Name: in vivo application of the remote-control system for the manipulation of endogenous gene expression
Uploaded: 2019-03-29T14:00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In vivo Application of the REMOTE-control System for the Manipulation of Endogenous Gene Expression at JoVE.com

ونحن نشكر الراحل الدكتور هايدي سكرابل لها هدية سخية لبناء الجينات ﻻسي الثدييات (كلينك، روتشستر، مينيسوتا)، الدكتور دانيال لوفارد (معهد كوري، باريس، فرنسا) لتوفير المروج بيلين، والدكتور لوري جاكسون-جروسبي (مستشفى للأطفال، بوسطن، ماجستير) لاسهاماتها في المراحل المبكرة من هذا التطور التكنولوجي. ونحن ممتنون للدكتورة نانسي وو، والدكتور روبرت ماكسسون لمساعدتها في توليد الفئران المحورة وراثيا والضربة القاضية. ونشكر أعضاء المختبر ليرد لإجراء مناقشات مفيدة ودعم. وأيد هذا العمل "المعاهد الوطنية للصحة" [R01 CA75090 R01 DA030325، R01 CA157918 و R01 CA212374 إلى P.W.L. و 1F31CA213897-01A1 إلى N.A.V.S].

PWL عضو في المجالس الاستشارية العلمية أنتشوردكس وبروجينيتي، وشركة

الخطوة الحاسمة، والقيد المحتملة من نظام التحكم هو التحدي المرتبطة بالإدراج قامع و/أو مواقع ربط المنشط دون التأثير على الجينات المستهدفة. لدينا نهج القمع الأصلي، كما هو مطبق على الجينات Dnmt1 ، تشارك إدراج مواقع الربط قامع لاك داخل المناطق الحرجة ترانسكريبتيونالي من مروج. من أجل الحد من المخاطر التي تؤثر على وظيفة المروج ومن ثم تحسين التطبيق العام لنظام التحكم عن بعد، وقمنا بتطوير نهج القائم على إنترون قمع. فاعلية نظامنا المحسن لاك سمح لنا بأحكام قمع النسخ جميع المروجين القوى اختبرنا في مشغلي الموقع مئات إلى عدة كيلوبس المصب من النسخ بدء تشغيل مواقع (الشكل 3أ – ج) 10-الأهم من ذلك، كانت مستويات القمع مستقلة من مواطن قوة النسخي المروجين (الشكل 3أ – ج)10. وهذا يوحي بأن يتجاوز قدرة نظامنا على أساس إنترون القمع القمع القوام النسخي المروجين اختبارها. في هذا النهج القائم على إنترون، فمن المرجح أن القمع هو يتوسط من خلال التدخل المادي بين عنصرين واستطالة النسخ إليه و ريبريسورس في أمريكا اللاتينية والكاريبي57. هذه الآلية البسيطة القمع وأظهرت متانة الأسلوب القائم على إنترون، قد تجعل هذا النهج المطبقة عموما على جينات مختلفة، والأنسجة، والكائنات الحية.
أوبريجوليشن بنظام التحكم عن بعد يتطلب تسلسل الملزمة ترانساكتيفاتور لتكون على مقربة من المروج الجينات المستهدفة، التي تنطوي على خطر التأثير على وظيفة المروج. ومع ذلك، وجدنا أن موقف ملزم تسلسل يمكن أن تكون خارج المنطقة الحرجة ترانسكريبتيونالي. وكانت المروجين Dnmt1 و EF1α قوة upregulated من مشغلي تيت تقع بضع مئات القواعد المنبع ل مواقع بدء النسخ10. هذا القيد استرخاء يقلل كثيرا من فرصة التأثير على مروج وظيفة الجينات المستهدفة في غياب ترانساكتيفاتور. زيادة عدد ربط تسلسل و/أو استخدام ترانساكتيفاتورس أقوى يمكن أن يساعد على زيادة خفض الخطر عن طريق تمكين upregulation من مواقع بعيداً عن موقع بدء النسخ.
لدينا نظام التحكم عن بعد يوفر تحكم أنيقة مستوى وتوقيت وموقع التعبير الجيني الذاتية، مما يسمح لاختبار إمكانية الرجوع من النمط الظاهري والمترتبة على مستويات مختلفة من التعبير، التي لا يسهل تحقيقها الحالي في تكنولوجيات التحكم تعبير الجينات فيفو. من المهم ملاحظة أن قيم التعبير في معظم التحليلات التعبير الجيني، بما في ذلك بلدنا، يمثل متوسط عدد سكان خلايا بينها تباين كبير ويمكن الاطلاع على. قد يؤثر هذا التغاير الخلوية عمليات صنع القرار، مثل التفريق أو المبرمج58. على الرغم من أن يمكن المحتمل أن زيادة تحسين الدقة في التعبير الجيني التحكم بالدائرة الوراثية الإضافية هندسة59، لوحظت فاعلية نظامنا الحالي سيسمح التحقيق مفيدة لوظيفة الجينات في العديد من السياقات البيولوجية. وبالإضافة إلى ذلك، من المتوقع بدرجة عالية من الدقة المستهدفة بسبب تعقيد تسلسل عامل، فضلا عن المسافة تطورية كبيرة بين الثدييات والأنواع الأصلية من المكونات التنظيمية60. وعلاوة على ذلك، يمكن وضع خطوط الماوس المعدلة وراثيا ريبريسورس والمنشطات وتوظيفهم لأي الجينات الذاتية. على سبيل المثال، يمكن تكييفها مع نماذج الماوس ترانساكتيفاتور تيت الحالية لإنجاز upregulation الجينات المستهدفة في أنسجة الماوس المطلوب. ونحن مؤخرا بوضع خط المعدلة وراثيا التي يمكن أن تدفع قوي الأنسجة على حدة التعبير عن قامع لاك تعزيز جهودنا في العديد من أنواع الأنسجة عندما جنبا إلى جنب مع الخطوط العرقية القائمة بإدخال الجين لاسيجي في محور Hipp11 48 الخاضعة لسيطرة عنصر لوكس-توقف-لوكس (غير منشور). هذا الخط سيسهل إلى حد كبير تطبيق نظام التحكم عن بعد الخاصة بالانسجة.
أوبريجوليشن الجينات بنظام التحكم عن بعد يوفر العديد من المزايا مقارنة بالنهج الحالية المعدلة وراثيا إيندوسيبلي. أنها لا تتطلب جيل من عدة أسطر المحورة وراثيا لاختبار تأثيرات الموقف من الإدراج، كما أنه يستخدم محور الذاتية. بالإضافة إلى ذلك، هذا النهج مناسبة تماما ل upregulation جينات مع التعبير الأساس القوى لأنه يعزز التعبير من مروج الفعل قوية، بينما النماذج المعدلة وراثيا التقليدية تعتمد على الحد الأدنى من المروجين الفيروسية. وأخيراً، الأنسجة خصوصية ومراقبة دورة الخلية، وذو المتغيرات الجينات المستهدفة قد يكون الاحتفاظ عند upregulation من نهجنا، كما أنه يحافظ على عناصر التنظيم الطبيعي مثل الفطرية رابطة الدول المستقلة-العناصر التنظيمية. ظهور كريسبر/Cas-بوساطة تكنولوجيا الجينات استهداف سيسهل تطبيق هذه التكنولوجيا في نظم نموذجية متنوعة.

خروج المغلوب الوراثية أو النهج المعدلة وراثيا كانت وسيلة فعالة لدراسة وظيفة الجينات في نماذج حيوانية. ومع ذلك، تنظيم التعبير بهذه النهج التفرع (تشغيل/إيقاف)، غير الزمان، وبالتالي غير قادر على الكشف عن الطيف الكامل من الجينات الوظيفية. الشرطي Cre/لترأوكسب تكنولوجيات أتاحت المنظمة الزمانية أو تنشيط وظيفة الجينات، ولكن طبيعتها التفرع لا تزال تشكل القيود، مثل هلاك الخلية وعدم الرجعة1،2 , 3-من أجل ملء هذا الفراغ، وضعت نهوج ضربة قاضية الشرطي استخدام تيت-ينظم شرنا أو ميرنا4. بيد أن آثار خارج الهدف يظل مصدر قلق بالنسبة [رني]5 وقد تم الطعن في التحكم في الحية. في الآونة الأخيرة، قد قدم نهجاً أكثر تنوعاً لتحقيق كل من أعلى-و downregulation التعبير الجيني الذاتية كريسبر/Cas-بوساطة النسخي لمراقبة تكنولوجيات وأثبتت تلك المرافق6،7 . ولكن فعالية مراقبة النسخي كريسبر/Cas-بوساطة من غير الواضح حتى الآن في فيفو، وتظل إمكانية الرجوع للقمع على أساس KRAB أن ينظر إليها، كما قوي القمع من جانب KRAB وقد ثبت البروتين التفاعل KAP1 لحمل الدائمة الجينات إسكات8،9.
بغية معالجة أوجه القصور هذه، قمنا بتطوير نظام تنظيمي النسخي رواية قادرة على السيطرة على شروط التعبير الجيني الذاتية في عكسها وطريقة الانضباطي في الفئران باستخدام هندسة النسخي بدائية ثنائي 10من اللوائح التنظيمية. بدائية الأنظمة التنظيمية النسخي ثنائي مع يغاندس التنظيمية، مثل أمريكا اللاتينية والكاريبي و تيت، وقد مكنت هذه عكسها والانضباطي التعبير التحكم11،،من1213، 14. ومع ذلك، أعاق فاعلية القمع عدم كفاية النظم الثنائية الحالية على اعتماد واسع النطاق للتحكم في التعبير الجيني الذاتية في الثدييات. ونحن وضعت نظام قمع لاك المحسن قوية بما فيه الكفاية لقمع الجينات الذاتية وتوظيف استراتيجية رواية استهداف تيت المنشط النسخي مباشرة إلى مروج المشابهة الجينات الذاتية لتحقيق 10من أوبريجوليشن قوية (الشكل 1). مع هذه التكنولوجيا، فقد حققنا تقريبا اثنين من حيث الحجم تحكم تعبير الجينات Dnmt1 الذاتية في طريقة الانضباطي، وإيندوسيبلي، وعكسها10. هنا يمكننا توفير إرشادات خطوة بخطوة لتطبيق المجراة في الجينات والكائنات باستخدام الفئران كأحد أنواع نموذجية الأخرى.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59235/59235fig1.jpg"> الشكل 1 : نظرة عامة على نظام التحكم عن بعد- يمكن أن تنظم النسخ من الجينات المستهدفة الذاتية استخدام قامع هندسيا أمريكا اللاتينية والكاريبي ونظم تيت المنشط. المروج الجينات المستهدفة أو إنترون هو إجراء هندسة عكسية لاحتواء المشغلين قامع لاسيجي ضيق الملزمة و/أو rtالمنشط تا-M2. R يشير إلى ريبرون (Repريثيون عنترعلى)، التي تحتوي على 12 لاك متماثل العوامل (S) بالإضافة إلى إنترون بيتا جلوبين أرنب جزئي. T تشير إلى المشغل تيت . قامع و/أو المنشط ويتم التعبير عنها من مروج الأنسجة على حدة. التعبير عن الجينات المستهدفة يمكن ثم عكسية ضبطها إلى المستوى المطلوب من التعبير بإدارة إيبتج (الأيزوبروبيل β-د-1-ثيوجالاكتوبيرانوسيدي، خصم من قامع لاسيجي) أو الدوكسيسيكلين (دوكس). وقد تم تعديل هذا الرقم من لي et al.10<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59235/59235fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
قبل البدء بهذا البروتوكول، استعراض الجدول 1 تحديد الخطوات ذات الصلة لعنصر التحكم المطلوب من التعبير الجيني. على سبيل المثال، لمهندس ماوس تمكن downregulation عكسها للجينات "X"، أكمل المقاطع 1 و 3 و 4 من دون البروتوكول. ويلخص الجدول 1 أيضا المكونات اللازمة لنظام التحكم عن بعد.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>تغيير التعبير المطلوب</td>
			<td>القمع فقط</td>
			<td>التنشيط فقط</td>
			<td>القمع والتنشيط</td>
		</tr>
<tr>
<td>الفروع ذات الصلة من البروتوكول</td>
			<td>1، 3-4</td>
			<td>2-4</td>
			<td>1-4</td>
		</tr>
<tr>
<td>تسلسل التحكم في الجينات المستهدفة</td>
			<td>ريبرون ("إنترون القمع"؛ 12 لاك متماثل مشغلي زائد إنترون بيتا جلوبين أرنب جزئي)</td>
			<td>منقولة تيت</td>
			<td>منقولة ريبرون وتيت</td>
		</tr>
<tr>
<td>موقع تسلسل التحكم عن بعد</td>
			<td>إنترون</td>
			<td>مروج</td>
			<td>إنترون & المروج</td>
		</tr>
<tr>
<td>المنشط/قامع اللازمة لعنصر التحكم المطلوب</td>
			<td>قامع لاسيجي</td>
			<td>منشط رتا-M2</td>
			<td>لاسيجي قامع والمنشط رتا-M2</td>
		</tr>
<tr>
<td>يغاندس التنظيمية</td>
			<td>إيبتج</td>
			<td>الدوكسيسيكلين</td>
			<td>إيبتج و/أو الدوكسيسيكلين</td>
		</tr>
</tbody></table>الجدول 1: نظرة عامة على مكونات جهاز التحكم عن بعد.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:715px;" width="715">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">B6C3F1/J</td>
			<td style="width:149px;">The Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:183px;">100010</td>
			<td style="width:167px;">https://www.jax.org/strain/100010</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cas9 Protein</td>
			<td style="width:149px;">PNA Bio</td>
			<td style="width:183px;">CP04</td>
			<td>http://www.pnabio.com/products/CRISPR_Cas9.htm?gclid=EAIaIQobChMIsoG8pLL33QIVBr7ACh0naQ4dEAAYAiAAEgKyHvD_BwE</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CRISPOR</td>
			<td>Haeussler et al. 2016</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td>http://crispor.tefor.net/</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Doxycycline-Containing Mouse Diet</td>
			<td style="width:149px;">Envigo</td>
			<td style="width:183px;">Varies by concentration</td>
			<td>https://www.envigo.com/products-services/teklad/laboratory-animal-diets/custom-research/doxycycline-diets/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ENCODE Database</td>
			<td style="width:149px;">Stanford University</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td>https://www.encodeproject.org/</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">iCre mRNA synthesis plasmid (pBBI)</td>
			<td style="width:149px;">Addgene</td>
			<td>65795</td>
			<td>https://www.addgene.org/65795/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">IPTG</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td style="width:183px;">I2481C</td>
			<td>https://www.goldbio.com/search?isSearch=Y&#38;q=iptg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">pGL3-Basic</td>
			<td style="width:149px;">Promega</td>
			<td style="width:183px;">E1751</td>
			<td>https://www.promega.com/products/reporter-assays-and-transfection/reporter-vectors-and-cell-lines/pgl3-luciferase-reporter-vectors/?catNum=E1751</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">SVM-BPfinder</td>
			<td style="width:149px;">Regulatory Genomics, Pompeu Fabra University</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td>http://regulatorygenomics.upf.edu/Software/SVM_BP/</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">TiProD: Tissue specific promoter Database</td>
			<td style="width:149px;">Department of Bioinformatics, UMG,&#160;University of G&#246;ttingen&#160;</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td>http://tiprod.bioinf.med.uni-goettingen.de</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">UCSC Genome Browser</td>
			<td style="width:149px;">University of California Santa Cruz</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td>https://genome.ucsc.edu/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo application of the remote-control system for the manipulation of endogenous gene expression

هنا يمكننا وصف بروتوكول لتنفيذ نظام التحكم عن بعد (إعادةفيرسيبلي مأنيبوليشن سو تيرانسكريبشن في هندوجينوس المكاني)، الذي يسمح للسيطرة على التعبير عكسها والانضباطي نموذج الجينات الذاتية للاهتمام بالمعيشة النظم. نظام التحكم عن بعد تستخدم أنظمة التنشيط القمع و تيت المحسن لاك تحقيقا لأسفل أو upregulation من الجينات المستهدفة داخل نظام بيولوجي واحد. القمع ضيق يمكن أن يتحقق من قامع ملزم مواقع مرونة يقع المصب من موقع بدء النسخ عن طريق تثبيط استطالة النسخ. أوبريجولاتيون قوية لا يمكن تحقيقه بتعزيز النسخ من الجينات الذاتية باستهداف تيت المنشط النسخي للمروج المشابهة. ويمكن تطبيق عنصر التحكم هذا التعبير عكسها والانضباطي وسحبت مرارا وتكرارا في الكائنات الحية. بفاعلية وبراعة للنظام، كما هو موضح للذاتية Dnmt1 هنا، سوف تسمح أدق التحليلات الفنية المجراة في تمكين تحقيق وظيفة الجينات التعبير على مختلف المستويات والتجارب إمكانية الرجوع من النمط الظاهري.

قد تجلى قدرة القمع لنظام التحكم في نهجين مختلفين حتى الآن. في النهج الأول، أدرجت مواقع الربط قامع في أمريكا اللاتينية والكاريبي في مروج الجين Dnmt1 الذاتية. وفي النهج الثاني، الذي يوصي بهذا البروتوكول، تم إدراج مواقع الربط قامع في إنترون المتلقين للمعلومات لتجنب المخاطر المحتملة لتؤثر على وظيفة المروج بالإدراج ومن ثم تبسيط تطبيق جهاز التحكم عن بعد- النظام. كلا النهجين أدى نجاح القمع (الشكل 2أ وب ، و الشكل 3 ألف-ج)10. وكان قمع التعبير Dnmt1 إلى 15 في المائة المستويات غير المنظم باستخدام النهج القائم على مروج (الشكل 2أ). وانعكس هذا القمع ضيق بطريقة تعتمد على الجرعة بعلاج الفئران بكميات متفاوتة من إيبتج (الشكل 2أ). على مستوى البروتين يقرها إيمونوستينينج (الشكل 2ب) القمع Dnmt1 الملاحظة. ونحن لم يلاحظ أي اختلاف ملحوظ في التعبير Dnmt1 بين Dnmt1+ + والفئران Dnmt1LO/لو ، مما يؤكد أن لدينا الإدراج المشغل في أمريكا اللاتينية والكاريبي قد لم تنقطع المروج الطبيعية 10من الدالة. على النهج القائم على إنترون حققت أكثر من القمع 90% من مشغلي الموقع كيلوبس عدة مجرى النهر في موقع بدء النسخ بتخفيف النسخ استطالة (الشكل 3أ وب)10. كذلك تم التحقق من صحة هذا النهج القائم على إنترون على سبع قوي إضافية المروجين (الشكل 3ج). وقد تحقق القمع دائماً ضيقة من كل من المروجين اختبار. ولوحظ أي ارتباط بين مستويات التعبير المتبقية ومواطن القوة للمروجين، مما يوحي بأن يتجاوز قدرة نظامنا على أساس إنترون القمع القمع النسخي فاعلية كل من المروجين قوية اختبرنا ( الشكل 3 ج).
كما تجلى قدرة upregulation المجراة في نظام التحكم في الجينات Dnmt1 . قمنا بعرض نسختين من المشغل تيت في مروج Dnmt1 ، جنبا إلى جنب مع أمريكا اللاتينية والكاريبي المشغل متواليات، للسماح لأوبريجوليشن أو downregulation تبعاً للمستجيب فيها البروتين موجود. أوبريجوليشن قوية و downregulation التعبير Dnmt1 ، ما يقرب من اثنين للحجم (10% إلى 650%)، وقد تحققت في بتوليدا التي تحتوي على اليل Dnmt1 الذاتية المعدلة (Dnmt1LGT) (الشكل 4أ)10 . كل الأنظمة كانت عكسها تماما وإيندوسيبلي بالعلاجات إيبتج ودوكس، على التوالي (الشكل 4أ). القادم ادخلنا التعديل Dnmt1LGT في germline الماوس اختبار قدرة upregulation المجراة في نظام التحكم عن بعد. لوحظ upregulation قوية من Dnmt1 من الكبد، والطحال، والكلى، بينما لا يمكن كشفها upregulation في القلب لوحظ (الشكل 4ب)7. وقد تكمن وراء نمط التعبير دورة الخلية تعتمد على Dnmt1 وندرة الخلايا التكاثري في القلب هذه الملاحظة10،56. فإنه يبقى أن نرى ما إذا كان يمكن التغلب على هذا القيد عن طريق زيادة مستوى التعبير المنشط أو العدد من مواقع الربط.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59235/59235fig2.jpg"> الشكل 2 : في فيفو القمع Dnmt1 قامع لاسيجي- الفئران (A) مع شركات أمريكا اللاتينية والكاريبي (لو) إدراجها في مروج Dnmt1 ، مع أو بدون التعبير عن لاسيجي، كانت تعالج بجرعات مختلفة من إيبتج. يبين تحليل qRT PCR التعبير Dnmt1 عكس تعتمد على جرعة Dnmt1 القمع المجراة في المعاملة إيبتج. يمثل كل شريط بيانات من ماوس مختلفة. وتمثل البيانات يعني ± ووزارة شؤون المرأة (n = 3). (ب) إيمونوستينينج Dnmt1 البروتين في أقبية colonic الفئران وفرت مياه الشرب مع أو بدون 160 مم إيبتج لمدة 3 أسابيع. وقد تم تعديل هذا الرقم من لي et al.10<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59235/59235fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59235/59235fig3.jpg"> الشكل 3 : في فيفو والقمع في المختبر لمروجي مختلف بنظام التحكم عن بعد. (أ) إصدار مبكر من تسلسل ريبرون (R *) تم إدراجه في إنترون اتجاه مجرى النهر من المروج بيلين في ماوس المعدلة وراثيا بيلين-mKate2 (VilmKate2). ويبين تحليل PCR قرت التعبير mKate2 في الأمعاء الدقيقة من الفئران مع أو بدون قامع لاسيجي . يمثل كل شريط بيانات من ماوس مختلفة. (ب) الصور mKate2 [كنفوكل] من الأمعاء الدقيقة مع أو بدون لاسيجي التعبير. (ج) ستة متعهدين متماثل أمريكا اللاتينية والكاريبي (S) أدرجت بين مروجي مختلف وهو مراسل لوسيفراس. وأدخلت في المعاهد الوطنية للصحة/3T3 الخلايا بنسبة 1:1 ضرس عابر الصحفيين (50 نانوغرام/أيضا في لوحة 96-جيدا) وقامع والبلازميدات. وكانت القيم لوسيفراس ح 24 المقررة بعد تعداء. وهذه وتمثل البيانات في المختبر في المئة من التعبير لوسيفراس في لاسيجي-الإعراب عن الخلايا بالنسبة للذين يعبرون عن غير وظيفية ﻻسي (نفلاسي). واستخدمت تي-اختبارات لتحديد دلالة إحصائية. وتمثل البيانات يعني ± ووزارة شؤون المرأة (n = 3). P ≤ 0.05، * *P ≤ 0.01. وقد تم تعديل هذا الرقم من لي et al.10<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59235/59235fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59235/59235fig4.jpg"> الشكل 4 : أسفل-و/أو upregulation من التعبير Dnmt1 في المختبر والمجراه في. (أ) تم تصميم نظام التحكم الكامل في بتوليدا المستزرعة باستهداف الجين والنهوج انهانسر. وقد تحقق القمع القصوى للتعبير Dnmt1 مع عدم المعالجة بينما تحقق تفعيل قصوى بالعلاج إيبتج ودوكس. وتمثل البيانات يعني ± ووزارة شؤون المرأة (n = 3). P ≤ 0.05، * *P ≤ 0.01 (وولش تي-الاختبارات). (ب) المجراة في تفعيل Dnmt1 بنظام التحكم عن بعد، كما تجلى immunostaining Dnmt1 البروتين في أنسجة مختلفة من الفئران جهاز التحكم عن بعد. اليل LGT يمثل تعديل مروج Dnmt1 تحتوي على مواقع الربط المنشط المشغل و تيت أمريكا اللاتينية والكاريبي . وعولج الفئران مع اتباع نظام غذائي عادي أو المحتوية على دوكس (5000 ملغ/كغ هيكلاتي الدوكسيسيكلين) لمدة شهر واحد. وقد تم تعديل هذا الرقم من لي et al.10<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59235/59235fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Supplementary Figure 1" src="/files/ftp_upload/59235/59235supfig1.jpg"> التكميلية رقم 1 : مثال للهبوط لوحة الإدخال إلى مورين إنترون Dnmt1 1- (أ) التخطيطي لقالب الحمض النووي لهبوط الإدراج لوح، مقتبس من ذلك et al. (2015)31. مواقع الغيروية لوكسب ، JT15، و Lox2272، مفصولة بواسطة فاصلة قصيرة تسلسل (sp) وتساندها 60-بي بي للحمض النووي الذي مثلى للمنطقة المستهدفة الجينوم على كل جانب. (ب) عينة الحمض النووي قالب للهبوط لوحة الإدخال إلى إنترون Dnmt1 باستخدام سجرنا التالية: كتاجتاككاكتككتجتاككج (الذي يستهدف حبلا العكسية). المنطقة المحددة إينترونيك بيوينفورماتيكالي أبلغ من الخطوة 1، 1، وحددت سجرنا استخدام كريسبور29. (ج) مثال على بكر التصميم التمهيدي لتقييم إدراج منصة الهبوط. صممت [بكر] كبسولة تفجير خارج الأسلحة التماثل من القالب للتأكد من إدماج الذاتية Dnmt1. أمبليكون بكر wildtype هو 213 bp؛ عند الإدراج، يصبح 291 هناك <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59235/59235supfig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>

Watch this Scientific Journal Video about In vivo Application of the REMOTE-control System for the Manipulation of Endogenous Gene Expression at JoVE.com

In vivo Application of the REMOTE-control System for the Manipulation of Endogenous Gene Expression

في تطبيق نظام التحكم عن بعد "التلاعب بالتعبير الجيني الذاتية" فيفو

هذا البروتوكول يحدد الخطوات اللازمة لإنشاء نظام نموذجي الذي النسخ من الجينات الذاتية لمصلحة يمكن التحكم في شروط في الحيوانات الحية أو الخلايا باستخدام قامع المحسن أمريكا اللاتينية والكاريبي و/أو نظم المنشط تيت .

Here we describe a protocol for implementing the REMOTE-control system (Reversible Manipulation of Transcription at Endogenous loci), which allows for ...

أهمية طريقتنا هي تعدد الاستخدامات والفعالية. وهو يسمح للباحثين بالسيطرة القوية على التعبير الجيني الداخلي بطرق كانت صعبة لتحقيق استخدام الأساليب القائمة. وهو يسمح للباحثين بالتحقيق في وظيفة الجين على مستويات التعبير المختلفة وبطريقة ملعقة زمنية.وبالتالي فإنه يسمح لاختبار عكس النمط الظاهري، وهو أمر مفيد عند دراسة الجينات المتعلقة بالمرض. لإنجاز القمع، تم تصميم الجين المستهدف intron لاحتواء repron R، الذي يحتوي على 12 مشغلي لاك متماثل. عندما يتم التعبير عن مكبوت LacIGY من المروج الأنسجة المطلوبة محددة، يتم قمع الجين الهدف.يمكن عكس قمع الجين المستهدف أو تعديله إلى مستوى التعبير المطلوب من خلال إدارة IPTG ، وهو خصم من مكاغ LacIGY. لإنجاز رفع التنظيم، تم تصميم المروج الجيني الهدف لاحتواء أربعة أو أكثر من مشغلي تات، T، كمواقع ملزمة لـ rtTA-M2 المنشطات. عندما يتم التعبير عن المنشط من المروج الأنسجة المطلوبة في وجود doxycycline, يتم حث الجين الهدف.يمكن عكس أو تعديل التراكم للجين المستهدف إلى مستوى التعبير المرغوب عن طريق سحب أو تغيير تركيز الداكسيسيكلين. لإنجاز كل من القمع والتنشيط، يمكن الجمع بين أنظمة لاكبوتور وتات المنشط. لتعديل الجين من الفائدة للقمع، intron خامل النسخ نحو نهاية خمسة رئيس من الجين من الفائدة ينبغي تحديد لإدراج تسلسل repron.للحصول على التسلسل الجينومي للجينة ذات الاهتمام، انتقل إلى متصفح الجينوم UCSC وحدد أحدث مسودة لجينوم الماوس تحت علامة التبويب الجينوم. أدخل اسم أو رمز الجين الذي يهمك في شريط البحث لعرض النصوص الخاصة بالجين ثم انقر فوق الانتقال. ثم، حدد البديل النص المطلوب للجين من الفائدة وانقر على رمز الجينات بجانب البديل نسخة من الفائدة.بعد ذلك، ضمن التسلسل والارتباطات إلى أدوات وقواعد البيانات بانر، انقر فوق ارتباط تسلسل الجينوم. للحصول على خيارات منطقة استرداد التسلسل، حدد exons فقط و introns وسجل FASTA الافتراضي لكل جين. لخيارات تنسيق التسلسل، حدد exons في الحالة العليا، كل شيء آخر في حالة أقل وقناع يكرر لN.Then، انقر فوق إرسال.وأخيراً، حفظ هذا التسلسل، مع الحفاظ على التنسيقات الأحرف الكبيرة والصغيرة في مستند أو برنامج يمكن أن يكون مشروحاً. لتجنب انقطاع جزر Cpg ، حدد إظهار لمسار جزر Cpg تحت شعار التعبير والتنظيم لمتصفح الجينوم UCSC وانقر فوق تحديث. التكبير في على introns رئيس الوزراء خمسة، انقر على كل جزيرة CpG هو مبين باللون الأخضر، وحدد عرض الحمض النووي لهذه الميزة.بعد تحديد قناع يكرر لN، انقر فوق الحصول على الحمض النووي للحصول على تسلسل جزر Cpg. وأخيراً، تراكب هذه التسلسلات مع ملف التسلسل الأصلي، و تعليق توضيحي هذه كـ مناطق intronic لتجنب. لتجنب المناطق intronic مع التواقيع محسن في الأنسجة من الفائدة، انتقل إلى قاعدة البيانات ENCODE وحدد أيقونة التجارب.بالنسبة لنوع المقايسة، حدد ChiP-seq أو DNase-seq وقم بملء الفئات الأخرى وفقًا للخلايا التي سيتم هندستها. بعد تحديد الميزة، حدد معظم الرسوم التوضيحية اليسرى باللون الأزرق، حيث تظهر نتائج العرض كقائمة. ثم، حدد مجموعات البيانات لأهداف h3k4 أحادية الوميتيل، h3k27 أسيتيل، DNase 1، و CTCF التي تطابقت مع الخلايا التي سيتم هندستها.داخل كل مجموعة بيانات ذات صلة، قم بالتمرير إلى قسم الملف، وتحقق من تحديد MM10 و UCSC، ثم انقر فوق الزر Visualize. الآن ، في متصفح الجينوم UCSC ، قم بالتكبير على خمسة introns رئيس الوزراء وانقر على كل قمة في مسارات الذروة المشروحة. الحصول على تسلسل الحمض النووي لكل منطقة الذروة عن طريق النقر على إحداثيات الكروموسومات لكل قمة.في القائمة المنسدلة طريقة العرض، حدد DNA، وانقر فوق قناع يكرر إلى N.Finally، تراكب هذه التسلسلات مع ملف التسلسل الأصلي و تعليق توضيحي هذه المناطق intronic لتجنب. لتحديد sgRNA في المناطق intronic المتبقية مع خصوصية عالية ودرجات الكفاءة المتوقعة، انتقل إلى أداة تصميم sgRNA على الانترنت من الاختيار، مثل CRISPOR. أدخل تسلسل منطقة إينترونيكس من الفائدة ، وتحديد الجينوم المرجعي ذات الصلة ، واختيار الزخرج المرغوب في protospacer المجاورة.ثم، انقر فوق إرسال. المقبل ، وفرز sgRNA المتوقعة من قبل درجة التحديد واختيار واحد أو أكثر من sgRNA التي لديها أيضا درجة عالية من الكفاءة المتوقعة. وأخيرا، تصميم قالب الحمض النووي يحتوي على تسلسل منصة الهبوط PITT يحيط بها على كلا الجانبين من قبل 60 قاعدة homology الأسلحة التي تتوافق مع موقع قطع sgRNA.لعكس الهدف من قمع الجينات ، وإدارة IPTG في مياه الشرب من الفئران ولدت homozygous مع أليل المعدلة من الفائدة عن طريق حل كامل المبلغ المطلوب من IPTG في الماء المقطر العقيمة في يوم الإدارة. التفاف زجاجة مع احباط وإدارة المياه IPTG في زجاجة محمية خفيفة إلى الفئران من النمط الجيني المناسب والضوابط لمدة أسبوع واحد على الأقل. المضي قدما في تحليل التعبير عن جين الاهتمام في الأنسجة المستهدفة.للحث على رفع مستوى الجين ، وإدارة الدوكسيسيكلين في النظام الغذائي لمدة أسبوع والمضي قدما في تحليل التعبير عن جينة الاهتمام في الأنسجة المستهدفة. qRT PCR anaylisis أظهرت أن تم قمع التعبير DNMT1 إلى 15٪ من المستويات غير المنظمة باستخدام النهج القائم على المروج. تم عكس القمع بطريقة تعتمد على الجرعة من خلال علاج الفئران بكميات متفاوتة من IPTG.تم التحقق من صحة القمع DNMT1 الملاحظ وعكس القمع DNMT1 من قبل العلاج IPTG على مستوى البروتين عن طريق المناعة. qRT PCR تحليل التعبير mKate2 أظهرت أن النهج القائم على intron حققت أكثر من 90٪ القمع من مشغلي تقع عدة كيلوباسس أسفل المصب من موقع بدء النسخ عن طريق تخفيف الاستطالة النسخ. صور كونفوكال للتعبير mKate2 في intenstine الصغيرة من الفئران مع أو بدون مكبوت LacIGY التحقق من صحة النهج القائم على intron.تم تحقيق رفع تنظيم قوي وتحريج التعبير DNMT1 في الخلايا الجذعية الجنينية التي تحتوي على أليل DNMT1 الذاتية المعدلة مع تسلسلات المشغل تات ولاك. وكانت كل من اللوائح قابلة للعكس تماما وغير قابلة للدمج من قبل العلاج IPTG و Dox. لوحظ رفع قوي من DNMT1 من الكبد والطحال والكلى.ومع ذلك، لم يلاحظ أي تراكم يمكن اكتشافه في القلب، مما يشير إلى أن نمط التعبير المعتمد على دورة الخلية لـ DMNT1 وندرة الخلايا التكاثرية في القلب قد يكونا وراء هذه الملاحظة. دراسة وظيفة في الجسم الحي من الجينات الحرجة عن طريق التلاعب التعبير عنه في كثير من الأحيان تحديا بسبب الفتك. طريقة لدينا سمح لنا للتغلب على النمط الظاهري القاتل لجين اهتمامنا ومكننا من دراسة دورها في تكوين الأورام في الجسم الحي.وبالمثل، فإن هذه التكنولوجيا سوف تمكن من التحقيق في الجينات الأساسية الأخرى التي كان من الصعب دراستها.

Research

JoVE Journal

Genetics

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

النسخ في المختبر فحوصات وتطبيقها في اكتشاف الأدوية

In vitro transcription assays have been developed and widely used for many years to study the molecular mechanisms involved in transcription. This process ...

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

التلاعب الجيني للمسببات الأمراض النباتية<em&gt; السوادية الذروية</em&gt; لدراسة علم الأحياء الفطرية النباتية وميكروب التفاعلات

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the ...

Inducible T7 RNA Polymerase-mediated Multigene Expression System, pMGX

مستحلب T7 الحمض النووي الريبي البلمرة بوساطة مولتيجين نظام التعبير، بمغس

Co-expression of multiple proteins is increasingly essential for synthetic biology, studying protein-protein complexes, and characterizing and harnessing ...

Controllable Ion Channel Expression through Inducible Transient Transfection

السيطرة التعبير قناة ايون من خلال ترنسفكأيشن عابر محرض

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be ...

Studying Cell Cycle-regulated Gene Expression by Two Complementary Cell Synchronization Protocols

دراسة الخلية التعبير عن تنظيم دورة الجينات من قبل اثنين من بروتوكولات التزامن الخلية التكميلية

The gene expression program of the cell cycle represents a critical step for understanding cell cycle-dependent processes and their role in diseases such ...

Production and Purification of Baculovirus for Gene Therapy Application

إنتاج وتنقية باكولوفيروس لتطبيق العلاج الجيني

Baculovirus has traditionally been used for the production of recombinant protein and vaccine. However, more recently, baculovirus is emerging as a ...

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

التلاعب في بلويدي في ايليجانس كاينورهابديتيس

Mechanisms that involve whole genome polyploidy play important roles in development and evolution; also, an abnormal generation of tetraploid cells has ...

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

استكشاف ميكروبيومي الجذر: استخراج البيانات المجتمع البكتيرية من التربة، ورهيزوسفيري، واندوسفيري الجذر

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...

Manipulation of Gene Function in Mexican Cavefish

التلاعب بالجينات الدالة في كافيفيش المكسيكي

Cave animals provide a compelling system for investigating the evolutionary mechanisms and genetic bases underlying changes in numerous complex traits, ...

Efficient Transcriptionally Controlled Plasmid Expression System for Investigation of the Stability of mRNA Transcripts in Primary Alveolar Epithelial Cells

كفاءة النسخ التي تسيطر عليها نظام التعبير Plasmid للتحقيق في استقرار نصوص مرنا في الخلايا الظهارية الألفيولار الابتدائية

Studying posttranscriptional regulation is fundamental to understanding the modulation of a given messenger RNA (mRNA) and its impact on cell homeostasis ...