prepare muestras de transfección de ADN mezclando 10 microgramos de un vector de ARN guía que contenga LTR o un vector Cas9 desactivado que contiene LTR con plásmidos que contienen componentes de virus. Agregue agua a un volumen total de 450 microlitros y filtre la mezcla a través de una punta de filtro de 0,2 micras conectada a una jeringa. A continuación, agregue 50 microlitros de dicloruro de calcio de 2,5 molares a cada muestra de transfección del ADN y mezcle suavemente.Filtrar la mezcla de calcio y ADN a través de una punta de filtro de 0,2 micras unida a una jeringa. Pipetear 500 microlitros de 2X HBS en un tubo de poliestireno de cinco mililitros. Añadir 500 microlitros de la mezcla de calcio-ADN gotas y vórtice suavemente.Incubar a temperatura ambiente durante tres minutos. Añadir un mililitro de la suspensión HBS de ADN-calcio a cada plato de cultivo de tejido que contenga HEK293T e incubarlos en una incubadora de dióxido de carbono al 5% a 37 grados centígrados durante la noche. El tercer día, retire y deseche lentamente los medios de comunicación de los platos.Lave cuidadosamente las células con PBS una vez. Añadir seis mililitros de DMEM completo complementado con HEPES de 20 mililitros y butirato de sodio de 10 mililitros. Luego incubar las células en una incubadora de dióxido de carbono del 5% a 37 grados centígrados durante cinco a seis horas.Después de la incubación, lavar las células con PBS una vez y añadir cinco mililitros de DMEM completo con HEPES de 20 mililitros a las células HEK293T. Incubar las células en una incubadora de dióxido de carbono del 5% a 37 grados centígrados durante 12 horas. En el cuarto día, recoja los sobrenadantes de células HEK293T y filtre el sobrenadante que contiene el virus.Para comenzar el recuento de partículas virales, primero diluya el concentrado de lavado del kit ELISA P24 añadiendo 19 partes de agua destilada y desionizada. A continuación, diluir el control positivo de este kit a 200 nanogramos por mililitro utilizando RPMI 1640 como diluyente y hacer diluciones para una curva estándar en tubos de 1,5 mililitros según la tabla de dilución ELISA P24. Para medir la concentración del virus dentro de las muestras añadir las diluciones de la muestra a los pocillos designados de una placa de 96 pocillos, a partir de 1:1000 dilución y modificar el volumen según sea necesario para estar dentro del rango de la curva estándar.A continuación, diluya las muestras con Triton X-100 a una concentración final del 0,5% y añada 200 microlitros de cada muestra y RPMI 1640 a los pozos designados. Selle la placa e intepe a 37 grados centígrados durante dos horas. Lave la placa con 300 microlitros por pozo del tampón de lavado 1X seis veces.Retire cualquier exceso de líquido invirtiendo la placa y golpeándola en una toalla de papel. A continuación, añada 100 microlitros de anticuerpo detector del kit a todos los pozos excepto al sustrato en blanco. Selle la placa e intepe a 37 grados centígrados durante una hora.Lave la placa y luego retire el exceso de líquido invirtiendo la placa y golpeándola en una toalla de papel. Para medir el anticuerpo detector, diluya la peroxidasa de rábano picante estreptavidina a 1:100 dilución con diluyente SA-HRP. Mezclar bien el SA-HRP diluido y añadir 100 microlitros a todos los pozos excepto el espacio en blanco.Selle e incubar la placa a temperatura ambiente durante 30 minutos. A continuación, lave la placa con el tampón de lavado 1X y toque cualquier exceso de líquido. Deje caer un comprimido de ortofenilendiamina en 11 mililitros del diluyente del sustrato para hacer suficiente solución de sustrato para una placa.Vórtice la solución OPD vigorosamente para disolverla por completo y protegerla de la luz. Agregue 100 microlitros de solución de sustrato OPD a todos los pomos, incluido el espacio en blanco. Usando un espectrofotómetro, lea la absorbancia a 450 nanómetros inmediatamente.Repita 10 veces a intervalos de un segundo y tome la medida media. Resuspend y cultivo de células T De Jurkat en un matraz T75 con una densidad de un millón de células en cinco mililitros de los medios séricos reducidos con polibreno. A continuación, agregue medios condicionados por HEK293T que contengan un millón de partículas virales que contengan dCas9.Incubar las células a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono. Tres días después de la infección, girar hacia abajo las células a 233 g tiempo durante cinco minutos y resuspend a ellos en 10 mililitros de DMEM completo complementado con puromicina. Cultivo de las células en matraces T75 e incubarlas a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono.Cada tercer día durante un período de nueve días, girar hacia abajo las células a 233 veces g durante cinco minutos y reemplazar los medios con el DMEM completo complementado con puromicina. Cuente las células utilizando un hemocitoómetro o un contador de células automatizado. Luego, en una placa de 96 pozos con tejido tratado con tejido, agregue 10.000 células en 100 microlitros del DMEM completo complementado con puromicina en el primer pozo.Hacer 1:1 diluciones en serie del contenido de los siguientes pozos con el DMEM completo complementado con puromicina. Incubar las células a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono. Expanda las células clonales en dos placas de 24 pozos, luego plate dos millones de células por pozo de una placa de seis pozos para tres de los clones.Placa los otros tres pozos con células Jurkat no transducidas como controles. Finalmente, platina las células en un matraz T75 y coloca las células en una incubadora de cultivo celular durante la noche. Para comenzar la PCR cuantitativa para medir la expresión génica, primero sintetice el ADN complementario añadiendo un microgramo de ARN, cuatro microlitros de tampón de síntesis de ADNn. y un microlitro de transcriptasa inversa a 250 tubos de microlitro, luego agregue agua a un volumen final de 20 microlitros.Luego, utilice un ciclor térmico a 42 grados Celsius durante 30 minutos y a 95 grados Celsius durante cinco minutos para inactivar la transcriptasa inversa. Diluir el ADNc con 60 microlitros de agua después de la síntesis. Ejecutar reacciones en cadena de polimerasa para tubos que contienen 0,5 microlitros de cada imprimación hacia adelante y hacia atrás a una concentración final de 10 micromolares, cinco microlitros de verde SYBR y cuatro microlitros de ADNc.Finalmente seleccione Las células de Jurkat-dCas9 en DMEM suplementados con higromicina B durante 10 días. Gire hacia abajo las células y cambie los medios cada tres días. Purify RNAse y proceda a RT-qPCR.En este estudio, las secuencias de ARNN que estaban dentro de 10 a 100 pares base lejos del sitio de inicio transcripcional se utilizaron para dirigir el complejo activador de Cas9 al locus transcripcional de IFNG-AS1, un ARN no codificante largo asociado con la enfermedad inflamatoria intestinal. Para permitir la selección de células transducidas dobles, se utilizó un sistema de dos plásmidos para transducir potenciadores dCas9 o gRNAse en células. Aquí las proteínas MS2 mejoran la sobreexpresión de IFNG-AS1.Se confirmó la expresión Cas9 para ambos clones. Los primeros contra HPRT1 se utilizaron para confirmar la presencia de ARN en las células no transducidas. La expresión de ARNm se confirmó omitiendo la transcriptasa inversa de la reacción del ADNr.Se podrían detectar tres variantes de empalme de IFNG-AS1 con conjuntos de imprimación específicos de transcripción o un conjunto de imprimación en todas las transcripciones CONOCIDAs de IFNG-AS1. Todas las curvas de fluorescencia fueron exponenciales con el gen de limpieza HPRT1 alcanzando la fase exponencial dentro de un medio ciclo entre el control y las células que expresan el GRNA IFNG-AS1. Los primeros contra todas las transcripciones conocidas de IFNG-AS1 fueron los más detectables entre experimentos, con mediciones de aumentos de 20 veces en la expresión IFNG-AS1.Sin embargo, la tercera transcripción de la IFNG-AS1 mostró un aumento significativo de cinco a 10 veces en los niveles de IFNG-AS1. Para sobreexpresar activamente el gen deseado, el diseño del ARN guía en el paso 2.1 es fundamental para el éxito del protocolo. Además, la producción de partículas virales de calidad garantizará una expresión robusta de sus componentes de protocolo.Una vez que el gen deseado está sobreexpresado, se pueden realizar estudios funcionales para investigar los mecanismos genéticos. En nuestro ejemplo, elegimos examinar la producción de citoquinas después de la sobreexpresión de nuestro gen de interés. Esta técnica fue desarrollada inicialmente por el Grupo Griesbach en 2013 y ha sido ampliamente aplicada y elaborada por otros grupos.Estábamos encantados de aplicar esta técnica a los ARN no codificados durante mucho tiempo con el fin de explorar sus funciones específicas. Los lentivirus defectuosos por replicación deben manipularse en un laboratorio que haya sido aprobado para el trabajo viral. Además, las líneas celulares humanas y las bacterias E. coli se consideran biopeligrosas.Por último, los plásmidos de ADN recombinantes deben ser manejados por personal capacitado.

Research

JoVE Journal

Genetics

Sequence-specific and Selective Recognition of Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs by Chemically Modified Peptide Nucleic Acids

Reconocimiento de secuencia específica y selectivo de RNAs de doble cadena sobre ARN monocatenario de modifica químicamente los ácidos nucleicos péptidos

RNAs are emerging as important biomarkers and therapeutic targets. Thus, there is great potential in developing chemical probes and therapeutic ligands ...

Investigación

Genética

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

Integración dirigida CRISPR/Cas9-mediada In Vivo mediante una estrategia basada en unirse a final mediada por homología

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

Metabolic Labeling and Profiling of Transfer RNAs Using Macroarrays

Etiquetado metabólico y perfiles de RNAs de transferencia utilizando Macroarrays

Transfer RNAs (tRNA) are abundant short non-coding RNA species that are typically 76 to 90 nucleotides in length. tRNAs are directly responsible for ...

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

Un rápido y fácil tubería para generar genómica punto mutantes de C. elegans utilizando CRISPR/Cas9 ribonucleoproteínas

The clustered regularly interspersed palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (Cas9) prokaryotic adaptive immune defense system has been ...

Dissection of Enhancer Function Using Multiplex CRISPR-based Enhancer Interference in Cell Lines

Disección de la función del reforzador mediante Multiplex basados en CRISPR potenciador de interferencia en líneas celulares

Multiple enhancers often regulate a given gene, yet for most genes, it remains unclear which enhancers are necessary for gene expression, and how these ...

CRISPR Guide RNA Cloning for Mammalian Systems

RNA de la guía CRISPR clonación de mamíferos sistemas

The outlined protocol describes streamlined methods for the efficient and cost-effective generation of Cas9-associated guide RNAs. Two alternative ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

Proteína endógena Tagging en humanos inducida por células madre pluripotentes utilizando CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas

Edición del genoma en las líneas celulares de mamíferos utilizando CRISPR-Cas

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) system functions naturally in bacterial adaptive immunity, but has been ...

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

Introducción de un Knockout Gene Directamente en la etapa de Amastigote de Trypanosoma cruzi usando el sistema CRISPR/Cas9

Trypanosoma cruzi is a pathogenic protozoan parasite that causes Chagas&#8217; disease mainly in Latin America. In order to identify a novel drug target ...