Name: in vivo application of the remote-control system for the manipulation of endogenous gene expression
Uploaded: 2019-03-29T14:00:00
Duration: 8 min 54 s
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我们感谢已故的海蒂·斯库夫医生慷慨赠送了哺乳动物 lacI 基因结构 (明尼苏达州罗切斯特梅奥诊所), 丹尼尔·卢沃德医生 (法国巴黎居里研究所) 提供了维林推广人员, 劳里·杰克逊-格鲁斯比医生 (儿童医院,波士顿, 马萨诸塞州) 为她的贡献, 这项技术开发的早期阶段。我们感谢吴南茜博士和罗伯特·马克森博士在产生转基因和淘汰赛小鼠方面提供的帮助。我们感谢莱尔德实验室成员的有益讨论和支持。这项工作得到了国家卫生研究院 [R01 CA75090、R01 DA030325、R01 CA157918 和 R01 CA212374 至 p. w. l. 和1F31CA21397-01A1 至 n. a. v. s] 的支持。

PWL 是安卓dx 和后代公司的科学咨询委员会成员。

remote 控制系统的一个关键步骤和潜在限制是在不影响目标基因表达的情况下插入抑制剂和/或激活剂结合位点所带来的挑战。我们最初的抑制方法, 适用于dnmt1基因, 包括在转录关键区域内插入乳酸抑制结合位点的启动子。为了降低影响启动子功能的风险, 从而提高 remote 控制系统的普遍适用性, 我们开发了一种基于内部的抑制方法。我们增强的 lac系统的效力使我们能够严格地抑制所有强启动子的转录, 我们在转录起始位下游数百到几千基酶的运算符中测试过这些启动子 (图3a-c)10. 重要的是, 抑制的程度与促进者的转录强度无关 (图 3a–c)10。这表明, 我们基于内部的压制系统的压制能力超过了被测试的促进者的转录强度。在这种基于内的方法中, 抑制很可能是通过转录伸长机制和 lac 抑制剂57这两个成分之间的物理干扰来介导的。这种简单的抑制机制和基于内的方法所证明的稳健性可能会使这种方法普遍适用于不同的基因、组织和生物体。
remote 控制系统的控制要求转位剂结合序列接近目标基因启动子, 这就带来了影响启动子功能的风险。然而, 我们发现绑定序列的位置可以在转录临界区域之外。从位于转录起始点上游的几百个碱基中,对 Dnmt1和ef1 α启动子进行了有力的放大.这种松弛约束极大地降低了在没有转化剂的情况下影响目标基因启动子功能的机会。增加结合序列的数量和/或使用更强的转化剂可以帮助进一步降低风险, 使更远的地点更远离转录起始位点的位置上进行增强。
我们的 remote 控制系统提供了对内源基因表达的水平、时间和位置的优雅控制, 允许测试表型的可逆性和不同表达水平的后果, 而这是不容易实现的目前体内基因表达控制技术。需要注意的是, 在包括我们在内的大多数基因表达分析中, 表达值代表了细胞群体的平均值, 其中可以发现相当大的差异。这种异质性可能会影响细胞决策过程, 如分化或凋亡58。尽管额外的基因工程 59可能会进一步提高基因表达控制的精度, 但我们目前系统的观测到的效力将使我们能够在许多生物环境中对基因功能进行有益的研究。此外, 由于操作序列的复杂性以及哺乳动物与监管成分的原始物种之间的进化距离很大, 预计目标特异性会很高。此外, 转基因小鼠系的抑制剂和激活剂可以开发和应用于任何内源基因。例如, 现有的 tet转位动物模型可以被调整为在所需的小鼠组织中完成目标基因的增加。我们最近开发了一条转基因线, 通过将lacgy基因引入 Hipp11 位点 48, 可以在多个组织类型中驱动增强 lac 抑制剂的增强型组织特异性表达 在 Loxs-stop-lox 元素的控制下 (未发布)。这条线路将大大便利 remte 控制系统的组织特异性应用。
与目前诱导的转基因方法相比, remte 控制系统的基因控制提供了几个优点。它不需要生成多个转基因线来测试插入的位置效果, 因为它利用内源性位点。此外, 这种方法非常适合具有强基线表达的基因的提升, 因为它增强了已经强大的启动子的表达, 而传统的转基因模型依赖于最小的病毒启动子。最后, 我们的方法可以保留目标基因的组织特异性、细胞周期控制和剪接变体, 因为它保留了自然调节的元素, 如先天的 cis-调控元素。crispr· cicpr 介导的基因靶向技术的出现将极大地促进这一技术在各种模型系统中的应用。

遗传敲除或转基因方法已成为研究动物模型基因功能的有效手段。然而, 这些方法的表达调控是二分法的, 非时间性的, 因此不能揭示基因的完整功能谱。条件 Cre /oxp技术允许时空失活或激活基因功能 , 但其二分法性质继续构成局限性 , 如细胞杀伤力和不可逆性1,2,3. 为了填补这一空白, 使用 tet 调控的 Shrna 或mirna4开发了有条件的敲除方法。然而, 非目标效应仍然是 RNAi5关注的问题, 在体内控制一直具有挑战性.最近, crisprc 介导的转录控制技术引入了一种更加通用的方法来实现内源基因表达的上升和下降调控, 并展示了它们的效用6,7.然而, crisprc 介导的转录控制的有效性在体内尚不清楚, 基于 krab 的抑制的可逆性还有待观察, 因为 KRAB 的强力抑制及其相互作用的蛋白质 KAP1 已被证明会诱发永久基因沉默8,9。
为了解决这些局限性, 我们开发了一种新的转录调控系统, 能够利用工程原核二元转录以可逆和可调谐的方式有条件地控制小鼠内源性基因表达监管制度10。原核二元转录调节系统与调节配体, 如lac和tet, 已经启用了这样的可逆和可调谐的表达控制11,12,13, 14. 然而, 目前的二元系统抑制能力不足, 妨碍了它们被广泛采用, 以控制哺乳动物的内源性基因表达。我们开发了一种增强的 lac 抑制系统, 该系统足以抑制内源基因, 并采用了一种新的策略, 将转录激活剂直接靶向到内源基因的同源启动子, 以实现鲁棒放大 (图 1)10。利用这项技术, 我们在可调谐、诱导和可逆的方式10中实现了内源性 dnmt1基因近两个数量级的表达控制。在这里, 我们提供了一步一步的指导, 它在体内应用于其他基因和生物使用小鼠作为模型物种。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59235/59235fig1.jpg"> 图 1: 远程控制系统概述.内源性靶基因的转录可以通过工程lac抑制和tet激活剂系统进行调控。目标基因启动子或内含子被设计为包含紧密结合的 LacIGY 抑制剂和/或 rtta-m2 激活剂的运算符。R 表示 Repron (Repron (rep-回归 intr on), 其中包含12个对称 lac 运算符 (s) 加上部分兔子β-球蛋白内含物。T 表示tet运算符。抑制剂和催化剂是由组织特异性启动子表达的。然后, 通过给药 IPTG (作为 lacigny 抑制剂的拮抗剂) 或多西环素 (dox) 的 IPTG (异丙基β-d-1-硫代角糖苷) 或多西环素 (Dox), 可以将目标基因的表达可逆地调整到所需的表达水平。这个数字已经从 Lee 等人的修改.请<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59235/59235fig1large.jpg" target="_blank">点击这里查看这个数字的更大版本.</a>
在开始此协议之前, 请查看表 1 , 以确定所需的基因表达控制的相关步骤。例如, 要设计一个鼠标, 使 "基因 X" 的可逆下调, 完成以下协议的第1、3和4节。表 1还总结了 remote 控制系统所需的组件。
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>所需的表达式更改</td>
			<td>仅限镇压</td>
			<td>仅激活</td>
			<td>抑制和激活</td>
		</tr>
<tr>
<td>《议定书》的相关章节</td>
			<td>1, 3-4</td>
			<td>2-4</td>
			<td>1-4</td>
		</tr>
<tr>
<td>目标基因中所需的运动控制序列</td>
			<td>Repron ("抑制内含子"; 12个对称 lac 运算符加上部分兔子β-球蛋白内含子)</td>
			<td>泰特运算符</td>
			<td>Repron 和 Tet 运算符</td>
		</tr>
<tr>
<td>控制序列位置</td>
			<td>内含 子</td>
			<td>促进</td>
			<td>Intron & 启动子</td>
		</tr>
<tr>
<td>所需的控制所需的激活不压机</td>
			<td>LacIGY 抑制器</td>
			<td>Rtta-m2 激活剂</td>
			<td>LacIGY 抑制剂和 Rtta-m2 激活剂</td>
		</tr>
<tr>
<td>监管配体</td>
			<td>IPTG</td>
			<td>多西环素</td>
			<td>IPTG 和/或多西环素</td>
		</tr>
</tbody></table>表 1:控制组件概述.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:715px;" width="715">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">B6C3F1/J</td>
			<td style="width:149px;">The Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:183px;">100010</td>
			<td style="width:167px;">https://www.jax.org/strain/100010</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cas9 Protein</td>
			<td style="width:149px;">PNA Bio</td>
			<td style="width:183px;">CP04</td>
			<td>http://www.pnabio.com/products/CRISPR_Cas9.htm?gclid=EAIaIQobChMIsoG8pLL33QIVBr7ACh0naQ4dEAAYAiAAEgKyHvD_BwE</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CRISPOR</td>
			<td>Haeussler et al. 2016</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td>http://crispor.tefor.net/</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Doxycycline-Containing Mouse Diet</td>
			<td style="width:149px;">Envigo</td>
			<td style="width:183px;">Varies by concentration</td>
			<td>https://www.envigo.com/products-services/teklad/laboratory-animal-diets/custom-research/doxycycline-diets/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ENCODE Database</td>
			<td style="width:149px;">Stanford University</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td>https://www.encodeproject.org/</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">iCre mRNA synthesis plasmid (pBBI)</td>
			<td style="width:149px;">Addgene</td>
			<td>65795</td>
			<td>https://www.addgene.org/65795/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">IPTG</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td style="width:183px;">I2481C</td>
			<td>https://www.goldbio.com/search?isSearch=Y&#38;q=iptg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">pGL3-Basic</td>
			<td style="width:149px;">Promega</td>
			<td style="width:183px;">E1751</td>
			<td>https://www.promega.com/products/reporter-assays-and-transfection/reporter-vectors-and-cell-lines/pgl3-luciferase-reporter-vectors/?catNum=E1751</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">SVM-BPfinder</td>
			<td style="width:149px;">Regulatory Genomics, Pompeu Fabra University</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td>http://regulatorygenomics.upf.edu/Software/SVM_BP/</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">TiProD: Tissue specific promoter Database</td>
			<td style="width:149px;">Department of Bioinformatics, UMG,&#160;University of G&#246;ttingen&#160;</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td>http://tiprod.bioinf.med.uni-goettingen.de</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">UCSC Genome Browser</td>
			<td style="width:149px;">University of California Santa Cruz</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td>https://genome.ucsc.edu/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo application of the remote-control system for the manipulation of endogenous gene expression

在这里, 我们描述了一个协议, 实现 remote 控制系统 (re可理解 m anipulation of t 输药在endogenous loci), 它允许可逆和可调谐的表达式控制生命模型系统中感兴趣的内源基因。remte 控制系统采用强化的乳酸抑制和泰特激活系统, 以实现在单一生物系统中对目标基因的向下或上行。通过抑制转录伸长率, 可以通过灵活地位于转录起始位点下游的抑制位点来实现严格的抑制。通过靶向同源启动子的转录激活剂, 增强内源基因的转录, 可以获得鲁棒的增强。这种可逆和可调谐的表达控制可以应用和反复撤回的生物体。该系统的有效性和多功能性, 如这里为内源性 Dnmt1所示, 将允许更精确的体内功能分析, 通过允许在不同的表达水平上的基因功能的调查, 并通过测试的可逆性表。

到目前为止, remote 控制系统的抑制能力已通过两种不同的方法得到证明。在第一种方法中, 在dnmt1基因的内源启动子中插入了乳酸抑制位点。在本协议建议的第二种方法中, 将抑制绑定位点插入到下游内含子中, 以避免通过插入影响启动子功能的潜在风险, 从而简化 remote 控制的应用系统。这两种方法都导致了成功的压制 (图2 a、b和图 3a-c)10。使用基于启动器的方法, Dnmt1表达式被抑制到不受管制级别的 15% (图 2a)。这种严格的抑制被逆转, 通过治疗不同数量的 IPTG 小鼠 (图 2a), 以剂量依赖性的方式逆转。通过免疫染色在蛋白质水平上证实了观察到的Dnmt1抑制 (图 2b)。我们没有观察到dnmt1+/+ 和 dnmt1loo 小鼠在dnmt1表达上有任何明显差异, 证实我们的lac运算符插入没有干扰正常启动子函数10。基于内的方法通过减少转录伸长率 (图 3a,b) 10, 实现了在转录起始位下的几种千酶的操作人员90% 以上的抑制.这种基于内的方法在另外七个鲁棒启动子上得到了进一步验证 (图 3c)。所有被测试的促进者都得到了完全严格的压制。没有观察到残余表达水平与促进者的优势之间的相关性, 这表明我们基于内部的抑制系统的抑制能力超过了我们测试的所有强大促进者的转录效力 (图 3c)。
在dnmt1基因上还演示了 remte 控制系统的体内控制能力。我们将tet算子的两个副本引入dnmt1启动子, 以及lac算子序列, 以便根据存在的效应蛋白进行放大或下调。在含有改性内源 Dmt1 等位基因 (dnmt1lgt) 的 Esc 中, Dnmt1 表达式的鲁棒控制和下调, 接近两个数量级 (10%至 650%) (图 4a) 10.这两种规定都是完全可逆的, 分别通过 IPTG 和 Dox 处理诱导 (图 4a)。接下来, 我们在小鼠胚系中引入了 dnmt1lgt修饰, 以测试 remte 控制系统的体内放大能力。从肝脏、脾脏和肾脏观察到 Dnmt1的强凝血, 而在心脏中没有发现可检测到的可发生的凝血 (图 4b)7。dnmt1的细胞周期依赖性表达模式和心脏增殖细胞的稀缺可能是这一观察 10,56的基础。这种限制是否可以通过增加激活器的表达级别或其绑定站点的数量来克服, 还有待观察。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59235/59235fig2.jpg"> 图 2: 在体内由 LacIGY 抑制者对 dnmt1的镇压.(a) 将 lac 运算符 (Lo) 插入dnmt1启动子的小鼠, 无论是否有lacigy的表达, 均采用不同剂量的 iptg 进行治疗。对Dnmt1表达的 qRT-PCR 分析显示, IPTG 治疗在体内抑制 Dnmt1的剂量依赖性逆转。每个条形图表示来自不同鼠标的数据。数据表示平均值±SEM (n = 3)。(b) Dnmt1 蛋白在提供有或不使用 160 MM iptg 的小鼠结肠墓穴中的免疫染色, 为期3周。这个数字已经从 Lee 等人的修改.请<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59235/59235fig2large.jpg" target="_blank">点击这里查看这个数字的更大版本.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59235/59235fig3.jpg"> 图 3: 在体内和各种启动子的体外抑制的 remote 控制系统.(a) 在vilin-mkate2转基因小鼠 (vilmkate2) 中, 将 Repron 序列 (r *) 的早期版本插入维林启动子的一个内含子下游。对有或没有 Lacigy抑制剂的小鼠小肠中Mkate2的表达进行了 qrt-pcr 分析。每个条形图表示来自不同鼠标的数据。(b) 有和没有lacigy表达的小肠共聚焦 mkate2 图像。(c) 在不同的启动子和一个荧光素酶记者之间插入了六个对称 lac 算子 (s)。以 1: 1 摩尔比的方式将记者 (96 孔板中的 50 ng\ 井) 和抑制质粒临时引入 nih t3 细胞。转染后24小时评估荧光素酶值。这些体外数据代表了lacigy表达细胞中荧光素酶表达的百分比, 相对于那些表达非功能性拉西(nflaci) 的细胞。t 检验被用来确定统计意义。数据表示平均值±SEM (n = 3)。*p ≤0.05, * * p ≤0.01。这个数字已经从 Lee 等人的修改.请<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59235/59235fig3large.jpg" target="_blank">点击这里查看这个数字的更大版本.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59235/59235fig4.jpg"> 图 4: dnmt1在体外和体内表达的向下和向下的提高。(A)采用基因靶向和电穿孔的方法, 在培养的 Esc 中设计了完整的 remote 控制系统。Dnmt1表达的最大抑制是在没有治疗的情况下实现的, 而最大的激活是通过 Iptg 和 dox 治疗实现的。数据表示平均值±SEM (n = 3)。*p≤0.05 , * * P≤0.01 (韦尔奇的 t-试验)。(b) remote 控制系统在体内激活 Dnmt1, remote 控制小鼠在各种组织中对dnmt1蛋白进行免疫染色就证明了这一点。Lgt等位基因代表dnmt1的启动子修改, 以包含lac算子和tet激活剂结合位点。小鼠接受了一个月的正常或含多克饮食 (5000 mg/kg Doxycycline Hyclate) 治疗。这个数字已经从 Lee 等人的修改.请<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59235/59235fig4large.jpg" target="_blank">点击这里查看这个数字的更大版本.</a>
<img alt="Supplementary Figure 1" src="/files/ftp_upload/59235/59235supfig1.jpg"> 补充图 1: 着陆台插入小鼠 Dnmt1内压子1的示例.(a) 着陆场插入 dna 模板示意图, 改编自 quadros 等人 (2015年)31。异型Loxp 位点, Jt15 和 Lox2272, 由一个短的间隔序列 (sp) 分离, 并由与目标基因组区域同源的 60 bp dna 两侧。(b) 使用以下 SGRNA 将着陆板插入Dnmt1内含子的样品 DNA 模板: ctagtaccctgtacg (针对反向链)。步骤1.1 对选定的中而已区进行了生物信息通报, 并使用 CRISPOR29对 sgRNA 进行了鉴定。(c) pcr 引物设计示例, 用于评估着陆场的插入情况。PCR 引物是在模板同源臂之外设计的, 以确认与内源性 Dnmt1的集成。野生型 PCR 放大器为 213 bp;插入后, 它将成为 291 bp. 请<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59235/59235supfig1large.jpg" target="_blank">点击这里查看此图的较大版本.</a>

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In vivo Application of the REMOTE-control System for the Manipulation of Endogenous Gene Expression

remtoe 控制系统在内源基因表达调控中的应用

该协议概述了生成模型系统所需的步骤, 在该模型系统中, 相关内源基因的转录可以在活体动物或细胞中使用增强的 lac 抑制和/或 tet激活剂系统有条件地控制。

Here we describe a protocol for implementing the REMOTE-control system (Reversible Manipulation of Transcription at Endogenous loci), which allows for ...

我们的方法的意义是它的多功能性和效力。它允许研究人员以使用现有方法具有挑战性的方式对内源基因表达进行强有力的控制。它允许研究人员以时空方式研究基因在不同表达水平上的功能。因此，它允许测试表型的可逆性，这对于研究疾病相关基因很有用。为了完成抑制，目标基因内创器被设计为包含 repron R，其中包含 12 个对称 Lac 运算符。当 LacIGY 抑制器从所需的组织特定启动子表示时，目标基因被抑制。通过给给的IPTG，一个LacIGY抑制剂的拮抗剂，可以逆转或调整目标基因的抑制到所需的表达水平。为了完成上调节，目标基因启动子被设计为包含四个或更多Tat运算符，T，作为rtTA-M2激活剂的结合位点。当活化剂在多氧环素存在的情况下从所需的组织特异性启动子中表达时，诱导目标基因的上调节。通过提取或改变多氧环素的浓度，可以反转或调整目标基因的上调节，或调整到所需的表达水平。为了实现抑制和激活，Lac 抑制器和 Tat 激活器系统可以组合在一起。为了修改抑制的兴趣基因，应识别一个转录惰性内向感兴趣的基因的五个主要端，以插入重压序列。要获取感兴趣的基因的基因组序列，请导航到 UCSC 基因组浏览器，并在基因组选项卡下选择小鼠基因组的最新草稿。在搜索栏中输入感兴趣的基因的名称或符号，以查看该基因的转录本，然后单击"转到"。然后，为感兴趣的基因选择所需的转录体，然后单击感兴趣的转录体变体旁边的基因符号。接下来，在工具和数据库的序列和链接下，单击基因组序列链接。对于序列检索区域选项，仅选择 exons、intron 和默认的一个 FASTA 记录每个基因。对于排序格式选项，选择大写例的 exon，小写的所有内容，并掩码重复到 N.然后，单击提交。最后，保存此序列，在文档或程序中保留可注释的大写和小写格式。为避免 CpG 岛屿中断，请在 UCSC 基因组浏览器的表达和调节横幅下为 CpG 岛屿轨道选择"显示"，然后单击刷新。放大五个主要内子，单击以绿色显示的每个 CpG 岛，然后选择查看此功能的 DNA。选择掩码重复到 N 后，单击 get DNA 获取 CpG 孤岛序列。最后，将这些序列与原始序列文件叠加在一起，并注释这些序列作为要避免的 intronic 区域。为了避免在感兴趣的组织中具有增强剂特征的内向区域，请导航到 ENCODE 数据库并选择实验图标。对于检测类型，选择 ChiP-seq 或 DNase-seq，然后根据要设计的细胞填充其他类别。要素选择后，选择蓝色左侧最象形图，视图结果将显示为列表。然后，选择 h3k4 单甲基化、h3k27 乙酰化、DNase 1 和 CTCF 的目标数据集，这些数据集与要设计的细胞最匹配。在每个相关数据集中，滚动到文件部分，验证是否选择了 mm10 和 UCSC，然后单击可视化按钮。现在，在 UCSC 基因组浏览器中，放大五个主要内子，然后单击带注释的峰值轨迹中的每一个峰值。通过单击每个峰的染色体坐标，获取每个峰区域的 DNA 序列。在视图下拉菜单中，选择 DNA，然后单击掩码重复到 N.Finally，用原始序列文件覆盖这些序列，并注释这些序列作为 intronic 区域以避免。要识别其余非电子区域中的 sgRNA，请导航到首选的在线 sgRNA 设计工具，如 CRISPOR。输入感兴趣的内向区域序列，指定相关的参考基因组，并选择所需的原空间相邻图案。然后，单击"提交"。接下来，按特异性分数对预测的 sgRNA 进行排序，并选择一个或多个也具有高预测效率分数的 sgRNA。最后，设计一个DNA模板，其中包含一个PITED着陆垫序列，两侧由60个基基同源臂，对应于sgRNA切割位置。为了扭转目标基因抑制，在同源小鼠的饮用水中管理IPTG，使用感兴趣的修饰等位基因，在施用当天完全溶解无菌蒸馏水中所需的IPTG量。用铝箔包裹瓶子，将IPTG水用一个受光保护的瓶子管理给适当基因型的老鼠，并控制至少一周。继续分析目标组织中感兴趣的基因的表达。为了诱导基因的调节，在饮食中施用多氧环素一周，然后开始分析目标组织中感兴趣的基因的表达。qRT PCR分析显示，使用基于启动子的方法，DNMT1表达被抑制到15%的不受管制水平。通过治疗不同数量的IPTG小鼠，以剂量依赖的方式扭转了抑制。观察到的DNMT1抑制和IPTG治疗DNMT1抑制的逆转在蛋白质水平上通过免疫污染得到验证。mKate2表达的qRT PCR分析表明，通过衰减转录伸长，基于内创的方法从位于转录开始站点下游几个千基的操作员实现了90%以上的抑制。有或没有LacIGY抑制器的小鼠小强度中的mKate2表达的共和图像验证了基于内创的方法。在含有Tat和Lac操作器序列的改性内源DNMT1等位基因的胚胎干细胞中，对DNMT1表达实现了强有力的上调节和下调节。这两种法规都是完全可逆的，可由IPTG和Dex处理。从肝脏、脾脏和肾脏观察到对DNMT1的强调节。然而，在心脏没有检测到的上调节，这表明DMNT1的细胞周期依赖表达模式和心脏增殖细胞的缺乏可能是这一观察的根据。由于致命性，通过操纵关键基因的表达来研究其体内功能往往具有挑战性。我们的方法使我们能够克服我们感兴趣的基因的致命表型，并使我们能够研究它在体内肿瘤生成中的作用。同样，这项技术将促成其他难以研究的基本基因的研究。

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