Name: use of in vivo single-fiber recording and intact dorsal root ganglion with attached sciatic nerve to examine the mechanism of conduction failure
Uploaded: 2019-08-27T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of In Vivo Single-fiber Recording and Intact Dorsal Root Ganglion with Attached Sciatic Nerve to Examine the Mechanism of Conduction Failure at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado pelo financiamento da Fundação Nacional de ciências naturais da China (31671089 e 81470060) e Shaanxi Provincial de desenvolvimento social ciência e tecnologia projeto de pesquisa (2016SF-250).

O protocolo atual seguiu o guia para a política do serviço de saúde pública dos Estados Unidos sobre a assistência humanitária e o uso de animais de laboratório, e o Comitê de ética em experimentos com animais da quarta universidade militar de medicina aprovou o protocolo.
1. os animais
<ol><li>Divida 24 ratos Sprague-Dawley (4-8 semanas de idade) em dois grupos. Produzir o modelo adjuvante completo de Freund (CFA) por injeção intraplantar de 100 μL de CFA em um grupo de 14 ratos...

<ol>
	<li>Koski, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+and+validation+of+diagnostic+criteria+for+chronic+inflammatory+demyelinating+polyneuropathy.">Derivation and validation of diagnostic criteria for chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy.</a> Journal of the Neurological Sciences. 277 (1-2), 1-8 (2009).</li><li>Allen, T. J., Knight, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+intracellular+dialysis+to+study+signal+transduction+coupling+in+the+squid+giant+axon.">The use of intracellular dialysis to study signal transduction coupling in the squid giant axon.</a> Journal of Neuroscience Methods. 42 (3), 169-174 (1992).</li><li>Schafers, M., Cain, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-fiber+recording:+in+vivo+and+in+vitro+preparations.">Single-fiber recording: in vivo and in vitro preparations.</a> Methods in Molecular Medicine. 99, 155-166 (2004).</li><li>Sun, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+conduction+failure+of+the+main+axon+of+polymodal+nociceptive+C-fibres+contributes+to+painful+diabetic+neuropathy+in+rats.">Reduced conduction failure of the main axon of polymodal nociceptive C-fibres contributes to painful diabetic neuropathy in rats.</a> Brain. 135, 359-375 (2012).</li><li>Debanne, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Information+processing+in+the+axon.">Information processing in the axon.</a> Nature Reviews Neuroscience. 5 (4), 304-316 (2004).</li><li>De Col, R., Messlinger, K., Carr, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conduction+velocity+is+regulated+by+sodium+channel+inactivation+in+unmyelinated+axons+innervating+the+rat+cranial+meninges.">Conduction velocity is regulated by sodium channel inactivation in unmyelinated axons innervating the rat cranial meninges.</a> Journal of Physiology. 586 (4), 1089-1103 (2008).</li><li>Debanne, D., Campanac, E., Bialowas, A., Carlier, E., Alcaraz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon+physiology.">Axon physiology.</a> Physiological Reviews. 91 (2), 555-602 (2011).</li><li>Zhu, Z. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conduction+failures+in+rabbit+saphenous+nerve+unmyelinated+fibers.">Conduction failures in rabbit saphenous nerve unmyelinated fibers.</a> Neurosignals. 17 (3), 181-195 (2009).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+intrinsic+analgesic+mechanism:+the+enhancement+of+the+conduction+failure+along+polymodal+nociceptive+C-fibers.">A novel intrinsic analgesic mechanism: the enhancement of the conduction failure along polymodal nociceptive C-fibers.</a> Pain. 157 (10), 2235-2247 (2016).</li><li>Smith, T., Al Otaibi, M., Sathish, J., Djouhri, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+expression+of+HCN2+channel+protein+in+L4+dorsal+root+ganglion+neurons+following+axotomy+of+L5-+and+inflammation+of+L4-spinal+nerves+in+rats.">Increased expression of HCN2 channel protein in L4 dorsal root ganglion neurons following axotomy of L5- and inflammation of L4-spinal nerves in rats.</a> Neuroscience. 295, 90-102 (2015).</li><li>Zhang, X. L., Albers, K. M., Gold, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation-induced+increase+in+nicotinic+acetylcholine+receptor+current+in+cutaneous+nociceptive+DRG+neurons+from+the+adult+rat.">Inflammation-induced increase in nicotinic acetylcholine receptor current in cutaneous nociceptive DRG neurons from the adult rat.</a> Neuroscience. 284, 483-499 (2015).</li><li>Zhu, Z. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+action+potential+trains+in+rabbit+saphenous+nerve+unmyelinated+fibers.">Modulation of action potential trains in rabbit saphenous nerve unmyelinated fibers.</a> Neurosignals. 21 (3-4), 213-228 (2013).</li><li>Djouhri, L., Bleazard, L., Lawson, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+somatic+action+potential+shape+with+sensory+receptive+properties+in+guinea-pig+dorsal+root+ganglion+neurones.">Association of somatic action potential shape with sensory receptive properties in guinea-pig dorsal root ganglion neurones.</a> Journal of Physiology. 513, 857-872 (1998).</li><li>Fang, X., McMullan, S., Lawson, S. N., Djouhri, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+differences+between+nociceptive+and+non-nociceptive+dorsal+root+ganglion+neurones+in+the+rat+in+vivo.">Electrophysiological differences between nociceptive and non-nociceptive dorsal root ganglion neurones in the rat in vivo.</a> Journal of Physiology. 565, 927-943 (2005).</li><li>Young, G. T., Emery, E. C., Mooney, E. R., Tsantoulas, C., McNaughton, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+and+neuropathic+pain+are+rapidly+suppressed+by+peripheral+block+of+hyperpolarisation-activated+cyclic+nucleotide-gated+ion+channels.">Inflammatory and neuropathic pain are rapidly suppressed by peripheral block of hyperpolarisation-activated cyclic nucleotide-gated ion channels.</a> Pain. 155 (9), 1708-1719 (2014).</li><li>Kim, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupled+Activation+of+Primary+Sensory+Neurons+Contributes+to+Chronic+Pain.">Coupled Activation of Primary Sensory Neurons Contributes to Chronic Pain.</a> Neuron. 91 (5), 1085-1096 (2016).</li><li>Fan, N., Donnelly, D. F., LaMotte, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+compression+of+mouse+dorsal+root+ganglion+alters+voltage-gated+sodium+and+potassium+currents+in+medium-sized+dorsal+root+ganglion+neurons.">Chronic compression of mouse dorsal root ganglion alters voltage-gated sodium and potassium currents in medium-sized dorsal root ganglion neurons.</a> Journal of Neurophysiology. 106 (6), 3067-3072 (2011).</li><li>Ma, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Similar+electrophysiological+changes+in+axotomized+and+neighboring+intact+dorsal+root+ganglion+neurons.">Similar electrophysiological changes in axotomized and neighboring intact dorsal root ganglion neurons.</a> Journal of Neurophysiology. 89 (3), 1588-1602 (2003).</li><li>Boucher, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+analgesic+effects+of+GDNF+in+neuropathic+pain+states.">Potent analgesic effects of GDNF in neuropathic pain states.</a> Science. 290 (5489), 124-127 (2000).</li><li>Ma, C., Greenquist, K. W., Lamotte, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+mediators+enhance+the+excitability+of+chronically+compressed+dorsal+root+ganglion+neurons.">Inflammatory mediators enhance the excitability of chronically compressed dorsal root ganglion neurons.</a> Journal of Neurophysiology. 95 (4), 2098-2107 (2006).</li><li>Gong, K., Ohara, P. T., Jasmin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch+Clamp+Recordings+on+Intact+Dorsal+Root+Ganglia+from+Adult+Rats.">Patch Clamp Recordings on Intact Dorsal Root Ganglia from Adult Rats.</a> Journal of Visualized Experiments. (115), (2016).</li><li>Schoenen, J., Delree, P., Leprince, P., Moonen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotransmitter+phenotype+plasticity+in+cultured+dissociated+adult+rat+dorsal+root+ganglia:+an+immunocytochemical+study.">Neurotransmitter phenotype plasticity in cultured dissociated adult rat dorsal root ganglia: an immunocytochemical study.</a> Journal of Neuroscience Research. 22 (4), 473-487 (1989).</li><li>Zheng, J. H., Walters, E. T., Song, X. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissociation+of+dorsal+root+ganglion+neurons+induces+hyperexcitability+that+is+maintained+by+increased+responsiveness+to+cAMP+and+cGMP.">Dissociation of dorsal root ganglion neurons induces hyperexcitability that is maintained by increased responsiveness to cAMP and cGMP.</a> Journal of Neurophysiology. 97 (1), 15-25 (2007).</li><li>Hanani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Satellite+glial+cells:+more+than+just+rings+around+the+neuron.">Satellite glial cells: more than just rings around the neuron.</a> Neuron Glia Biology. 6 (1), 1-2 (2010).</li></ol>

Embora os estudos recentes alcangaram a imagem latente do cálcio de neurônios de DRG in vivo16, realizando a gravação in vivo da remendo-braçadeira dos nociceptores individuais de DRG permanecem extremamente desafiantes. Conseqüentemente, uma aproximação in vivo da único-fibra para o campo da dor é da importância de continuação. A gravação da único-fibra no protocolo atual permite a observação objetiva de fenômenos da falha da condução, e a combinação desta técnica com a pr...

A transmissão normal da informação ao longo das fibras nervosas garante a função normal do sistema nervoso. O funcionamento anormal do sistema nervoso também é refletido na transmissão do sinal elétrico de fibras nervosas. Por exemplo, o grau de desmielinização nas lesões de desmielinização central pode ser classificado através da comparação das alterações na velocidade de condução nervosa antes e após a aplicação da intervenção1. É difícil de registrar as fibras nervosas intracellularmente, exceto em preparações especiais, como o AXON gigante de Lula2. Portanto, a atividade eletrofisiológica só é gravável através do registro extracelular de fibras únicas. Como um dos métodos electrofisiológicos clássicos, a gravação da único-fibra tem uma história mais longa do que outras técnicas. No entanto, menos eletrofisiologistas agarrando este método apesar de sua extensa aplicação. Portanto, uma introdução detalhada do protocolo padrão para gravação de fibra única é necessária para sua aplicação apropriada.
Embora as várias técnicas da remendo-braçadeira dominem o estudo eletrofisiológicos moderno, a gravação da único-fibra ainda joga um papel insubstituível em registrar as atividades de fibras de nervo, especial fibras que transmitem a sensação periférica com seus corpo de células sensoriais localizado no gânglio da raiz dorsal (DRG). A vantagem de usar a gravação da único-fibra aqui é que a gravação in vivo da fibra fornece um tempo longo da observação com a capacidade para gravar respostas aos estímulos naturais em modelos pré-clínicos sem violação do ambiente intracelular3 , a 4.
Um número crescente de estudos nas duas últimas décadas examinou funções complexas ao longo das fibras nervosas5, e a falha de condução, que é definida como um estado de transmissão de impulso do nervo mal sucedido ao longo do axão, estava presente em muitos diferentes nervos periféricos6,7. A presença de falha de condução em nossa investigação serviu como mecanismo intrínseco de autoinibição para a modulação da entrada nociceptiva persistente ao longo das fibras C8. Esta falha da condução foi atenuada significativamente condições de hiperalgesia4,9. Portanto, direcionar os fatores envolvidos na falha de condução pode representar um novo tratamento para a dor neuropática. Para observar a falha de condução, o padrão de queima deve ser gravado e analisado com base em picos sequencialmente descarregados com base na gravação de fibra única.
Para compreender completamente o mecanismo da falha da condução, é necessário identificar as propriedades da transmissão do axônio, ou mais precisamente, as propriedades da membrana de neurônios de DRG, baseadas em suas propriedades anatômicas pseudounipolares. Muitos estudos prévios neste campo foram realizados em neurônios dissociados de DRG10,11, oque pode não ser viável para a investigação da falha de condução devido a dois obstáculos. Em primeiro lugar, vários métodos mecânicos e químicos são usados no processo de dissociação para libertar neurônios DRG, o que pode resultar em células não saudáveis ou alterar o fenótipo/propriedades dos neurônios e confundir os achados. Em segundo, os nervos periféricos anexados são removidos basicamente, e os fenômenos da falha da condução não são observáveis nestas preparações. Conseqüentemente, uma preparação de neurônios intactos de DRG com um nervo Unido foi melhorada para evitar os obstáculos acima mencionados.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:605px;" width="605">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:161px;">Instruments and software used in single fiber recording</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:161px;">Amplifier</td>
			<td style="width:148px;">Nihon kohden</td>
			<td style="width:93px;">MEZ-8201</td>
			<td style="width:203px;">Amplification of the electrophysiological signals</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:161px;">Bioelectric amplifier monitor</td>
			<td style="width:148px;">ShangHai JiaLong Teaching instrument factory</td>
			<td style="width:93px;">SZF-1</td>
			<td style="width:203px;">Monitor firing process via sound which is transformed from physiological discharge signal</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:161px;">Data acquisition and analysis system</td>
			<td style="width:148px;">CED</td>
			<td style="width:93px;">Spike-2</td>
			<td style="width:203px;">Software for data acquisition and analysis</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:161px;">Electrode manipulator</td>
			<td style="width:148px;">Narishige</td>
			<td style="width:93px;">SM-21</td>
			<td style="width:203px;">Contro the movement of the electrode as required</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:161px;">Hairspring tweezers</td>
			<td style="width:148px;">A.Dumont</td>
			<td style="width:93px;">5#</td>
			<td style="width:203px;">Separate the single fiber</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:161px;">Isolator</td>
			<td style="width:148px;">Nihon kohden</td>
			<td style="width:93px;">SS-220J</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="64" rowspan="2" style="height:64px;width:161px;">Memory oscilloscope</td>
			<td rowspan="2" style="width:148px;">Nihon kohden</td>
			<td rowspan="2" style="width:93px;">VC-9</td>
			<td style="width:203px;">Display recorded discharge during</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:203px;">experiment</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:161px;">Stereomicroscope</td>
			<td style="width:148px;">ZEISS</td>
			<td style="width:93px;">SV-11</td>
			<td style="width:203px;">Have clear observation when separate the local tissue and single fiber</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:161px;">Stimulator</td>
			<td style="width:148px;">Nihon kohden</td>
			<td style="width:93px;">SEZ-7203</td>
			<td style="width:203px;">Delivery of the electrical stimuli</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:161px;">Von Frey Hair</td>
			<td style="width:148px;">Stoelting accompany</td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:203px;">Delivery of the mechanical stimuli</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:161px;">Water bath</td>
			<td style="width:148px;">Scientz biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td style="width:93px;">SC-15</td>
			<td style="width:203px;">Heating paroline to maintain at 37oC</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:161px;">Instruments and software used in patch clamp recording</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:106px;width:161px;">Amplifier</td>
			<td style="width:148px;">Axon Instruments</td>
			<td style="width:93px;">Multiclamp 700B</td>
			<td style="width:203px;">Monitors the currents flowing through the recording electrode and also controls the stimuli by sending a signal to the electrode</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:161px;">Anti-vibration table</td>
			<td style="width:148px;">Optical Technology Co., Ltd.</td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:203px;">Isolates the recording system from vibrations induced by the environment</td>
		</tr>
		<tr height="127">
			<td height="127" style="height:127px;width:161px;">Camera</td>
			<td style="width:148px;">Olympus</td>
			<td style="width:93px;">TH4-200</td>
			<td style="width:203px;">See the neurons in bright field; the controlling software allows to take pictures and do live camera image to monitor the approach of the electrode to the cell</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:161px;">Clampex</td>
			<td style="width:148px;">Axon</td>
			<td style="width:93px;">Clampex 9.2</td>
			<td style="width:203px;">Software for data acquisition and delivery of stimuli</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:161px;">Clampfit</td>
			<td style="width:148px;">Axon</td>
			<td style="width:93px;">Clampfit 10.0</td>
			<td style="width:203px;">Software for data analysis</td>
		</tr>
		<tr height="66">
			<td height="66" style="height:66px;width:161px;">Electrode puller</td>
			<td style="width:148px;">Sutter</td>
			<td style="width:93px;">P-97</td>
			<td style="width:203px;">Prepare recording pipettes of about 2&#956;m diameter with resistance about 5 to 8 M&#937;</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:161px;">Glass pipette</td>
			<td style="width:148px;">Sutter</td>
			<td style="width:93px;">BF 150-75-10</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:161px;">Micromanipulator</td>
			<td style="width:148px;">Sutter</td>
			<td style="width:93px;">MP225</td>
			<td style="width:203px;">Give a precise control of the microelectrode</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:161px;">Microscope</td>
			<td style="width:148px;">Olympus</td>
			<td style="width:93px;">BX51WI</td>
			<td style="width:203px;">Upright microcope equipped with epifluorescence for clearly observe the cells which would be patched</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:161px;">Origin</td>
			<td style="width:148px;">Origin lab</td>
			<td style="width:93px;">Origin 8</td>
			<td style="width:203px;">Software for drawing picture</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:161px;">Perfusion Pump</td>
			<td style="width:148px;">BaoDing LanGe Co., Ltd.</td>
			<td style="width:93px;">BT100-1J</td>
			<td style="width:203px;">Perfusion of DRG in whole-cell patch clamp</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:161px;">Other instruments</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:161px;">Electronic balance</td>
			<td style="width:148px;">Sartorius</td>
			<td style="width:93px;">BS 124S</td>
			<td style="width:203px;">Weighing reagent</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:161px;">pH Modulator</td>
			<td style="width:148px;">Denver Instrument</td>
			<td style="width:93px;">UB7</td>
			<td style="width:203px;">Adjust pH to 7.4</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:161px;">Solutions/perfusion/chemicals</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:161px;">Calcium chloride</td>
			<td style="width:148px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:93px;">C5670</td>
			<td style="width:203px;">Extracellular solution</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:161px;">Chloralose</td>
			<td style="width:148px;">Shanghai Meryer Chemical Technology Co., Ltd.</td>
			<td style="width:93px;">M07752</td>
			<td style="width:203px;">Mixed solution for Anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:161px;">Collagenase</td>
			<td style="width:148px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:93px;">SLBQ1885V</td>
			<td style="width:203px;">Enzyme used for clearing the surface of DRG</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:161px;">D (+) Glucose</td>
			<td style="width:148px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:93px;">G7528</td>
			<td style="width:203px;">Extracellular solution</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:161px;">Liquid Paraffin</td>
			<td style="width:148px;">TianJin HongYan Reagent Co., Ltd.</td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:203px;">Maintain fiber wetting</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:161px;">Magnesium sulfate</td>
			<td style="width:148px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:93px;">M7506</td>
			<td style="width:203px;">Extracellular solution</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:161px;">Potassium chloride</td>
			<td style="width:148px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:93px;">P3911</td>
			<td style="width:203px;">Extracellular solution</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:161px;">Protease</td>
			<td style="width:148px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:93px;">62H0351</td>
			<td style="width:203px;">Enzyme used for clearing the surface of DRG</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:161px;">Sodium bicarbonate</td>
			<td style="width:148px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:93px;">S5671</td>
			<td style="width:203px;">Extracellular solution</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:161px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:148px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:93px;">S5886</td>
			<td style="width:203px;">Extracellular solution</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:161px;">Sodium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:148px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:93px;">S0751</td>
			<td style="width:203px;">Extracellular solution</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:161px;">Sucrose</td>
			<td style="width:148px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:93px;">S0389</td>
			<td style="width:203px;">Extracellular solution</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:161px;">Urethane</td>
			<td style="width:148px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:93px;">U2500</td>
			<td style="width:203px;">Mixed solution for Anesthesia</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of in vivo single-fiber recording and intact dorsal root ganglion with attached sciatic nerve to examine the mechanism of conduction failure

A gravação da único-fibra foi uma técnica eletrofisiológicos clássica e eficaz sobre as últimas décadas por causa de sua aplicação específica para fibras de nervo nos sistemas nervosos centrais e periféricos. Este método é particularmente aplicável aos gânglios da raiz dorsal (DRG), que são neurônios sensoriais primários que exibem uma estrutura pseudounipolar de processos nervosos. Os padrões e características dos potenciais de ação passados ao longo de axônios são graváveis nesses neurônios. O presente estudo utiliza gravações in vivo de fibra única para observar a falha de condução dos nervos ciáticos em ratos tratados com adjuvante completo de Freund (CFA). Porque o mecanismo subjacente não pode ser estudado usando gravações in vivo da único-fibra, remendo-grampo-gravações de neurônios de DRG são executados em preparações de DRG intact com o nervo ciático Unido. Estas gravações revelam uma correlação positiva entre a falha da condução e a inclinação de aumentação do potencial After-hyperpolarization (AHP) de neurônios de DRG em animais CFA-tratados. O protocolo para gravações in vivo de fibra única permite a classificação das fibras nervosas através da mensuração da velocidade de condução e monitorização das condições anormais nas fibras nervosas em determinadas doenças. DRG intact com nervo periférico Unido permite a observação da atividade de neurônios de DRG em a maioria de circunstâncias physiological. Conclusivamente, a gravação de fibra única combinada com a gravação eletrofisiológica de DRGs intactos é um método eficaz para examinar o papel da falha de condução durante o processo analgésico.

O resultado do protocolo de gravação de fibra única depende da qualidade da dissecção da fibra. O animal para experimentos in vivo deve estar em uma boa situação para manter o tronco nervoso saudável para fácil dissecção (ver conselhos na seção de discussão). Um banho da aplicação da droga é necessário em muitos casos para a entrega da droga em fibras. A Figura 1 ilustra como o registro de fibra única in vivo foi operado (Figura 1a) e apresenta uma gravaç...

Watch this Scientific Journal Video about Use of In Vivo Single-fiber Recording and Intact Dorsal Root Ganglion with Attached Sciatic Nerve to Examine the Mechanism of Conduction Failure at JoVE.com

Use of In Vivo Single-fiber Recording and Intact Dorsal Root Ganglion with Attached Sciatic Nerve to Examine the Mechanism of Conduction Failure

A gravação da único-fibra é uma técnica eletrofisiológicos eficaz que seja aplicável aos sistemas nervosos centrais e periféricos. Junto com a preparação de DRG intact com o nervo ciático Unido, o mecanismo da falha da condução é examinado. Ambos os protocolos melhoram a compreensão da relação do sistema nervoso periférico com a dor.

Uso da gravação in vivo da único-fibra e do gânglio dorsal intacto da raiz com nervo sciatic Unido para examinar o mecanismo da falha da condução

Single-fiber recording has been a classical and effective electrophysiological technique over the last few decades because of its specific application for ...

A gravação de fibra única desempenha um papel importante no registro das atividades das fibras nervosas. Especialmente atividades que transmitem sensação periférica de campos receptivos a neurônios em gânglio raiz dorsal. Em ondas de gravação de fibras, fornece tempo de duração com capacidade para registrar respostas aos estímulos da natureza, e posteriormente foi perturbação do ambiente intercelular.Em uma única gravação de fibra requer neutron automático bom para a situação. O terapeuta chama a exigência para a elaboração de testes drg integrados o nervo ciático está integrado. O resultado da situação demo mostra quase todos os detalhes dos nervos em bom estágio de decalque físico.E terceiro, toda a preparação do DRG, como estão integrados. Para iniciar este procedimento, prepare e desinfete todos os instrumentos cirúrgicos antes da cirurgia. Em seguida, prepare de um a dois litros da solução extracelular normal do Ringer e armazene a quatro graus Celsius até usar.Para expor o tronco do nervo ciático para gravação, primeiro, abra a pele e os músculos do rato anestesiado na parte dorsal da coxa. Em seguida, realize uma dissecção contundente ao longo dos bíceps femorais. Isole cuidadosamente o tronco do nervo ciático usando uma tesoura oftálmica e uma agulha de separação de vidro, e mantenha o tecido úmido usando a solução de Ringer.Em seguida, fixe o animal em um aro de metal caseiro costurando a pele na fenda ao seu redor. Puxe a pele ligeiramente para cima para estabelecer um banho de fluido. Exponha um centímetro de tronco de nervo ciático no lado proximal.Coloque uma pequena plataforma marrom sob o tronco nervoso para melhorar o contraste, a fim de observar claramente o tronco nervoso fino. Posteriormente, aplique alguma parafina líquida quente na parte superior do tronco nervoso para evitar a secagem da superfície da fibra. Remova o fluido se houver uma exsução ao redor do tronco nervoso.Para realizar a gravação, selecione o filamento de platina como o eletrodo de gravação. Coma e crie um pequeno gancho no final. Depois, conecte o eletrodo a um micromanipulador.No banho, coloque um eletrodo de referência ao lado do tecido subcutâneo. Divida a dura espinhal e a pia mater e obtenha o nervo ciático. Sob um microscópio estéreo a 25% de ampliação, pegue um fascículo fino e suspenda a extremidade aproximada do axônio no gancho do eletrodo de gravação.Identifique o campo receptivo de uma única fibra c nãoconceptiva usando um simulis mecânico e estímulo térmico. Se o disparo da fibra nervosa responder aos estímulos mecânicos e à água quente, então considere-a como uma fibra c polimoto, nãoconceptiva. Em seguida, insira dois eletrodos de estímulo de agulha com um intervalo de dois milímetros na pele do campo de identificação para a entrega dos estímulos elétricos.Exiba a forma de onda de um potencial de ação no osciloscópio e empregue um computador com uma taxa de amostragem de sinal de 20 kilohertz. Em seguida, registo os picos usando software de aquisição de dados e analisá-los posteriormente com software profissional. Para medir a falha de condução, entregue os estímulos eletrodos repetitivos em diferentes frequências a uma fibra c por 60 segundos.Permita um intervalo de 10 minutos para que a fibra relaxe entre os estímulos. Em seguida, calcule a razão do número de falhas ao número de pulsos de estímulo repetitivo entregues e multiplique em 100% para obter o grau de falha de condução. Para expor o gânglio raiz dorsal, primeiro corte a pele da linha média da parte de trás no segmento l4 para l5.Em seguida, remova o processo de boro vertebral e processo transversal da coluna vertebral usando um rongeur ósseo, e exponha o corpo NDRG da medula espinhal. Cubra a medula espinhal exposta, NDRG, com algodão encharcado com a solução extracelular normal de Ringer para manter a atividade neural. Pare o sangramento e remova o sangue conforme necessário.Posteriormente, utilizando uma tesoura oftálmica, remova a estrutura óssea l4 a s1 acima do foie vertebral, a fim de expor o DRG e o nervo espinhal conectado. Faça um corte na pele para expor o nervo ciático na coxa média. Separe e desconecte o nervo ciático da extremidade distal do nervo onde ele vai para dentro do músculo.E ligadurar o tronco nervoso com linha cirúrgica na extremidade do nervo antes de cortar. Em seguida, separe o nervo ciático do tecido conjuntivo subjacente levantando o ponto de ligadura nervosa. Remova para dura da medula espinhal, e separe o DRG do tecido conjuntivo subjacente até atingir a parte adjacente do nervo ciático.Assim, isole toda a preparação do DRG com um nervo ciático ligado. Para limpar a superfície do DRG, a 4x de ampliação, remova cuidadosamente a dura espinhal na superfície de L4 a L6 DRG usando pinças. Coloque o DRG com nervo ciático ligado em um tubo de vidro contendo um mililitro de enzimas mistas.Digerir em um banho de água Celsius de 37 graus por 15 minutos. Após 15 minutos, levante a extremidade da linha cirúrgica e mova a preparação para um prato cheio de solução extracelular normal de Ringer para lavar a enzima. Em seguida, transfira o DRG digerido para um recipiente cheio de solução extracelular de Ringer oxigenada para gravação.Para realizar a gravação, prepare a solução intracelular e armazene-a a zero grau Celsius até o uso. Usando uma âncora de fatia, estabilize o gânglio e conecte a extremidade nervosa a um eletrodo estimulante de sucção. Na ampliação de 40x, visualize e selecione um neurônio DRG com um objetivo de emersão de água.Dobre um eletrodo e encha-o com solução intracelular. Coloque o eletrodo no suporte e aplique pressão positiva na tubulação com uma resistência final de quatro a sete megaohms. Em seguida, traga o eletrodo para a superfície celular.Em seguida, aplique pressão negativa na tubulação para formar uma vedação. Uma vez que uma vedação gigaohm é atingida, ajuste o potencial da membrana em cerca de menos 60 milvolts e estabeleça todo o modo de gravação celular. Posteriormente, entregue estímulos repetitivos de 5 a 50 hertz ao nervo ciático através do eletrodo de sucção para testar a falha de condução.Meça a amplitude de AHP da linha de base ao pico e a duração de 80% AHP. Esta figura mostra as gravações consecutivas originais de re-disparos de c5 único de ratos em resposta a 10 hertz estimulação elétrica. Cada vigésimo varredura é mostrada e exibida de cima para baixo.A inserção mostra um potencial de ação representativa. Aqui estão as gravações de fibras c únicas de ratos injetados CFA em resposta à mesma estimulação do painel anterior. Esta figura mostra as gravações contínuas de respostas de disparo em série a cinco estímulos hertz sob condições de controle, ou administração de diferentes concentrações de ZD7288 em um neurônio DRG de pequeno diâmetro de ratos classificados cfa.Os insets mostram traços expandidos para os períodos de gravação especificados. Manchas escuras representam falhas de pico. A AHP mostrou uma inclinação maior no controle.Enquanto uma inclinação de elevação menor foi observada após 125 micromolars na aplicação ZD7288. Quando uma única gravação de cinco anos, eu acho que é importante cortar a fibra vai manter os animais é bom qualquer condição de segurança. E microambiente ao redor do nêutron.A combinação de gravação única de fibras e aplicação de DRG intacto ligado ao nervo ciático, melhorou nossa compreensão do sistema nervoso periférico relativo à dor.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Neuroscience

Unit 1

Channels and the Electrical Properties of Membranes

SCIENTISTS IN ACTION

Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons

Estudo genético da regeneração do axônio com cultivadas Adulto neurônios do gânglio da raiz dorsal

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability ...

Neurociência

Measuring Spinal Presynaptic Inhibition in Mice By Dorsal Root Potential Recording In Vivo

Measuring Spinal Presynaptic Inhibition in Mice By Dorsal Root Potential Recording In Vivo

Medindo Spinal pré-sináptica Inibição em Ratos por raiz dorsal Gravação Potencial<em&gt; In Vivo</em

Presynaptic inhibition is one of the most powerful inhibitory mechanisms in the spinal cord. The underlying physiological mechanism is a depolarization of ...

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

In Vitro Modelagem de Cancerous Neural Invasion: o gânglio Modelo de raiz dorsal

One way that solid tumors disseminate is through neural invasion. This route is well-known in cancers of the head and neck, prostate, and pancreas. These ...

An Approach to Enhance Alignment and Myelination of Dorsal Root Ganglion Neurons

Uma abordagem para reforçar Alinhamento e mielinização do gânglio de raiz dorsal neurônios

Axon regeneration is a chaotic process due largely to unorganized axon alignment. Therefore, in order for a sufficient number of regenerated axons to ...

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

Em Gene Vivo Transferência de células de Schwann no nervo ciático de roedores por Eletroporação

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous ...

Dorsal Root Ganglion Injection and Dorsal Root Crush Injury as a Model for Sensory Axon Regeneration

Dorsal Root Injection gânglio da raiz dorsal e lesão por esmagamento como um modelo para Sensorial Axon Regeneração

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each ...

Laminotomy for Lumbar Dorsal Root Ganglion Access and Injection in Swine

Laminotomy para acesso de gânglio lombar Dorsal raiz e injeção em suínos

Dorsal root ganglia (DRG) are anatomically well defined structures that contain all primary sensory neurons below the head. This fact makes DRG attractive ...

Analysis of Immune Cells in Single Sciatic Nerves and Dorsal Root Ganglion from a Single Mouse Using Flow Cytometry

Análise de células do sistema imunológico em único nervos ciático e gânglio da raiz Dorsal de um único rato usando citometria de fluxo

Nerve-resident immune cells in the peripheral nervous system (PNS) are essential to maintaining neuronal integrity in a healthy nerve. The immune cells of ...

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Investigação regeneração do axônio mamíferos: In Vivo Electroporation do gânglio de raiz Dorsal do rato adulto

Electroporation is an essential non-viral gene transfection approach to introduce DNA plasmids or small RNA molecules into cells. A sensory neuron in the ...

Rapid Isolation of Dorsal Root Ganglion Macrophages

Isolação rápida de macrófagos dorsal do gânglio da raiz

There are growing interests to study the molecular and cellular interactions among immune cells and sensory neurons in the dorsal root ganglia after ...