Name: overexpressing long noncoding rnas using gene-activating crispr
Uploaded: 2019-03-01T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Overexpressing Long Noncoding RNAs Using Gene-activating CRISPR at JoVE.com

C.P. stöds av RO1 DK60729 och P30 DK 41301-26. D.P. stöds av en Crohns & kolit Foundation (CCFA) karriär development award, botemedel: mag sjukdomar Research Center (DDRC) DK41301, och UCLA klinisk och translationell Science Institute (CTSI) UL1TR0001881. UCLA virologi kärnan finansierades genom centrum av AIDS forskning (CFAR) bevilja 5P 30 AI028697. Den UCLA integrerad molekylär teknik core stöddes av botemedel/P30 bevilja DK041301. Detta arbete fick också stöd av UCLA AIDS Institute.

Obs: Det är viktigt att observera att detta protokoll använder replikering-brist lentiviruses. Utföra viral hantering endast efter lämpliga lab säkerhetsutbildning. Bleka alla föremål och ytor som kommer i kontakt med levande virus i minst 10 min efter hantering. Använd en disponibel lab coat och ansikte/ögon skydd, liksom dubbla handskar, hela tiden. Utföra virus arbete i biosäkerhet nivå 2 + labs med viral certifiering. Ägna vävnadsodling huvor och inkubatorer till viral arbete.
<p cl...

<ol>
	<li>Miao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trends+of+long+noncoding+RNA+research+from+2007+to+2016:+a+bibliometric+analysis.">Trends of long noncoding RNA research from 2007 to 2016: a bibliometric analysis.</a> Oncotarget. 8 (47), 83114-83127 (2017).</li><li>Derrien, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+GENCODE+v7+catalog+of+human+long+noncoding+RNAs:+analysis+of+their+gene+structure,+evolution,+and+expression.">The GENCODE v7 catalog of human long noncoding RNAs: analysis of their gene structure, evolution, and expression.</a> Genome Research. 22 (9), 1775-1789 (2012).</li><li>Johnsson, P., Lipovich, L., Grander, D., Morris, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+conservation+of+long+non-coding+RNAs;+sequence,+structure,+function.">Evolutionary conservation of long non-coding RNAs; sequence, structure, function.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1840 (3), 1063-1071 (2014).</li><li>Perez-Pinera, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-guided+gene+activation+by+CRISPR-Cas9-based+transcription+factors.">RNA-guided gene activation by CRISPR-Cas9-based transcription factors.</a> Nature Methods. 10 (10), 973-976 (2013).</li><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity.">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li><li>Maeder, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+RNA-guided+activation+of+endogenous+human+genes.">CRISPR RNA-guided activation of endogenous human genes.</a> Nature Methods. 10 (10), 977-979 (2013).</li><li>Konermann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+transcriptional+activation+by+an+engineered+CRISPR-Cas9+complex.">Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex.</a> Nature. 517 (7536), 583-588 (2015).</li><li>Schmittgen, T. D., Livak, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+real-time+PCR+data+by+the+comparative+C(T)+method.">Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method.</a> Nature Protocols. 3 (6), 1101-1108 (2008).</li><li>Gomez, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NeST+long+ncRNA+controls+microbial+susceptibility+and+epigenetic+activation+of+the+interferon-gamma+locus.">The NeST long ncRNA controls microbial susceptibility and epigenetic activation of the interferon-gamma locus.</a> Cell. 152 (4), 743-754 (2013).</li><li>Padua, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+long+noncoding+RNA+signature+for+ulcerative+colitis+identifies+IFNG-AS1+as+an+enhancer+of+inflammation.">A long noncoding RNA signature for ulcerative colitis identifies IFNG-AS1 as an enhancer of inflammation.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 311 (3), G446-G457 (2016).</li><li>Collier, S. P., Henderson, M. A., Tossberg, J. T., Aune, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+Th1+genomic+locus+from+Ifng+through+Tmevpg1+by+T-bet.">Regulation of the Th1 genomic locus from Ifng through Tmevpg1 by T-bet.</a> Journal of Immunology. 193 (8), 3959-3965 (2014).</li><li>Kotake, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+non-coding+RNA+ANRIL+is+required+for+the+PRC2+recruitment+to+and+silencing+of+p15(INK4B)+tumor+suppressor+gene.">Long non-coding RNA ANRIL is required for the PRC2 recruitment to and silencing of p15(INK4B) tumor suppressor gene.</a> Oncogene. 30 (16), 1956-1962 (2011).</li><li>Gilbert, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Scale+CRISPR-Mediated+Control+of+Gene+Repression+and+Activation.">Genome-Scale CRISPR-Mediated Control of Gene Repression and Activation.</a> Cell. 159 (3), 647-661 (2014).</li><li>Cheng, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+activation+of+endogenous+genes+by+CRISPR-on,+an+RNA-guided+transcriptional+activator+system.">Multiplexed activation of endogenous genes by CRISPR-on, an RNA-guided transcriptional activator system.</a> Cell Research. 23 (10), 1163-1171 (2013).</li><li>Matouskova, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reference+genes+for+real-time+PCR+quantification+of+messenger+RNAs+and+microRNAs+in+mouse+model+of+obesity.">Reference genes for real-time PCR quantification of messenger RNAs and microRNAs in mouse model of obesity.</a> PLoS One. 9 (1), e86033 (2014).</li></ol>

Detta manuskript presenterar ett protokoll för att aktivera CRISPR överuttrycka lncRNAs in vitro. Detta är en särskilt viktig teknik när man studerar länge icke-kodande RNAs eftersom den transcriptomic produkten är den funktionella enheten. Efter överuttryck, kan forskaren sedan använda dessa celler att öka signal-brus-förhållandet när man studerar bindande partner och även mäta cellulära följderna av ökade nivåer av lncRNAs. Dessutom, eftersom lncRNAs ofta agerar på cis-gener, möjliggör denna endog...

Medan de flesta biomedicinsk forskning fokuserat på protein-kodning avskrifter, består majoriteten av transkriberas gener faktiskt av icke-kodande RNAs (häckning release 93). Aktuell forskning börjar utforska detta område, antalet publikationer på lncRNAs i sjukdomsprocesser som ökar exponentiellt mellan 2007 och 20171. Dessa publikationer visar att många lncRNAs är förknippade med sjukdomen. Molekylära mekanismer för dessa lncRNAs är dock svårt att studera på grund av deras olika funktioner jämfört med mRNA. Förvärrar problemet med att förstå rollen som lncRNAs vid sjukdom, uttrycks lncRNAs ofta på lägre nivåer än kodande RNAs2. Dessutom bevaras dåligt lncRNAs, vilket begränsar de funktionella studierna i mänskliga-cell-linjen-baserade tekniker3. En metod att studera mekanismen för dessa nya gener är att endogenously överuttrycka dem i odlade celler. Överuttryck studier kan ge viktig information om funktionen för specifika gener och möjliggöra forskare att dissekera viktiga molekylära vägar.
En ny metod för att aktivera transkriptionen av lncRNA gener är baserat på CRISPR tekniker utvecklades ursprungligen av Gersbach laboratorium4. Detta protokoll har anpassats för användning i lncRNA biologi och för uttrycket av dessa gener i andra modellsystem. I den CRISPR överuttryck av teknik, kan ett protein som kallas CRISPR-associerade protein 9 (Cas9) riktas mot en DNA-sekvens via en antisense gärna som känns igen av Cas9. Normalt, kommer Cas9 inducera DNA klyvning; dock inaktivera mutationer i Cas9, tidigare utvecklat för överuttryck teknik, detta steg5. När en transkriptionell aktivator smälts samman till en ”dead” Cas9 (dCas9) och sensorik i cellinjer, den endogena överuttryck av lncRNAs kan vara uppnådda4,6. Tillägg av ytterligare ändringar den gärna, möjliggör ytterligare transkriptionell faktorer att binda till gärna, ökade effekten av det dCas9 genen aktiveringssystemet 10-faldig7. Ännu viktigare, det visades att transkriptionell aktiveringen kräver närhet (< 200 bp) till den transkriptionell starta webbplatsen gener, aktivera en specifik uppreglering i gen-rika områdena7. Till skillnad från CRISPR knockout teknik behöver dCas9 och gärna kassetter integreras i genomet för celler att behålla ett överuttryck över flera generationer. En metod att uppnå detta är att använda lentiviruses för att integrera dCas9 och gärna innehållande - kassetter. Efter integration, kan lncRNA genuttrycket bestämmas.
I denna artikel, kommer ett protokoll för lncRNA överuttryck i Jurkat T-cell modell att demonstreras. Stegvisa instruktioner visas och kan också anpassas till vidhäftande celler.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:837px;" width="837">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:245px;">Ampicillin</td>
			<td style="width:195px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:195px;">BP1760-5</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">CaCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:195px;">C1016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">cDNA synthesis kit (iScript)</td>
			<td style="width:195px;">BioRad</td>
			<td>1708891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">dCas9 forward primer</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:195px;">n/a</td>
			<td>5&#39;-TCGCCACAGCATAAAGAAGA&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">dCas9 reverse primer</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:195px;">n/a</td>
			<td>5&#39;-CTTTTCATGGTACGCCACCT</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">dCas9 vector</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:195px;">50918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM</td>
			<td>Corning</td>
			<td style="width:195px;">10013CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Ethanol</td>
			<td style="width:195px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:195px;">61509-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FBS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">gRNA plasmid</td>
			<td>VectorBuilder</td>
			<td style="width:195px;">VB180119-1195qxv</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEK293T cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td style="width:195px;">&#160;CRL-1573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:195px;">H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HPRT1 forward primer</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:195px;">n/a</td>
			<td>GACCAGTCAACAGGGGACAT&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HPRT1 reverse primer</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:195px;">n/a</td>
			<td>GCTTGCGACCTTGACCATCT</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hygromycin B</td>
			<td>Corning</td>
			<td style="width:195px;">MT3024CR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Isopropanol</td>
			<td style="width:195px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:195px;">BP2618-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Jurkat cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td style="width:195px;">&#160;TIB-152</td>
			<td style="width:203px;">clone E6-1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-glutamine</td>
			<td>Corning</td>
			<td style="width:195px;">25005Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LB agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1425-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LB broth</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1426-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Maxi-prep kit (Plasmid Purification Kit)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td style="width:195px;">12362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Na2HPO4</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:195px;">NIST2186II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Optimem I reduced serum media&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:195px;">31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">p24 elisa</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td style="width:195px;">NEK050B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">PBS</td>
			<td style="width:195px;">Corning</td>
			<td style="width:195px;">21-040-CMR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin and Streptomycin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pMDG2.G</td>
			<td>Addgene &#160;</td>
			<td style="width:195px;">#12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pMDLg/pRRE</td>
			<td>Addgene&#160;</td>
			<td style="width:195px;">#60488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Poly-L-Lysine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:195px;">P-4832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Polybrene</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td style="width:195px;">TR-1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pRSV-REV</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:195px;">#12253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Puromycin dihydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:195px;">P8833</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNA purification kit (Aurum RNA mini)</td>
			<td style="width:195px;">BioRad</td>
			<td>7326820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Butyrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:195px;">B5887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SYBR green (iTaq universal)</td>
			<td style="width:195px;">BioRad</td>
			<td>1725122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:195px;">X100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

overexpressing long noncoding rnas using gene-activating crispr

Långa icke-kodande RNA (lncRNA) biologi är en ny och spännande forskningsfält, med antalet publikationer från fältet växer exponentiellt sedan 2007. Dessa studier har bekräftat att lncRNAs ändras i nästan alla sjukdomar. Studera de funktionella rollerna för lncRNAs i samband med sjukdomen förblir dock svårt på grund av avsaknaden av proteinprodukter, vävnad-specifika uttryck, låga nivåer, komplexiteten i splice former, och bristen på bevarande bland arter. Med tanke på de artspecifika uttrycket, är lncRNA studier ofta begränsade till mänskliga forskningssammanhang när man studerar sjukdomsprocesser. Eftersom lncRNAs fungerar på molekylär nivå, är ett sätt att dissekera lncRNA biologi att ta bort lncRNA eller överuttrycka lncRNA och mäta cellulära effekter. I den här artikeln presenteras ett skriftligt och visualiserade protokoll till överuttrycka lncRNAs in vitro. Som ett experiment med representativa visas ett lncRNA som är associerad med inflammatorisk tarmsjukdom, Interferon Gamma Antisense 1 (IFNG-AS1), för att i ökad utsträckning i Jurkat T-cell modell. För att åstadkomma detta, används aktiverande klustrade regelbundet mellanliggande kort palindromic repetitioner (CRISPR) tekniken för att aktivera överuttryck på de endogena genomisk loci. Aktiverande CRISPR tekniken riktar en uppsättning transkriptionsfaktorer till webbplatsen transkriptionell start av en gen, möjliggör en robust överuttryck av flera lncRNA splice formulär. Detta förfarande kommer att delas upp i tre steg, nämligen (i) guide RNA (gärna) design och vektorn konstruktion, (ii) virus generation och transduktion och (iii) kolonin screening för överuttryck. För detta representativa experiment, en större än 20-fold förbättring i IFNG-AS1 i Jurkat T-celler observerades.

En dubbel vector systemet till överuttrycka lncRNA IFNG-AS1 Exempel experimentet i detta manuskript är överuttryck av Jurkat T-cell modellsystem uttrycker lncRNA IFNG-AS19. IFNG-AS1 är ett lncRNA som är associerad med inflammatorisk tarmsjukdom, som har sett att reglera Interferon Gamma10. IFNG-AS1 genen innehåller tre skarv varianter som alla använder samma transkriptionell startwebbplats (fig...

Watch this Scientific Journal Video about Overexpressing Long Noncoding RNAs Using Gene-activating CRISPR at JoVE.com

Overexpressing Long Noncoding RNAs Using Gene-activating CRISPR

Traditionella cDNA-baserade överuttryck tekniker har en begränsad tillämplighet för överuttryck av långa icke-kodande RNAs på grund av deras flera splice formulär med potentiella funktionalitet. Denna översyn rapporterar ett protokoll som tekniken CRISPR till överuttrycka flera skarv varianter av en lång kodande RNA.

Överuttryck av långa icke-kodande RNAs med gen-aktiverande CRISPR

Long noncoding RNA (lncRNA) biology is a new and exciting field of research, with the number of publications from this field growing exponentially since ...

Icke-kodande RNAs har ofta flera isoformer. I studier av överuttryck in vitro är det ofta svårt att studera alla dessa uttryckta isoformer. Denna teknik gör det möjligt för användare att härleda uttryck direkt från genomet och göra det möjligt för cellerna att uttrycka de endogena isoformerna för ett visst icke-kodande RNA.Denna kraftfulla teknik gör det möjligt för användaren att specifikt styra uttrycket av någon gen i arvsmassan med trohet och noggrannhet. Genom att utforma guide RNAs till specifika gener, är man kunna använda endogena gen-splitsning maskiner för att uttrycka de naturliga isoformerna i en viss cell. Demonstrera förfarandet kommer att Robert Rankin, en post-doc från mitt laboratorium.För att utforma guide RNA-sekvensen som ligger inom 100 baspar från transkriptionsstartplatsen, använd genetiska databaser som BLAT för att se till att guide-RNA är unikt för den gen av intresse som är. Förvara guiden RNA och de avaktiverade Cas9-plasmiderna i fyra grader Celsius. Strimla ut E.coli på en Luria buljong agar platta med ampicillin och odla bakterierna över natten på 37 grader Celsius.Nästa dag, plocka en koloni och odla bakterier i fem milliliter LB med ampicillin över natten, kraftigt skakar röret i en 37-graders Celsius inkubator. Nästa dag, tillsätt två milliliter bakterier till 200 milliliter LB med ampicillin i en två-liters kolv, kraftigt skaka kolven över natten i en 37-graders Celsius inkubator. Snurra ner bakterierna på 3, 724 gånger g i 20 minuter och fortsätt till DNA-rening.För att skapa de dCas9-innehållande lentivirus, första päls 100-milliliter vävnad kultur rätter med fem milliliter av 0,01%Poly-L-Lysin och tallrik fem miljoner HEK293T celler per maträtt i 10 milliliter av kompletta Dulbecco's Modified Eagles Medium, sedan förbereda DNA-transfektionsprover genom att blanda 10 mikrogram av en LTR-innehållande guide-RNA-vektor eller en LTR-innehållande avaktiverad Cas9-vektor med plasmider som innehåller komponenter till virus. Tillsätt vatten till en total volym på 450 mikroliter och filtrera blandningen genom en 0,2-mikron filterspets som är fäst vid en spruta. Därefter lägger du till 50 mikroliter av 2,5-molar kalciumdiklorid till varje transfektionsprov av DNA och blanda försiktigt.Filtrera kalcium-DNA-blandningen genom en 0,2-mikron filterspets fäst på en spruta. Pipett 500 mikroliter av 2X HBS till ett fem-milliliter polystyrenrör. Tillsätt 500 mikroliter av kalcium-DNA-blandningen droppvis och försiktigt virvel.Inkubera i rumstemperatur i tre minuter. Tillsätt en milliliter av DNA-kalcium HBS suspension till varje HEK293T-innehållande vävnad kultur skålen och inkubera dem i en 5%koldioxid inkubator vid 37 grader Celsius över natten. På dag tre, långsamt bort och kasta media från disken.Tvätta försiktigt cellerna med PBS en gång. Tillsätt sex milliliter komplett DMEM kompletterat med 20-millimolar HEPES och 10-millimolar natrium butyrate. Sedan inkubera cellerna i en 5%koldioxid inkubator vid 37 grader Celsius i fem till sex timmar.Efter inkubationen, tvätta cellerna med PBS en gång och tillsätt fem milliliter komplett DMEM med 20-millimolar HEPES till HEK293T-cellerna. Inkubera cellerna i en 5%koldioxidinkubator vid 37 grader Celsius i 12 timmar. På dag fyra, samla IN HEK293T cellen supernatants och filtrera supernatanten som innehåller viruset.För att börja den virala partikel räknas, först späda tvättkoncentratet från P24 ELISA kit genom att lägga till 19 delar av destillerat, avjoniserat vatten. Späd sedan den positiva kontrollen från denna sats till 200 nanogram per milliliter med RPMI 1640 som spädningsvätska och gör utspädningar för en standardkurva i 1,5-milliliterrör enligt P24 ELISA-utspädningstabellen. För att mäta koncentrationen av viruset inom proverna tillsätt provutspädningarna till de utsedda brunnarna i en 96-brunnsplatta, med början från 1:1000 utspädning och modifiera volymen efter behov för att ligga inom standardkurvans område.Späd sedan proverna med Triton X-100 till en slutkoncentration på 0,5 %och tillsätt 200 mikroliter av varje prov och RPMI 1640 till de angivna brunnarna. Försegla plattan och inkubera den i 37 grader Celsius i två timmar. Tvätta plattan med 300 mikroliter per brunn av 1X tvättbuffert sex gånger.Ta bort överflödig vätska genom att vända på tallriken och knacka på den på en pappershandduk. Tillsätt sedan 100 mikroliter av detektorantikropp från satsen till alla brunnar utom substratet tomt. Försegla plattan och inkubera den i 37 grader Celsius i en timme.Tvätta plattan och ta sedan bort eventuell överflödig vätska genom att vända plattan och knacka på den på en pappershandduk. För att mäta detektorantikroppen, späd ut streptavidin pepparrotsperoxidasen vid 1:100 spädning med SA-HRP-spädningsmedel. Blanda den utspädda SA-HRP noggrant och tillsätt 100 mikroliter till alla brunnar utom blankt.Täta och inkubera plattan i rumstemperatur i 30 minuter. Därefter tvätta plattan med 1X tvättbuffert och knacka bort överflödig vätska. Släpp en orto-fenylenediamin tablett i 11 milliliter av substratet spädmedel för att göra tillräckligt substratlösning för en platta.Vortexa OPD-lösningen kraftigt för att lösa upp den helt och skydda den från ljus. Tillsätt 100 mikroliter av OPD substratlösning till alla brunnar inklusive blindprovet. Med hjälp av en spektrofotometer, läs absorbans vid 450 nanometer omedelbart.Upprepa 10 gånger med en sekunds intervall och ta den genomsnittliga mätningen. Resuspend och odla Jurkat T-celler i en T75 kolv med en densitet av en miljon celler i fem milliliter av den reducerade serum media med polybrene. Lägg sedan till HEK293T-betingade medier som innehåller en miljon dCas9-innehållande viruspartiklar.Inkubera cellerna vid 37 grader Celsius med 5%koldioxid. Tre dagar post-infektion, snurra ner cellerna på 233 tid g i fem minuter och åter uppsuspender dem i 10 milliliter av komplett DMEM kompletteras med puromycin. Odla cellerna i T75-kolvar och inkubera dem i 37 grader Celsius med 5 %koldioxid.Var tredje dag under en period på nio dagar, snurra ner cellerna på 233 gånger g i fem minuter och ersätta media med den kompletta DMEM kompletteras med puromycin. Räkna cellerna med hjälp av en hemocytometer eller en automatiserad cellräknare. Sedan, på en 96-väl platta med vävnad kultur-behandlad vävnad, tillsätt 10, 000 celler i 100 mikroliter av den kompletta DMEM kompletteras med puromycin i den första brunnen.Gör 1:1 serieutspädningar av innehållet i följande brunnar med den kompletta DMEM kompletteras med puromycin. Inkubera cellerna vid 37 grader Celsius med 5%koldioxid. Expandera klonala celler i två 24-brunnsplattor, sedan platta två miljoner celler per brunn av en sex-brunnsplatta för tre av klonerna.Platta de andra tre brunnarna med icke-transduced Jurkat celler som kontroller. Slutligen, platta cellerna i en T75 kolv och sätta cellerna i en cellkultur inkubator över natten. För att börja kvantitativa PCR för att mäta genuttryck, först syntetisera kompletterande DNA genom att lägga till ett mikrogram RNA, fyra mikroliter av cDNA syntesbuffert, och en mikroliter av omvänd transkriptas till 250 mikroliter rör, tillsätt sedan vatten till en slutlig volym av 20 mikroliter.Använd sedan en termisk cycler vid 42 grader Celsius i 30 minuter och vid 95 grader Celsius i fem minuter för att inaktivera den omvända transkriptasen. Späd cDNA med 60 mikroliter vatten efter syntesen. Kör polymeraskedjereaktioner för rör som innehåller 0,5 mikroliter av varje framåt och omvänd primer vid slutkoncentration av 10 mikromolar, fem mikroliter SYBR grön, och fyra mikroliter av cDNA.Välj slutligen Jurkat-dCas9 celler i DMEM kompletteras med Hygromycin B för 10 dagar. Snurra ner cellerna och byt media var tredje dag. Rena RNAse och fortsätt till RT-qPCR.I denna studie, gRNA sekvenser som var inom 10 till 100 bas par bort från transkriptional startplatsen användes för att styra Cas9-aktiverande komplex till transkriptional locus av IFNG-AS1, en lång noncoding RNA i samband med inflammatorisk tarmsjukdom. För att möjliggöra val av dubbla transduced celler, en två-plasmid system användes för att transduce antingen dCas9 eller gRNAse förstärkare i celler. Här förstärker MS2-proteiner överuttrycket av IFNG-AS1.Cas9 uttryck bekräftades för båda klonerna. Primers mot HPRT1 användes för att bekräfta förekomsten av RNA i de icke-transduced cellerna. mRNA uttryck bekräftades genom att utelämna den omvända transkriptas från cDNA reaktionen.Tre skarvvarianter av IFNG-AS1 kunde upptäckas med antingen avskriftsspecifika primeruppsättningar eller en primeruppsättning mot alla kända IFNG-AS1-avskrifter. Alla fluorescens kurvor var exponentiell med hushållning genen HPRT1 nå den exponentiell fas inom en halv cykel mellan kontroll och IFNG-AS1 gRNA-uttrycker celler. Primers mot alla kända IFNG-AS1-avskrifter var de mest detekterbara mellan experiment, med mätningar av 20-faldig ökning av IFNG-AS1-uttryck.Den tredje utskriften av IFNG-AS1 visade dock en fem till tiofaldig signifikant ökning av IFNG-AS1-nivåerna. För att aktivt överuttrycka din önskade gen är design av guideRNA i steg 2.1 avgörande för att protokollet ska lyckas. Dessutom kommer produktion av kvalitativa viruspartiklar att säkerställa ett robust uttryck för dina protokollkomponenter.När den önskade genen är överuttryckt kan man utföra funktionella studier för att undersöka genmekanismerna. I vårt exempel valde vi att titta på cytokinproduktion efter överuttryck av vår gen av intresse. Denna teknik utvecklades ursprungligen av Griesbach-gruppen 2013 och har i stort sett tillämpats och utvecklats av andra grupper.Vi var glada att tillämpa denna teknik på långa icke-kodade RNAs för att utforska deras specifika funktioner. Replikerings defekta lentivirus bör hanteras i ett laboratorium som har godkänts för virusarbete. Dessutom, mänskliga cellinjer och E.coli bakterier anses vara biorisk.Slutligen bör rekombinanta DNA-plasmider hanteras av utbildad personal.

Research

JoVE Journal

Genetics

Sequence-specific and Selective Recognition of Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs by Chemically Modified Peptide Nucleic Acids

Sekvens-specifika och selektiv erkännande av dubbelsträngat RNA över enkelsträngat RNA av kemiskt modifierade peptid nukleinsyror

RNAs are emerging as important biomarkers and therapeutic targets. Thus, there is great potential in developing chemical probes and therapeutic ligands ...

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-medierad riktade Integration In Vivo som använder en homologi-medierad slutet att gå-baserad strategi

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

Metabolic Labeling and Profiling of Transfer RNAs Using Macroarrays

Metaboliska märkning och profilering av överföring RNAs använder Macroarrays

Transfer RNAs (tRNA) are abundant short non-coding RNA species that are typically 76 to 90 nucleotides in length. tRNAs are directly responsible for ...

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

En snabb och lättköpt Pipeline för generera genomisk punkt mutanter i C. elegans med CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

The clustered regularly interspersed palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (Cas9) prokaryotic adaptive immune defense system has been ...

Dissection of Enhancer Function Using Multiplex CRISPR-based Enhancer Interference in Cell Lines

Dissektion av Enhancer-funktion som använder Multiplex CRISPR-baserade Enhancer störningar i cellinjer

Multiple enhancers often regulate a given gene, yet for most genes, it remains unclear which enhancers are necessary for gene expression, and how these ...

CRISPR Guide RNA Cloning for Mammalian Systems

CRISPR Guide RNA kloning av däggdjur system

The outlined protocol describes streamlined methods for the efficient and cost-effective generation of Cas9-associated guide RNAs. Two alternative ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

Endogen Protein taggning i mänskliga inducerade pluripotenta stamceller med CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas

Genomet redigering i däggdjur cellinjer med CRISPR-Cas

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) system functions naturally in bacterial adaptive immunity, but has been ...

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

Införa en gen knockout direkt i Amastigote skede av Trypanosoma cruzi med hjälp av CRISPR/Cas9 systemet

Trypanosoma cruzi is a pathogenic protozoan parasite that causes Chagas&#8217; disease mainly in Latin America. In order to identify a novel drug target ...