Name: overexpressing long noncoding rnas using gene-activating crispr
Uploaded: 2019-03-01T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Overexpressing Long Noncoding RNAs Using Gene-activating CRISPR at JoVE.com

C.P. RO1 DK60729 ve P30 DK 41301-26 tarafından desteklenir. D.P. bir Crohn & kolit Vakfı (CCFA) kariyer geliştirme Ödülü tarafından tedavi desteklenmektedir: sindirim hastalıkları Araştırma Merkezi (DDRC) DK41301 ve UCLA klinik ve çevirim Bilim Enstitüsü (CTSI) UL1TR0001881. UCLA Viroloji çekirdek Merkezi, AIDS Araştırma (CFAR tarafından) finanse edildi 5 P 30 AI028697 verin. UCLA entegre moleküler çekirdek tedavi/P30 tarafından desteklenen teknolojilerin DK041301 verin. Bu eser de UCLA AIDS Enstitüsü tarafından desteklenmiştir.

Not: Bu protokol çoğaltma-eksik lentiviruses kullandığını unutmamak gerekir. Uygun laboratuvar güvenlik eğitimi sonra viral işleme gerçekleştirin. Tüm öğeleri ve işleme sonra en az 10 dk canlı virüs temas yüzeyleri çamaşır suyu. Kullanım tek kullanımlık laboratuvar mont ve yüz/göz koruma yanı sıra çift eldiven, her zaman. Biyogüvenlik seviye 2 + laboratuarlar viral sertifika ile Virus görevi gerçekleştirin. Doku kültürü davlumbaz ve kuluçka viral çalışmaya adamak.<...

<ol>
	<li>Miao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trends+of+long+noncoding+RNA+research+from+2007+to+2016:+a+bibliometric+analysis.">Trends of long noncoding RNA research from 2007 to 2016: a bibliometric analysis.</a> Oncotarget. 8 (47), 83114-83127 (2017).</li><li>Derrien, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+GENCODE+v7+catalog+of+human+long+noncoding+RNAs:+analysis+of+their+gene+structure,+evolution,+and+expression.">The GENCODE v7 catalog of human long noncoding RNAs: analysis of their gene structure, evolution, and expression.</a> Genome Research. 22 (9), 1775-1789 (2012).</li><li>Johnsson, P., Lipovich, L., Grander, D., Morris, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+conservation+of+long+non-coding+RNAs;+sequence,+structure,+function.">Evolutionary conservation of long non-coding RNAs; sequence, structure, function.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1840 (3), 1063-1071 (2014).</li><li>Perez-Pinera, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-guided+gene+activation+by+CRISPR-Cas9-based+transcription+factors.">RNA-guided gene activation by CRISPR-Cas9-based transcription factors.</a> Nature Methods. 10 (10), 973-976 (2013).</li><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity.">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li><li>Maeder, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+RNA-guided+activation+of+endogenous+human+genes.">CRISPR RNA-guided activation of endogenous human genes.</a> Nature Methods. 10 (10), 977-979 (2013).</li><li>Konermann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+transcriptional+activation+by+an+engineered+CRISPR-Cas9+complex.">Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex.</a> Nature. 517 (7536), 583-588 (2015).</li><li>Schmittgen, T. D., Livak, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+real-time+PCR+data+by+the+comparative+C(T)+method.">Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method.</a> Nature Protocols. 3 (6), 1101-1108 (2008).</li><li>Gomez, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NeST+long+ncRNA+controls+microbial+susceptibility+and+epigenetic+activation+of+the+interferon-gamma+locus.">The NeST long ncRNA controls microbial susceptibility and epigenetic activation of the interferon-gamma locus.</a> Cell. 152 (4), 743-754 (2013).</li><li>Padua, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+long+noncoding+RNA+signature+for+ulcerative+colitis+identifies+IFNG-AS1+as+an+enhancer+of+inflammation.">A long noncoding RNA signature for ulcerative colitis identifies IFNG-AS1 as an enhancer of inflammation.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 311 (3), G446-G457 (2016).</li><li>Collier, S. P., Henderson, M. A., Tossberg, J. T., Aune, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+Th1+genomic+locus+from+Ifng+through+Tmevpg1+by+T-bet.">Regulation of the Th1 genomic locus from Ifng through Tmevpg1 by T-bet.</a> Journal of Immunology. 193 (8), 3959-3965 (2014).</li><li>Kotake, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+non-coding+RNA+ANRIL+is+required+for+the+PRC2+recruitment+to+and+silencing+of+p15(INK4B)+tumor+suppressor+gene.">Long non-coding RNA ANRIL is required for the PRC2 recruitment to and silencing of p15(INK4B) tumor suppressor gene.</a> Oncogene. 30 (16), 1956-1962 (2011).</li><li>Gilbert, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Scale+CRISPR-Mediated+Control+of+Gene+Repression+and+Activation.">Genome-Scale CRISPR-Mediated Control of Gene Repression and Activation.</a> Cell. 159 (3), 647-661 (2014).</li><li>Cheng, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+activation+of+endogenous+genes+by+CRISPR-on,+an+RNA-guided+transcriptional+activator+system.">Multiplexed activation of endogenous genes by CRISPR-on, an RNA-guided transcriptional activator system.</a> Cell Research. 23 (10), 1163-1171 (2013).</li><li>Matouskova, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reference+genes+for+real-time+PCR+quantification+of+messenger+RNAs+and+microRNAs+in+mouse+model+of+obesity.">Reference genes for real-time PCR quantification of messenger RNAs and microRNAs in mouse model of obesity.</a> PLoS One. 9 (1), e86033 (2014).</li></ol>

Bu el yazması CRISPR aktive lncRNAs tüp bebek overexpress kullanmak için bir protokol sunar. Transcriptomic ürün işlevsel birim olduğu gibi uzun kodlamayan RNA'ların okurken bu özellikle önemli bir tekniktir. Overexpression sonra araştırmacı, bu hücreler bağlama ortakları okurken sinyal-gürültü oranı artırmak ve bile lncRNAs, daha yüksek düzeyde hücresel sonuçlarını ölçmek için kullanabilirsiniz. Ayrıca, lncRNAs sık sık CIS-genler üzerinde hareket gibi bu endojen overexpression teknik e?...

En Biyomedikal Araştırma protein kodlayıcı transkript üzerinde odaklanmıştır iken, kopya etmek genler çoğunluğu aslında kodlamayan RNA'ların (Ensembl yayın 93) oluşur. Mevcut araştırma lncRNAs katlanarak 2007 2017 ve1arasında yükselen hastalığı süreçlerde yayın numarasıyla bu alanı keşfetmeye başlıyor. Bu yayınların birçok lncRNAs hastalığı ile ilişkili olduğunu gösterir. Ancak, bu lncRNAs moleküler mekanizmaları ile karşılaştırıldığında mRNA'ların farklı işlevleri nedeniyle çalışma zordur. LncRNAs hastalığında rolünün anlaşılması sorunu bileşik, lncRNAs çoğunlukla RNA'ların2kodlama daha alt seviyelerde ifade edilir. Ayrıca, lncRNAs kötü, hangi insan-cep-satır-tabanlı teknikleri3fonksiyonel çalışmalar sınırlar korunmuş. Roman bu genlerin mekanizması çalışmaya bir yöntem endogenously onları kültürlü hücrelerde overexpress sağlamaktır. Overexpression çalışmaları belirli genler işlevi hakkında önemli bilgileri sağlar ve araştırmacılar anahtar moleküler yolları incelemek için etkinleştirin.
LncRNA genlerin transkripsiyon etkinleştirmek için yeni bir yöntem başlangıçta Gersbach laboratuvar4tarafından geliştirilen CRISPR teknolojileri temel alır. Bu iletişim kuralı kullanmak üzere lncRNA Biyoloji ve diğer model sistemleri bu genlerin ifade için adapte edilmiştir. Teknik overexpressing CRISPR içinde CRISPR ilişkili protein 9 (Cas9) adı verilen bir protein DNA dizisi ile Cas9 tarafından tanınan bir antianlamlı gRNA doğru yönlendirilmiş olabilirsiniz. Normalde, Cas9 DNA bölünme neden; Ancak, daha önce için overexpression tekniği, gelişmiş değil Cas9, mutasyonların bu adım5devre dışı bırakın. Ne zaman bir transkripsiyon harekete geçirmek için bir "ölü" Cas9 erimiş (dCas9) ve hücre satır içine transduced, elde4,6lncRNAs endojen overexpression olabilir. GRNA için bağlamak ek transkripsiyon faktörleri etkinleştirme gRNA, ek değişiklikler ek dCas9 gen harekete geçirmek sistem etkinliği arttı 10 kat7. Önemlisi, yakın bir konumda istemek transkripsiyon harekete geçirmek gösterilmiştir (< 200 bp) transkripsiyon için site genler, belirli bir upregulation gen zengini alanları7etkinleştirme başlatın. CRISPR nakavt teknolojileri farklı olarak, dCas9 ve gRNA kaset hücreler bir overexpression birden fazla kuşaklara korumak için izin vermek için genom entegre edilecek gerek. Bunu başarmak için bir yöntem lentiviruses dCas9 ve gRNA içeren kaset tümleştirmek için kullanmaktır. Entegrasyon sonra lncRNA gen ekspresyonu belirlenebilir.
Bu makalede, lncRNA overexpression Jurkat T-hücre modeli için bir protokol gösterilecektir. Adım adım bir yordam gösterilir ve aynı zamanda yapisan hücrelerine adapte edilebilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:837px;" width="837">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:245px;">Ampicillin</td>
			<td style="width:195px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:195px;">BP1760-5</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">CaCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:195px;">C1016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">cDNA synthesis kit (iScript)</td>
			<td style="width:195px;">BioRad</td>
			<td>1708891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">dCas9 forward primer</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:195px;">n/a</td>
			<td>5&#39;-TCGCCACAGCATAAAGAAGA&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">dCas9 reverse primer</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:195px;">n/a</td>
			<td>5&#39;-CTTTTCATGGTACGCCACCT</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">dCas9 vector</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:195px;">50918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM</td>
			<td>Corning</td>
			<td style="width:195px;">10013CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Ethanol</td>
			<td style="width:195px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:195px;">61509-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FBS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">gRNA plasmid</td>
			<td>VectorBuilder</td>
			<td style="width:195px;">VB180119-1195qxv</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEK293T cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td style="width:195px;">&#160;CRL-1573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:195px;">H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HPRT1 forward primer</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:195px;">n/a</td>
			<td>GACCAGTCAACAGGGGACAT&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HPRT1 reverse primer</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:195px;">n/a</td>
			<td>GCTTGCGACCTTGACCATCT</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hygromycin B</td>
			<td>Corning</td>
			<td style="width:195px;">MT3024CR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Isopropanol</td>
			<td style="width:195px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:195px;">BP2618-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Jurkat cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td style="width:195px;">&#160;TIB-152</td>
			<td style="width:203px;">clone E6-1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-glutamine</td>
			<td>Corning</td>
			<td style="width:195px;">25005Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LB agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1425-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LB broth</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1426-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Maxi-prep kit (Plasmid Purification Kit)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td style="width:195px;">12362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Na2HPO4</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:195px;">NIST2186II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Optimem I reduced serum media&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:195px;">31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">p24 elisa</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td style="width:195px;">NEK050B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">PBS</td>
			<td style="width:195px;">Corning</td>
			<td style="width:195px;">21-040-CMR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin and Streptomycin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pMDG2.G</td>
			<td>Addgene &#160;</td>
			<td style="width:195px;">#12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pMDLg/pRRE</td>
			<td>Addgene&#160;</td>
			<td style="width:195px;">#60488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Poly-L-Lysine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:195px;">P-4832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Polybrene</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td style="width:195px;">TR-1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pRSV-REV</td>
			<td>Addgene</td>
			<td style="width:195px;">#12253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Puromycin dihydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:195px;">P8833</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNA purification kit (Aurum RNA mini)</td>
			<td style="width:195px;">BioRad</td>
			<td>7326820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Butyrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:195px;">B5887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SYBR green (iTaq universal)</td>
			<td style="width:195px;">BioRad</td>
			<td>1725122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:195px;">X100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

overexpressing long noncoding rnas using gene-activating crispr

Uzun kodlamayan RNA (lncRNA) Biyoloji Araştırma yayınları 2007 yılından bu yana katlanarak büyüyen bu alandan sayısı ile yeni ve heyecan verici bir alandır. Bu çalışmalar lncRNAs hemen hemen tüm hastalıklarda değişmiş doğruladı. Ancak, lncRNAs hastalığı bağlamında için işlevsel roller eğitim eksikliği protein ürünleri, doku özgü ifade, düşük ifade düzeyleri, splice formları karmaşıklığı ve türler arasında koruma eksikliği nedeniyle zor kalır. Species-specific ifade göz önüne alındığında, lncRNA çalışmalar genellikle hastalık süreçleri okurken insan araştırma bağlamları için kısıtlanır. LncRNAs moleküler düzeyde işlev beri lncRNA Biyoloji incelemek için bir yol lncRNA kaldırmak veya lncRNA ve ölçü hücresel etkileri overexpress etmektir. Bu makalede, lncRNAs tüp bebek overexpress için bir yazılı ve görüntülenmeyecektir protokol sunulmuştur. Temsil edici bir deney olarak, inflamatuvar barsak hastalığı, Interferon gama Antisens 1 (IFNG-AS1) ile ilişkili bir lncRNA bir Jurkat T-hücre modeli overexpressed gösterildi. Bunu yapmak için aktive kümelenmiş düzenli olarak interspaced kısa palindromik yineler (CRISPR) tekniği overexpression endojen genomik loci, etkinleştirmek için kullanılır. Aktive CRISPR tekniği transkripsiyon faktörleri lncRNA splice yükseltgen sağlam bir overexpression sağlayan bir gen transkripsiyon başlangıç siteye birtakım hedefler. Bu yordamı üç adım, yani (i) Kılavuzu RNA (gRNA) tasarım ve vektör inşaat, (ii) virüs üretimi ve iletimi ve (III) koloni tarama overexpression için içine bölünmüş. Temsilcisi bu deneme için bir IFNG-AS1 Jurkat T hücrelerinde 20-fold geliştirme gözlendi büyüktür.

LncRNA IFNG-AS1 overexpress için bir ikili vektör sistemi LncRNA IFNG-AS19ifade Jurkat T-hücre modeli sistemi overexpression bu el yazması olarak örnek deneydir. IFNG-AS1 Interferon gama10düzenleyen görülen iltihabi bağırsak hastalığı ile ilişkili bir lncRNA var. IFNG-AS1 gene aynı transkripsiyon başlangıç site (şekil 1A) hepimize üç ek yeri değişik içerir. Bu nedenle,...

Watch this Scientific Journal Video about Overexpressing Long Noncoding RNAs Using Gene-activating CRISPR at JoVE.com

Overexpressing Long Noncoding RNAs Using Gene-activating CRISPR

Geleneksel overexpression cDNA tabanlı teknikleri sınırlı uygulanabilirliği için potansiyel işlevselliği ile birden çok ek yeri formlarını nedeniyle uzun kodlamayan RNA'ların overexpression var. Bu inceleme birden çok ek yeri değişik-in uzun kodlamayan RNA overexpress için CRISPR teknolojisini kullanan bir iletişim kuralı bildirir.

Gene aktive CRISPR kullanarak uzun kodlamayan RNA'ların overexpressing

Long noncoding RNA (lncRNA) biology is a new and exciting field of research, with the number of publications from this field growing exponentially since ...

Kodlamayan RNA'larda genellikle birden çok isoform olur. In vitro aşırı ekspresyon çalışmalarında, tüm bu ifade edilmiş isoformları incelemek genellikle zordur. Bu teknik, kullanıcıların doğrudan genomdan ifade elde etmelerini ve hücrelerin kodlamayan belirli bir RNA için endojen İzoformları ifade etmelerini sağlar.Bu güçlü teknik, kullanıcının genomdaki herhangi bir genin ifadesini doğruluk ve doğrulukla özellikle yönlendirmesini sağlar. Belirli genlere kılavuz RNA'lar tasarlayarak, belirli bir hücredeki doğal isoformları ifade etmek için endojen gen birleştirme makinelerini kullanabilmek mümkündür. Prosedürü gösteren Robert Rankin, benim laboratuvarımdan bir post-doc olacaktır.Transkripsiyonel başlangıç sitesinin 100 baz çifti içinde yer alan kılavuz RNA dizisini tasarlamak için, kılavuz RNA'nın ilgi genine özgü olduğundan emin olmak için BLAT gibi genetik veritabanlarını kullanın. Kılavuz RNA'yı ve devre dışı bırakılmış Cas9 plazmidlerini dört santigrat derecede saklayın. Ampicillin ile luria suyu agar plaka üzerinde E.coli dışarı Çizgi ve 37 santigrat derece bir gecede bakteri büyümek.Ertesi gün, bir koloni seçin ve bir gecede ampisilin ile LB beş mililitre bakteri büyümek, şiddetle 37 derecelik santigrat kuvöz tüp sallayarak. Ertesi gün, iki litrelik bir şişe de ampisilin ile LB 200 mililitre bakteri iki mililitre ekleyin, şiddetle 37 derecelik santigrat kuvöz de bir gecede şişe sallayarak. Bakterileri 3, 724 kez 20 dakika boyunca aşağı doğru çevirin ve DNA arınmaya devam edin.dCas9 içeren lentivirüs oluşturmak için, ilk kat 100 mililitre doku kültürü yemekleri ile beş mililitre ile 0.01% Poli-L-L-Lizin ve plaka beş milyon HEK293T hücreleri çanak başına tam Dulbecco's Modifiye Eagles Orta 10 mililitre, sonra bir LTR içeren kılavuz RNA vektör veya bir LTR içeren Cas9 içeren vektör plasmids bileşenleri içeren bileşenleri içeren 10 mikrogram karıştırarak DNA transfeksiyon örnekleri hazırlamak. Toplam hacmi 450 mikrolitre ye su ekleyin ve karışımı şırıngaya bağlı 0,2 mikronluk bir filtre ucuyla filtreleyin. Daha sonra, DNA'nın her transfeksiyon örneğine 50 mikrolitre 2,5 molar kalsiyum diklorür ekleyin ve hafifçe karıştırın.Kalsiyum-DNA karışımını şırıngaya bağlı 0,2 mikronluk bir filtre ucuyla filtreleyin. Pipet 500 mikrolitre 2X HBS beş mililitre polistiren tüp içine. Kalsiyum-DNA karışımı damla ve yavaşça girdap 500 mikrolitre ekleyin.Üç dakika oda sıcaklığında kuluçkaya yat. Her HEK293T içeren doku kültürü çanak dna-kalsiyum HBS süspansiyon bir mililitre ekleyin ve bir gecede 37 derece santigrat derecede% 5 karbondioksit kuluçka onları kuluçka. Üçüncü gün, yavaşça kaldırın ve bulaşıklardan medya atın.Hücreleri pbs ile dikkatlice yıkayın. 20 milimolar HEPES ve 10 milimolar sodyum bütirat ile takviye tam DMEM altı mililitre ekleyin. Sonra hücreleri %5 karbondioksit kuvözde 37 derecede 5-6 saat kuluçkaya yatırın.Kuluçkadan sonra hücreleri bir kez PBS ile yıkayın ve HEK293T hücrelerine 20 milimolar HEPES ile beş mililitre tam DMEM ekleyin. Hücreleri %5 karbondioksit kuvözde 37 derecede 12 saat kuluçkaya yatırın. Dördüncü gün, HEK293T hücre supernatants toplamak ve virüs içeren supernatant filtre.Viral partikül sayılarına başlamak için, önce p24 ELISA kitinden yıkama konsantresini 19 parça distile, deiyonize su ekleyerek seyreltin. Daha sonra, seyreltici olarak RPMI 1640 kullanarak mililitre başına 200 nanogram bu kiti pozitif kontrol seyreltmek ve P24 ELISA seyreltme tablosuna göre 1.5 mililitrelik tüpler standart bir eğri için seyreltme yapmak. Numuneler içindeki virüsün konsantrasyonunun ölçülmesi için numune seyreltmelerini 1:1000'den başlayan 96 kuyuluk bir plakanın belirlenmiş kuyularına ekleyin ve standart eğrinin menzilinde olmak için hacmi gerektiği gibi değiştirin.Daha sonra triton X-100 ile numuneleri %0,5'lik son konsantrasyona seyreltin ve belirlenen kuyulara her numunenin 200 mikrolitresini ve RPMI 1640'ı ekleyin. Plakayı kapatın ve 37 derecede iki saat kuluçkaya yatırın. 1X yıkama tamponunun kuyubaşına 300 mikrolitre ile plakayı yıkayın.Plaka ters çevirerek ve bir kağıt havlu üzerine dokunarak herhangi bir fazla sıvı çıkarın. Daha sonra 100 mikrolitre dedektör antikor ekleyin kiti boş substrat hariç tüm kuyulara. Plakayı kapatın ve 37 derecede bir saat kuluçkaya yatırın.Plakayı yıkayın ve sonra plaka ters çevirerek ve bir kağıt havlu üzerine dokunarak herhangi bir fazla sıvı çıkarın. Dedektör antikor ölçmek için, SA-HRP seyreltici ile 1:100 seyreltme streptavidin horseradish peroksidaz seyreltmek. Seyreltilmiş SA-HRP iyice karıştırın ve boş hariç tüm kuyulara 100 mikrolitre ekleyin.30 dakika oda sıcaklığında plaka mühür ve kuluçka. Daha sonra, 1X yıkama tampon ile plaka yıkayın ve herhangi bir fazla sıvı uzak dokunun. Bir tabak için yeterli substrat çözeltisi yapmak için substrat diluent 11 mililitre bir orto-fenilenediamin tablet bırakın.Vortex OPD çözeltisi şiddetle tamamen eritmek ve ışıktan korumak için. Boş dahil olmak üzere tüm kuyulara 100 mikrolitre OPD substrat çözeltisi ekleyin. Spektrofotometre kullanarak, emmeyi hemen 450 nanometrede okuyun.Bir saniyelik aralıklarla 10 kez tekrarlayın ve ortalama ölçümü alın. Resuspend ve kültür Jurkat T-hücreleri polibren ile azaltılmış serum media beş mililitre bir milyon hücre yoğunluğu ile bir T75 şişesinde. Ardından, bir milyon dCas9 içeren viral partikül içeren HEK293T klimalı ortam ekleyin.Hücreleri %5 karbondioksitle 37 derecede kuluçkaya yatırın. Üç gün sonra enfeksiyon, beş dakika için 233 zaman g hücreleri aşağı spin ve tam DMEM 10 mililitre püromisin ile takviye onları yeniden askıya. Kültür T75 şişeleri hücreleri ve% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derece onları kuluçka.Dokuz günlük bir süre için her üç günde bir, hücreleri 233 kez g beş dakika boyunca aşağı spin ve puromisin ile takviye tam DMEM ile medya değiştirin. Hemositometre veya otomatik hücre sayacı kullanarak hücreleri sayın. Daha sonra, doku kültürü tedavi doku ile 96-iyi plaka üzerinde, ilk kuyuda püromisin ile desteklenen tam DMEM 100 mikrolitre 10.000 hücreleri ekleyin.Puromisin ile desteklenen tam DMEM ile aşağıdaki kuyuların içeriğinin 1:1 seri seyreltme olun. Hücreleri %5 karbondioksitle 37 derecede kuluçkaya yatırın. Klonal hücreleri iki 24 kuyuplakaya genişletin, sonra klonların üçü için altı kuyulu bir plakanın kuyusu başına iki milyon hücreyi kapatın.Kontrol olarak transeme olmayan Jurkat hücreleri ile diğer üç kuyu plaka. Son olarak, hücreleri bir T75 şişesine koyun ve hücreleri bir gece boyunca hücre kültürü kuluçka makinesine koyun. Gen ekspresyonunu ölçmek için kantitatif PCR'ye başlamak için, ilk olarak bir mikrogram RNA, dört mikrolitre cDNA sentez tamponu ve bir mikrolitre ters transkriptaz ile 250 mikrolitrelik son hacmine su ekleyerek tamamlayıcı DNA sentezleyin.Daha sonra, 42 santigrat derecede 30 dakika ve 95 santigrat derecede bir termal döngücünü kullanarak ters transkriptazı inaktive edin. Sentezden sonra 60 mikrolitre su ile cDNA seyreltin. 10 mikromolar, beş mikrolitre SYBR yeşili ve dört mikrolitre cDNA konsantrasyonunda her bir ileri ve ters astarın 0,5 mikrolitresini içeren tüpler için polimeraz zincir reaksiyonları çalıştırın.Son olarak 10 gün boyunca Hygromisin B ile desteklenen DMEM'deki Jurkat-dCas9 hücrelerini seçin. Hücreleri aşağı çevirin ve her üç günde bir ortamı değiştirin. RNAse'yi arındırın ve RT-qPCR'ye ilerleyin.Bu çalışmada, transkripsiyonel başlangıç sitesinden 10 ila 100 baz çifti uzaklıkta bulunan GRNA dizileri, cas9 aktive kompleksini inflamatuar barsak hastalığı ile ilişkili uzun bir kodlamayan RNA olan IFNG-AS1'in transkripsiyonel lokusuna yönlendirmek için kullanılmıştır. Çift transeksif hücrelerin seçimini sağlamak için, iki plazmid sistemi hücrelere dCas9 veya gRNAAse arttırıcıları nakletmek için kullanılmıştır. Burada MS2 proteinleri IFNG-AS1 aşırı ekspresyonu artırmak.Cas9 ifadesi her iki klon için de doğrulandı. HPRT1'e karşı astarlar, transeneden olmayan hücrelerde RNA varlığını doğrulamak için kullanıldı. mRNA ekspresyonu cDNA reaksiyonundan ters transkriptaz atlayarak doğrulandı.IFNG-AS1'in üç splice varyantı, transkripte özgü astar kümeleri veya bilinen tüm IFNG-AS1 transkriptlerine karşı bir astar seti ile tespit edilebilir. Tüm floresan eğrileri, kontrol ve IFNG-AS1 gRNA ifade eden hücreler arasında yarım döngü içinde üstel faza ulaşan HPRT1 temizlik geni HPRT1 ile üstel olarak elde edildi. Bilinen tüm IFNG-AS1 transkriptlerine karşı astarlar deneyler arasında en çok saptanabilen ler olup, IFNG-AS1 ekspresyonunda 20 kat artış lar yapıldı.Ancak IFNG-AS1'in üçüncü transkripti IFNG-AS1 düzeylerinde beş ila 10 kat anlamlı bir artış gösterdi. İstediğiniz geni aktif olarak aşırı eksprese etmek için, 2.1. Ayrıca, kaliteli viral parçacıkların üretimi protokol bileşenlerisağlam bir ifade sağlayacaktır.İstenilen gen aşırı eksprese edildikten sonra gen mekanizmalarını araştırmak için fonksiyonel çalışmalar yapılabilir. Örneğimizde, ilgi genimizin aşırı ekspresyonu sonrasında sitokin üretimine bakmayı seçtik. Bu teknik ilk olarak 2013 yılında Griesbach Grubu tarafından geliştirilmiş ve diğer gruplar tarafından geniş ölçüde uygulanmış ve ayrıntılı olarak geliştirilmiştir.Bu tekniği, belirli işlevlerini keşfetmek için uzun kodsuz RNA'lara uygulayacak ları için heyecanlıyorduk. Replikasyon kusurlu lentivirüsler viral çalışma için onaylanmış bir laboratuvarda ele alınmalıdır. Ayrıca, insan hücre hatları ve E.coli bakterileri biyolojik olarak tehlikeli olarak kabul edilir.Son olarak, rekombinant DNA plazmidleri eğitimli personel tarafından ele alınmalıdır.

Research

JoVE Journal

Genetics

Sequence-specific and Selective Recognition of Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs by Chemically Modified Peptide Nucleic Acids

Çift iplikçikli RNA'ların tek iplikçikli RNA'ların tarafından üzerinde fingerprinting ve seçici tanınması, kimyasal olarak peptit nükleik asitler modifiye

RNAs are emerging as important biomarkers and therapeutic targets. Thus, there is great potential in developing chemical probes and therapeutic ligands ...

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

Bir bitiş homoloji-aracılı katılmadan tabanlı strateji kullanarak hedeflenen Integration CRISPR/Cas9-aracılı Vivo içinde

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

Metabolic Labeling and Profiling of Transfer RNAs Using Macroarrays

Metabolik etiketleme ve Transfer RNA Macroarrays kullanarak profil oluşturma

Transfer RNAs (tRNA) are abundant short non-coding RNA species that are typically 76 to 90 nucleotides in length. tRNAs are directly responsible for ...

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

Bir hızlı ve genomik noktası mutantlar C. elegans kullanarak CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins üreten Facile boru hattı

The clustered regularly interspersed palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (Cas9) prokaryotic adaptive immune defense system has been ...

Dissection of Enhancer Function Using Multiplex CRISPR-based Enhancer Interference in Cell Lines

Diseksiyon artırıcı işlevi hücre hatlarında Multiplex artırıcı CRISPR tabanlı girişim kullanma

Multiple enhancers often regulate a given gene, yet for most genes, it remains unclear which enhancers are necessary for gene expression, and how these ...

CRISPR Guide RNA Cloning for Mammalian Systems

CRISPR Kılavuzu RNA memeli sistemler için klonlama

The outlined protocol describes streamlined methods for the efficient and cost-effective generation of Cas9-associated guide RNAs. Two alternative ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

Endojen Protein insan etiketleme Pluripotent kök hücre kullanarak CRISPR/Cas9 indüklenen

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas

Memeli hücre CRISPR-Cas kullanarak satırları genom düzenleme

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) system functions naturally in bacterial adaptive immunity, but has been ...

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

CRISPR/Cas9 sistemi kullanılarak Trypanosoma cruzi 'Nin Amastigote aşamasına doğrudan bir gene Knockout tanıtımı

Trypanosoma cruzi is a pathogenic protozoan parasite that causes Chagas&#8217; disease mainly in Latin America. In order to identify a novel drug target ...