Name: in vivo application of the remote-control system for the manipulation of endogenous gene expression
Uploaded: 2019-03-29T14:00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In vivo Application of the REMOTE-control System for the Manipulation of Endogenous Gene Expression at JoVE.com

Vi takker den sene Dr. Heidi Scrable for hendes generøse gave af pattedyr lacI gen konstruktionen (Mayo Clinic, Rochester, MN), Dr. Daniel Louvard (Institut Curie, Paris, Frankrig) for at give Villin-promotor og Dr. Laurie Jackson-Grusby (children's Hospital, Boston, MA) for hendes bidrag til de tidlige stadier af denne teknologiudvikling. Vi er taknemmelige for Dr Nancy Wu og Dr. Robert Maxson for deres bistand til at generere de transgene og knockout mus. Vi vil gerne takke medlemmerne af Laird laboratorium for nyttige diskussioner og støtte. Dette arbejde blev støttet af den National Institutes of Health [R01 CA75090 R01 DA030325, R01 CA157918 og R01 CA212374 til P.W.L. og 1F31CA213897-01A1 til N.A.V.S].

PWL serverer på videnskabelige rådgivende bestyrelser af AnchorDx og Progenity, Inc.

Et kritisk trin og potentielle begrænsning af fjernbetjening systemet er udfordringen forbundet med indsættelse af repressor og/eller aktivator bindingssteder uden at påvirke målet genekspression. Vores oprindelige undertrykkelse tilgang, involveret som anvendes til Dnmt1 -gen indsættelse af lac repressor bindingssteder i transcriptionally kritiske regioner af en promotor. For at mindske risikoen for påvirker promotor funktion og dermed til at forbedre den almene gyldighed af fjernbetjening system, vi udviklede en intron-baserede undertrykkelse tilgang. Styrken af vores forbedrede lac systemet tillod os at stramt undertrykke transkription af alle stærke initiativtagerne vi testet på operatører ligger flere hundrede til flere kilobases nedstrøms i transkription starte websteder (fig. 3A-C) 10. vigtigere, undertrykkelse var uafhængig af de transkriptionel styrker af initiativtagere (fig. 3A-C)10. Dette tyder på at undertrykkelse af vores intron-baserede undertrykkelse ordning overstiger transcriptional styrken af de testede initiativtagere. I denne intron-baseret tilgang er det sandsynligt, at undertrykkelsen er medieret gennem fysiske interferens mellem to komponenter, transskription brudforlængelse maskiner og lac repressors57. Denne enkle undertrykkelse mekanisme og demonstreret robustheden af metoden intron-baserede kan gøre denne tilgang generelt gælder for forskellige gener, væv og organismer.
Opregulering af fjernbetjening systemet kræver transaktivatoren bindende sekvenser til at være i nærheden af target gen promotor, hvilket indebærer en risiko for at påvirke promotor funktion. Dog fandt vi, at placeringen af bindende sekvenser kan være uden for regionen transcriptionally kritisk. Både Dnmt1 og EF1α initiativtagerne var håndfast upregulated fra tet operatører ligger et par hundrede baser opstrøms transskription start sites10. Denne afslappet begrænsning reducerer chancen for at påvirke promotor funktion af et target gen i mangel af transaktivatoren. Øge antallet af bindende sekvenser og/eller brug af stærkere transactivators kunne hjælpe yderligere reducere risikoen ved at aktivere Opregulering fra steder længere væk fra startstedet transskription.
Vores fjernbetjening system giver elegante kontrol af niveau, timing og placering af endogene genekspression, giver mulighed for prøvning reversibilitet af en fænotype og konsekvenserne af forskellige udtryk niveauer, der ikke er let opnåeligt ved nuværende in vivo gen expression-adgangskontrol teknologier. Det er vigtigt at bemærke, at i de fleste gen expression analyser, herunder vores, udtryk værdier repræsenterer gennemsnittet af en population af celler blandt hvilke betydelig variation kan findes. Denne forskelligartethed kan påvirke cellulære beslutningsprocesser, såsom differentiering eller apoptose58. Selvom præcision af gen expression kontrol kunne sandsynligvis forbedres yderligere ved yderligere genetiske kredsløb engineering59, vil den observerede styrken af vores nuværende system give nyttige undersøgelse af genfunktioner i mange biologiske sammenhænge. Derudover forventes en høj grad af target specificitet på grund af operatør sekvenser samt store evolutionære afstanden mellem pattedyr og arternes oprindelse på den reguleringsmæssige komponenter60kompleksitet. Derudover kan Transgene mus linjer af repressors og aktivatorer udviklet og ansat for enhver endogene genet. For eksempel, kan eksisterende tet transaktivatoren musemodeller tilpasses for at udføre opregulering af et target gen i de ønskede mus væv. Vi har for nylig udviklet en transgene linje, der kan drive robust væv-specifikke udtryk for vores forbedrede lac repressor i flere vævstyper når de kombineres med eksisterende Cre linjer ved at indføre lacIGY -gen i Hipp11 locus48 under kontrol af en Lox-STOP-Lox element (upubliceret). Denne linje ville væsentligt lette væv-specifikke anvendelse af sen-kontrol-system.
Gen opregulering af fjernbetjening system giver adskillige fordele i forhold til nuværende inducerbar transgene tilgange. Det kræver ikke generation af flere transgene linjer til at teste for position virkningerne af indsættelsen, som det udnytter den endogene locus. Desuden, er denne fremgangsmåde velegnet til opregulering af gener med stærk baseline udtryk, fordi det øger udtryk fra en allerede robuste promotor, mens konventionelle transgene modeller er afhængige af minimal viral initiativtagere. Endelig væv specificitet, celle-cyklus kontrol og splejsning varianter af et target gen kan bevares ved opregulering af vores tilgang, da det bevarer elementer af naturlige regulering som medfødte cis-regulerende elementer. Fremkomsten af CRISPR/Cas-medieret gen-targeting teknologi vil i høj grad lette anvendelsen af denne teknologi i forskellige modelsystemer.

Genetiske knockout eller transgene tilgange har været effektive midler til at studere genfunktion i dyremodeller. Dog udtryk regulering af disse tilgange er dikotome (tænd/sluk), ikke-temporale, og er således ikke i stand til at afsløre den komplette funktionelle spektrum af et gen. Betinget Cre/LoxP teknologier har tilladt spatio-temporale inaktivering eller aktivering af genfunktioner, men deres dikotome natur fortsat at udgøre begrænsninger, såsom celle dødelighed og uigenkaldelighed1,2 , 3. for at udfylde dette tomrum, betinget knockdown metoder er blevet udviklet ved hjælp af tet-reguleret shRNA eller miRNA4. Men ud-target effekter fortsat en bekymring for RNAi5 og har udfordrende for at styre in vivo. For nylig, CRISPR/Cas-medieret transcriptional-kontrol teknologier har indførte en mere alsidig tilgang til at opnå både op- og downregulation af endogene genekspression og demonstreret deres utilities6,7 . Dog, effektiviteten af CRISPR/Cas-medieret transcriptional kontrol er endnu uklart i vivo, og reversibiliteten af KRAB-baserede undertrykkelse mangler for at blive set, så stærk undertrykkelse af KRAB og dens interagerende protein KAP1 har vist sig at fremkalde permanent genhæmning8,9.
For at imødegå disse begrænsninger, har vi udviklet en roman transcriptional regulerende system kan betinget kontrollere endogene genekspression i en reversibel og afstemmelige måde i mus bruger manipuleret prokaryote binære transcriptional reguleringssystemer10. Prokaryote binære transcriptional reguleringssystemer med regulerende ligander såsom lac og tet, har aktiveret sådan reversible og afstemmelige udtryk styre11,12,13, 14. imidlertid den utilstrækkelige undertrykkelse styrken af de aktuelle binære systemer har hæmmet deres brede vedtagelse for at kontrollere endogene genekspression hos pattedyr. Vi udviklet en forbedret lac undertrykkelse system tilstrækkeligt potent til undertrykkelse af endogene gener og ansat en roman strategi rettet mod tet transcriptional aktivatorer direkte til den beslægtet fortaler for en endogen gen at opnå robust Opregulering (figur 1)10. Med denne teknologi, har vi opnået næsten to størrelsesordener udtryk kontrol af den endogene Dnmt1 gen i en afstemmelige, inducerbar og reversibel måde10. Her giver vi trinvise instruktioner til stævningen in vivo til andre gener og organismer ved hjælp af mus som en model art.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59235/59235fig1.jpg"> Figur 1 : Oversigt over fjernbetjening systemet. Transskription af en endogen target gen kan reguleres ved hjælp af konstruerede lac repressor og tet aktivator systemer. Target gen promotor eller intron er udviklet til at indeholde operatorer for tight bindende LacIGY repressor og/eller rtTA-M2 aktivator. R angiver Repron (Repression intrpå), som indeholder 12 symmetrisk lac operatører (S) plus en delvis kanin beta-globin intron. T angiver tet operatør. Repressor og aktivator/udtrykkes fra en væv-specifikke promotor. Udtryk af target-genet kan derefter reversibelt tunet til det ønskede udtryk niveau af administration af IPTG (isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside, en antagonist af LacIGY repressor) eller doxycyclin (Dox). Dette tal er blevet ændret fra Lee et al.10<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59235/59235fig1large.jpg" target="_blank">venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
Før du begynder denne protokol, anmeld tabel 1 for at identificere de relevante trin for den ønskede kontrol af genekspression. For eksempel for at ingeniør en mus, der muliggør reversibel downregulation af "Gen X", udfylde rubrik 1, 3 og 4 i den nedenfor protokol. Tabel 1 også opsummerer de nødvendige komponenter til fjernbetjening systemet.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Ønskede udtryk ændring</td>
			<td>Undertrykkelse kun</td>
			<td>Aktivering kun</td>
			<td>Både undertrykkelse og aktivering</td>
		</tr>
<tr>
<td>Relevante dele af protokollen</td>
			<td>1, 3-4</td>
			<td>2-4</td>
			<td>1-4</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fjernbetjening sekvens i Target gen</td>
			<td>Repron ("Undertrykkelse intron"; 12 symmetrisk lac operatører plus en delvis kanin beta-globin intron)</td>
			<td>Tet operatører</td>
			<td>Repron og Tet operatører</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fjernbetjening sekvens placering</td>
			<td>Intron</td>
			<td>Promotor</td>
			<td>Intron & promotor</td>
		</tr>
<tr>
<td>Aktivator/Repressor behov for ønskede kontrol</td>
			<td>LacIGY Repressor</td>
			<td>rtTA-M2 aktivator</td>
			<td>LacIGY Repressor og rtTA-M2 aktivator</td>
		</tr>
<tr>
<td>Regulerende ligander</td>
			<td>IPTG</td>
			<td>Doxycyclin</td>
			<td>IPTG og/eller doxycyklin</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: Oversigt over fjernbetjening komponenter.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:715px;" width="715">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">B6C3F1/J</td>
			<td style="width:149px;">The Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:183px;">100010</td>
			<td style="width:167px;">https://www.jax.org/strain/100010</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cas9 Protein</td>
			<td style="width:149px;">PNA Bio</td>
			<td style="width:183px;">CP04</td>
			<td>http://www.pnabio.com/products/CRISPR_Cas9.htm?gclid=EAIaIQobChMIsoG8pLL33QIVBr7ACh0naQ4dEAAYAiAAEgKyHvD_BwE</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CRISPOR</td>
			<td>Haeussler et al. 2016</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td>http://crispor.tefor.net/</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Doxycycline-Containing Mouse Diet</td>
			<td style="width:149px;">Envigo</td>
			<td style="width:183px;">Varies by concentration</td>
			<td>https://www.envigo.com/products-services/teklad/laboratory-animal-diets/custom-research/doxycycline-diets/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ENCODE Database</td>
			<td style="width:149px;">Stanford University</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td>https://www.encodeproject.org/</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">iCre mRNA synthesis plasmid (pBBI)</td>
			<td style="width:149px;">Addgene</td>
			<td>65795</td>
			<td>https://www.addgene.org/65795/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">IPTG</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td style="width:183px;">I2481C</td>
			<td>https://www.goldbio.com/search?isSearch=Y&#38;q=iptg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">pGL3-Basic</td>
			<td style="width:149px;">Promega</td>
			<td style="width:183px;">E1751</td>
			<td>https://www.promega.com/products/reporter-assays-and-transfection/reporter-vectors-and-cell-lines/pgl3-luciferase-reporter-vectors/?catNum=E1751</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">SVM-BPfinder</td>
			<td style="width:149px;">Regulatory Genomics, Pompeu Fabra University</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td>http://regulatorygenomics.upf.edu/Software/SVM_BP/</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">TiProD: Tissue specific promoter Database</td>
			<td style="width:149px;">Department of Bioinformatics, UMG,&#160;University of G&#246;ttingen&#160;</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td>http://tiprod.bioinf.med.uni-goettingen.de</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">UCSC Genome Browser</td>
			<td style="width:149px;">University of California Santa Cruz</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td>https://genome.ucsc.edu/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo application of the remote-control system for the manipulation of endogenous gene expression

Her beskriver vi en protokol for at gennemføre ordningen fjernbetjening (Reversible Manipulation of Transcription på Endogenous loci), som giver mulighed for reversible og afstemmelige udtryk kontrol af en endogene gen af interesse i levende model systemer. Fjernbetjening system beskæftiger udvidede lac undertrykkelse og tet aktivering systemer at opnå ned- eller Opregulering af et target gen inden for en enkelt biologisk system. Stram undertrykkelse kan opnås fra repressor bindende websteder fleksibelt beliggende langt neden for en transskription startsted ved at hæmme transskription brudforlængelse. Robust Opregulering kan nås ved at forbedre transskription af en endogen gen ved at målrette tet transcriptional aktivatorer til beslægtet initiativtageren. Denne reversible og afstemmelige udtryk kontrol kan anvendes og trukket tilbage gentagne gange i organismer. Styrken og alsidigheden i systemet, som demonstrerede for endogene Dnmt1 her, vil give mere præcise in vivo funktionelle analyser ved at aktivere undersøgelse af genfunktioner på forskellige udtryk og ved at teste reversibilitet af en fænotype.

Den undertrykkelse evne til fjernbetjening system er blevet påvist i to forskellige tilgange hidtil. I den første fremgangsmåde, blev lac repressor bindingssteder indsat på den endogene promotor af Dnmt1 -genet. I den anden tilgang, som anbefales af denne protokol, blev repressor bindingssteder indsat i en downstream intron at undgå den potentielle risiko for at påvirke promotor funktion ved indsættelse og dermed at forenkle anvendelsen af fjernbetjeningen system. Begge strategier resulterede i vellykkede undertrykkelse (figur 2A, B og figur 3A-C)10. Dnmt1 udtryk var undertrykt til 15% af de uregulerede niveauer ved hjælp af metoden promotor-baseret (fig. 2A). Denne stramme undertrykkelse var vendt i en dosisafhængig måde af behandle musene med varierende mængder af IPTG (fig. 2A). Den observerede Dnmt1 undertrykkelse blev valideret på protein-niveau ved immunfarvning (figur 2B). Vi ikke observere nogen mærkbar forskel i Dnmt1 udtryk mellem Dnmt1+/ + og Dnmt1LO/LO mus, bekræfter, at vores lac operatør indsættelse ikke havde forstyrret normale promotor funktionen10. Intron-baserede tilgang opnåede mere end 90% undertrykkelse fra operatører ligger flere kilobases nedstrøms i transskription start site af formildende omskrivning brudforlængelse (fig. 3A, B)10. Denne intron-baserede tilgang var yderligere valideret på syv ekstra robust initiativtagere (figur 3C). Altid stramme undertrykkelse blev opnået fra alle initiativtagerne testet. Ingen korrelation mellem resterende udtryk og de stærke sider af projektansvarlige blev observeret, hvilket tyder på at undertrykkelse af vores intron-baserede undertrykkelse ordning overstiger transcriptional styrken af alle de robuste initiativtagere vi testet () Figur 3 C).
In vivo Opregulering mulighed for fjernbetjening system blev også demonstreret på Dnmt1 genet. Vi indført to kopier af operatoren tet i Dnmt1 promotor, sammen med lac operatør sekvenser, at give mulighed for enten Opregulering eller downregulation afhængigt af hvilke effektor protein er til stede. Robust Opregulering og downregulation af Dnmt1 udtryk, tæt på to størrelsesordener (10% til 650%), der blev opnået i sektorrådene indeholdende den modificerede endogene Dnmt1 allel (Dnmt1LGT) (figur 4A)10 . Begge forordninger var fuldt reversibel og inducerbar ved IPTG og Dox behandlinger, henholdsvis (figur 4A). Vi indført næste Dnmt1LGT ændring i mus kønscelleoverførsel til test in vivo Opregulering mulighed for fjernbetjening system. Stærk opregulering af Dnmt1 blev observeret fra lever, milt og nyrer, hvorimod ingen påviselige Opregulering i hjertet blev observeret (fig. 4B)7. Cellecyklus-afhængige udtryk mønster af Dnmt1 og knaphed på proliferativ celler i hjertet kan ligge til grund for denne observation10,56. Det er stadig uvist, om denne begrænsning kan overvindes ved at øge niveauet udtryk af aktivator eller antallet af dets bindingssteder.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59235/59235fig2.jpg"> Figur 2 : In vivo undertrykkelse af Dnmt1 af LacIGY repressor. (A) mus med lac operatører (LO) indsat i Dnmt1 promotor, med eller uden udtryk for LacIGY, blev behandlet med forskellige doser af IPTG. qRT-PCR analyse af Dnmt1 udtryk viser dosisafhængig tilbageførsel af Dnmt1 undertrykkelse in vivo af IPTG behandling. Hver søjle repræsenterer data fra en anden mus. Data repræsenterer gennemsnit ± SEM (n = 3). (B) immunfarvning af Dnmt1 protein i Colon Krypter af mus leveret drikkevand med eller uden 160 mM IPTG i 3 uger. Dette tal er blevet ændret fra Lee et al.10<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59235/59235fig2large.jpg" target="_blank">venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59235/59235fig3.jpg"> Figur 3 : In vivo og in vitro-undertrykkelse af forskellige projektledere fjernbetjening systemet. (A) en tidlig version af Repron sekvens (R *) blev indsat i en intron neden for Villin i en Villin-mKate2 Transgene mus (VilmKate2). qRT-PCR analyse af mKate2 udtryk i tyndtarmen i mus med eller uden LacIGY repressor er vist. Hver søjle repræsenterer data fra en anden mus. (B) Konfokal mKate2 billeder af tyndtarmen med og uden LacIGY udtryk. (C) seks symmetrisk lac operatører (S) blev indsat mellem forskellige projektledere og en luciferase reporter. Journalister (50 ng/godt i 96-brønd plade) og repressor plasmider indført forbigående NIH/3T3 celler i forholdet 1:1 molar. Luciferase værdier blev vurderet 24 h efter Transfektion. Disse in vitro data repræsenterer procentdelen af luciferase udtryk i LacIGY-at udtrykke celler i forhold til dem, der giver udtryk for ikke-funktionelle Lund (NFlacI). T-test blev anvendt til at bestemme Statistisk signifikans. Data repræsenterer gennemsnit ± SEM (n = 3). P ≤ 0,05, **P ≤ 0,01. Dette tal er blevet ændret fra Lee et al.10<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59235/59235fig3large.jpg" target="_blank">venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59235/59235fig4.jpg"> Figur 4 : Ned - og/eller Opregulering af Dnmt1 udtryk in vitro- og in vivo. (A) komplet fjernbetjening systemet blev udviklet i kulturperler sektorrådene af genet målretning og elektroporation tilgange. Maksimal undertrykkelse af Dnmt1 udtryk blev opnået med ingen behandling, mens maksimal aktivering blev opnået ved både IPTG og Dox behandling. Data repræsenterer gennemsnit ± SEM (n = 3). P ≤ 0,05, **P ≤ 0,01 (Welch's t-test). (B) In vivo aktivering af Dnmt1 af fjernbetjening systemet, som det fremgår af immunfarvning af Dnmt1 protein i forskellige væv fra fjernbetjening mus. LGT allel repræsenterer promotor ændring af Dnmt1 til at indeholde lac operatør og tet aktivator bindingssteder. Mus blev behandlet med en normal eller Dox-holdige kost (5000 mg/kg doxycyclin hyclat) for en måned. Dette tal er blevet ændret fra Lee et al.10<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59235/59235fig4large.jpg" target="_blank">venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Supplementary Figure 1" src="/files/ftp_upload/59235/59235supfig1.jpg"> Supplerende figur 1 : Eksempel på landing pad indsættelse i murine Dnmt1 intron 1. (A) skematisk af DNA skabelon for landing pad indsættelse, tilpasset fra Quadros et al. (2015)31. Heterotypiske loxP sider, JT15 og Lox2272, er adskilt af et kort afstandsstykke sekvens (sp) og flankeret på hver side af 60-bp af DNA, der er homologe til genomisk målområde. (B) prøve DNA skabelon for landing pad indsættelse i Dnmt1 intron ved hjælp af de følgende sgRNA: CTAGTACCACTCCTGTACCG, (som er rettet mod den omvendte strand). Det valgte intronic område var bioinformatically oplyst af trin 1.1, og sgRNA blev identificeret ved hjælp af CRISPOR29. (C) eksempel på PCR primer design for vurdering af indsættelse af landing pad. PCR-primere var designet uden for homologi armene af skabelonen til at bekræfte integration i endogene Dnmt1. Vildtype PCR-amplikon er 213 bp; ved indsættelse, bliver det 291 bp. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59235/59235supfig1large.jpg" target="_blank">venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about In vivo Application of the REMOTE-control System for the Manipulation of Endogenous Gene Expression at JoVE.com

In vivo Application of the REMOTE-control System for the Manipulation of Endogenous Gene Expression

In vivo anvendelse af sen-kontrol-System for Manipulation af endogene genekspression

Denne protokol beskriver de nødvendige skridt for at generere en modelsystem hvor transkription af en endogen gen af interesse betinget kan styres i levende dyr eller celler ved hjælp af forbedrede lac repressor og/eller tet aktivator systemer.

Here we describe a protocol for implementing the REMOTE-control system (Reversible Manipulation of Transcription at Endogenous loci), which allows for ...

Betydningen af vores metode er dens alsidighed og styrke. Det giver forskerne mulighed for at have robust kontrol over endogene genekspression på måder, der har været udfordrende at opnå ved hjælp af eksisterende metoder. Det giver forskerne mulighed for at undersøge et gens funktion på forskellige ekspressionsniveauer og på en spatio-tidsmæssig måde.Således giver det mulighed for at teste reversibilitet af en fænotype, som er nyttig, når man studerer sygdomsrelaterede gener. For at opnå undertrykkelse, er målet genet intron manipuleret til at indeholde repron R, som indeholder 12 symmetriske Lac operatører. Når LacIGY-repressoren udtrykkes fra den ønskede vævsspecifikke promotor, undertrykkes målgenet.Undertrykkelse af målgenet kan vendes eller justeres til det ønskede udtryksniveau ved administration af IPTG, en antagonist af LacIGY-undertrykkeren. For at opnå opregulering er målgenspromotoren udviklet til at indeholde fire eller flere Tat-operatører, T, som bindende steder for rtTA-M2-aktivatorerne. Når aktivatoren udtrykkes fra den ønskede vævsspecifikke promotor ved tilstedeværelse af doxycyclin, opstår der opregulering af målgenet.Opregulering af målgenet kan vendes eller justeres til det ønskede udtryksniveau ved at trække eller ændre koncentrationen af doxycyclin. For at opnå både undertrykkelse og aktivering kan Lac-repressor- og Tat-aktivatorsystemerne kombineres. For at ændre det gene, der er af interesse for undertrykkelse, bør der identificeres en transskriptionelt intron mod den fem primære ende af det pågældende gen med henblik på indsættelse af repronsekvensen.For at opnå den genomiske sekvens for genet af interesse, navigere til UCSC genom browser og vælge den seneste udkast til musen genom under genom fanen. Indtast navnet eller symbolet på det gen af interesse i søgefeltet for at se udskrifter for genet og klik derefter på gå. Vælg derefter den ønskede transskriptionsvariant for det pågældende gen, og klik på gensymbolet ved siden af udskriftsvarianten af interesse.Dernæst skal du klikke på det genomiske sekvenslink under sekvensen og links til værktøjer og databaser. For indstillinger for sekvenshentningsområde skal du kun vælge exoner, introer og standardposten FASTA pr. gen. For sekvensering formatering indstillinger, skal du vælge exons med store bogstaver, alt andet med små bogstaver og maske gentages til N.Then klik send.Gem til sidst denne sekvens, så du bevarer formateringen med store og små bogstaver i et dokument eller program, der kan kommenteres. For at undgå afbrydelse af CpG-øerne skal du vælge show for CpG-øernes spor under UCSC-genombrowserens udtryk og reguleringsbanner og klikke på Opdater. Zoome ind på de fem prime introner, skal du klikke på hver CpG ø vist med grønt, og vælg se DNA for denne funktion.Når du har valgt maskegenteringer til N, skal du klikke på få DNA for at få CpG-øernes sekvens. Endelig overlejrer disse sekvenser med den oprindelige sekvensfil, og anmærk disse som introniske områder for at undgå. Hvis du vil undgå introniske områder med forstærkersignaturer i interessevævet, skal du navigere til encode-databasen og vælge eksperimentikonet.For analysetypen skal du vælge ChiP-seq eller DNase-seq og udfylde de andre kategorier i henhold til de celler, der skal konstrueres. Når funktionen er markeret, skal du vælge det venstremest piktogram med blåt, for hvilket der vises vist resultater som liste. Vælg derefter datasættene for målene for h3k4 monomethylation, h3k27 acetylation, DNase 1 og CTCF, der bedst matchede de celler, der skal udvikles.Rul til filsektionen i hvert relevant datasæt, kontroller, at mm10 og UCSC er markeret, og klik på visualiser-knappen. Nu, i UCSC genom browser, zoome ind på de fem prime introner og klik på hver top i kommenterede peak spor. Få DNA-sekvensen for hver topregion ved at klikke på kromosomkoordinaterne for hver top.Vælg DNA i rullemenuen Vis, og klik på maskegentages til N.Endelig skal du overlejre disse sekvenser med den oprindelige sekvensfil og anmærke disse som intronic-områder for at undgå. Hvis du vil identificere et sgRNA i de resterende intronic-områder med høj specificitet og forudsagte effektivitetsresultater, skal du navigere til et online sgRNA-designværktøj efter eget valg, såsom CRISPOR. Angiv rækkefølgen af det introniske område af interesse, angiv det relevante referencegenom, og vælg det ønskede protospacer tilstødende motiv.Klik derefter på Send. Derefter sorteres de forudsagte sgRNA'er efter specificitetsscore, og vælg en eller flere sgRNA'er, der også har en høj forudsagt effektivitetsscore. Endelig designe en DNA-skabelon, der indeholder en PITT landing pad sekvens flankeret på begge sider af 60-base homologi arme, der svarer til sgRNA cut site.Til tilbageførsel af målgenslysning skal IPTG administreres i drikkevandet hos de homozygotavlede mus med den modificerede allel af interesse ved fuldt ud at opløse den ønskede mængde IPTG i sterilt destilleret vand på administrationsdagen. Pak flasken med folie ind og indgæng IPTG-vandet i en lysbeskyttet flaske til musene af den relevante genotype og kontroller i mindst en uge. Fortsæt med at analysere ekspressionen af genet af interesse i målvævet.For at fremkalde genet upregulation, administrere doxycyclin i kosten i en uge og gå videre til at analysere udtryk for genet af interesse i målvævet. qRT PCR anaylisis viste, at DNMT1-udtrykket blev undertrykt til 15 % af de uregulerede niveauer ved hjælp af den initiativtagerbaserede tilgang. Undertrykkelsen blev vendt på en dosisafhængig måde ved at behandle mus med varierende mængder IPTG.Den observerede DNMT1-undertrykkelse og tilbageførsel af DNMT1-undertrykkelse ved IPTG-behandling blev valideret på proteinniveau ved immunstaining. qRT PCR-analyse af mKate2-udtrykket viste, at den intronbaserede tilgang opnåede mere end 90 % undertrykkelse fra operatører, der var placeret flere kilobaser neden for transskriptionsstartstedet ved at dæmpe transskriptionsforlængelse. Konfokale billeder af mKate2-udtrykket i musenes lille intenstin med eller uden LacIGY-repressoren validerede den intronbaserede tilgang.Robust opregulering og nedregulering af DNMT1-udtrykket blev opnået i embryonale stamceller, der indeholder den modificerede endogene DNMT1-allel med Tat og Lac-operatorsekvenser. Begge regler var fuldt reversible og inducerende ved IPTG og Dox behandlinger. Stærk upregulering af DNMT1 blev observeret fra leveren, milten og nyrerne.Der blev imidlertid ikke observeret nogen påviselig opregulering i hjertet, hvilket tyder på, at det cellecyklusafhængige udtryksmønster dmnt1 og knapheden på proliferative celler i hjertet kan ligge til grund for denne observation. At studere in vivo-funktionen af et kritisk gen ved at manipulere dets udtryk har ofte været udfordrende på grund af dødelighed. Vores metode tillod os at overvinde den dødelige fænotype for vores gen af interesse og gjorde det muligt for os at studere sin rolle i tumorogenese in vivo.På samme måde vil denne teknologi gøre det muligt at undersøge andre vigtige gener, der har været vanskelige at studere.

Research

JoVE Journal

Genetics

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

In vitro-transskription Analyser og deres anvendelse i Drug Discovery

In vitro transcription assays have been developed and widely used for many years to study the molecular mechanisms involved in transcription. This process ...

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Genetisk Manipulation af afgroedesygdomme<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; At studere Fungal Biology og Plant Microbe Interactions

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the ...

Inducible T7 RNA Polymerase-mediated Multigene Expression System, pMGX

Inducerbart T7 RNA Polymerase-medieret Multigen Expressions System, pMGX

Co-expression of multiple proteins is increasingly essential for synthetic biology, studying protein-protein complexes, and characterizing and harnessing ...

Controllable Ion Channel Expression through Inducible Transient Transfection

Kontrollerbar Ion Channel Expression gennem Inducible Transient transfektion

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be ...

Studying Cell Cycle-regulated Gene Expression by Two Complementary Cell Synchronization Protocols

Studie af Cyklusreguleret Gen Expression af To Komplementære Celle Synkronisering Protokoller

The gene expression program of the cell cycle represents a critical step for understanding cell cycle-dependent processes and their role in diseases such ...

Production and Purification of Baculovirus for Gene Therapy Application

Produktion og oprensning af Baculovirus for genterapi ansøgning

Baculovirus has traditionally been used for the production of recombinant protein and vaccine. However, more recently, baculovirus is emerging as a ...

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

Manipulation af Ploidi i Caenorhabditis elegans

Mechanisms that involve whole genome polyploidy play important roles in development and evolution; also, an abnormal generation of tetraploid cells has ...

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

At udforske Root Microbiome: udtrække bakteriel Fællesskabets Data fra jord, rhizosfære og rod Endosphere

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...

Manipulation of Gene Function in Mexican Cavefish

Manipulation af genfunktioner i mexicansk Cavefish

Cave animals provide a compelling system for investigating the evolutionary mechanisms and genetic bases underlying changes in numerous complex traits, ...

Efficient Transcriptionally Controlled Plasmid Expression System for Investigation of the Stability of mRNA Transcripts in Primary Alveolar Epithelial Cells

Effektivt transskriptionelt plasmidekspressionssystem til undersøgelse af stabiliteten af mRNA-udskrifter i primære alveolære epitelceller

Studying posttranscriptional regulation is fundamental to understanding the modulation of a given messenger RNA (mRNA) and its impact on cell homeostasis ...