Name: in vivo application of the remote-control system for the manipulation of endogenous gene expression
Uploaded: 2019-03-29T14:00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In vivo Application of the REMOTE-control System for the Manipulation of Endogenous Gene Expression at JoVE.com

Wij danken de wijlen Dr. Heidi Scrable voor haar gulle gift van de zoogdieren lacI gene construct (Mayo Clinic, Rochester, MN), Dr Daniel Louvard (Institut Curie, Parijs, Frankrijk) voor het verstrekken van de promotor van de Villin, en Dr Laurie Jackson-Grusby (Children's Hospital, Boston, MA) voor haar bijdragen aan de vroege stadia van de technologieontwikkeling van deze. We zijn dankbaar voor Dr Nancy Wu en Dr. Robert Maxson voor hun hulp bij het genereren van de transgene en knockout muizen. Wij danken de leden van de Laird laboratorium voor nuttige discussies en ondersteunen. Dit werk werd gesteund door de National Institutes of Health [R01 CA75090, R01 DA030325 R01 CA157918 en R01 CA212374 te P.W.L. en 1F31CA213897-01A1 naar N.A.V.S].

PWL serveert op de wetenschappelijke Advisory Boards van AnchorDx en Progenity, Inc

Een kritieke stap en mogelijke beperking van het systeem van de afstandsbediening is de uitdaging die is gekoppeld aan het inbrengen van de onderdrukker en/of activator bandplaatsen zonder doel genexpressie. Onze oorspronkelijke benadering van de repressie, betrokken zoals toegepast op de Dnmt1 -gen, invoeging van lac -onderdrukker bandplaatsen in transcriptionally kritische gebieden van een promotor. Om het risico van invloed zijn op de functie van de promotor, en dus tot verbetering van de algemene toepasbaarheid van het systeem van de afstandsbediening, ontwikkelden we een repressie intron gebaseerde aanpak. De potentie van onze verbeterde lac systeem toegestaan ons te strak onderdrukken de transcriptie van de sterke initiatiefnemers we bij exploitanten gelegen getest honderden tot verscheidene kilobases stroomafwaarts van de transcriptie beginnen sites (Figuur 3A – C) 10. bovenal de niveaus van repressie waren onafhankelijk van de transcriptionele sterke punten van de initiatiefnemers (Figuur 3A – C)10. Dit suggereert dat de capaciteit van de repressie van onze intron gebaseerde onderdrukking systeem groter is dan de transcriptionele sterkte van de geteste initiatiefnemers. In deze intron gebaseerde benadering is het waarschijnlijk dat de repressie is bemiddeld door fysieke interferentie tussen twee componenten, de transcriptie rek machine en het lac repressors57. Dit eenvoudige onderdrukking mechanisme en de aangetoonde robuustheid van de intron gebaseerde methode kunnen betekenen dat deze aanpak in het algemeen regels tot verschillende genen, weefsels, en organismen.
De opregulatie door de afstandsbediening systeem vereist de transactivator bindende sequenties in de nabijheid van de target gene promotor, die dreigen van invloed zijn op de functie van de promotor. Echter vonden we dat betreffendedepositie van bindende sequenties buiten de transcriptionally kritische regio kunnen. Zowel Dnmt1 als EF1α de initiatiefnemers waren krachtig upregulated van tet exploitanten ligt een paar honderd honken stroomopwaarts van de transcriptie start sites10. Deze ontspannen beperking vermindert aanzienlijk de kans van invloed zijn op de functie van de promotor van een gen van de doelgroep in het ontbreken van de transactivator. Verhoging van het aantal bindende sequenties en/of gebruik van sterkere transactivators kon helpen verder het risico doordat opregulatie van sites verder weg van de transcriptie begin site.
Ons systeem afstandsbediening biedt elegante controle van het niveau, de timing en de locatie van de endogene genexpressie, waardoor voor het testen van de omkeerbaarheid van een fenotype en de gevolgen van andere expressie niveaus, die niet gemakkelijk haalbaar door huidige in vivo gen expressie-besturingstechnologieën. Het is belangrijk op te merken dat in de meeste gen expressie analyses, met inbegrip van onze, expressie waarden het gemiddelde van een bevolking van cellen vertegenwoordigen, waaronder aanzienlijke variatie kan worden gevonden. Deze heterogeniteit invloed kan hebben op cellulaire besluitvormingsprocessen, zoals differentiatie of apoptosis58. Hoewel de precisie van gen expressie controle kan waarschijnlijk verder worden verbeterd door extra genetische circuit engineering59, zal de waargenomen sterkte van ons huidige systeem nuttig onderzoek van de genfunctie in veel biologische contexten toestaan. Bovendien is een hoge mate van doel specificiteit verwachting vanwege de complexiteit van de sequenties die exploitant, alsmede de grote evolutionaire afstand tussen zoogdieren en de oorspronkelijke soorten de regelgevende onderdelen60. Bovendien kunnen transgene muis lijnen van repressors en activators worden ontwikkeld en werkzaam voor een endogene gen. Bestaande Muismodellen van de tet transactivator kunnen bijvoorbeeld worden aangepast opregulatie van een target-gen in de gewenste muis weefsels bereiken. Wij recent ontwikkelde een transgene lijn die robuust weefsel-specifieke uitdrukking van onze verbeterde lac-onderdrukker in meerdere weefseltypes (HLA rijden kan) in combinatie met bestaande Cre lijnen door de invoering van het lacIGY -gen in de locus Hipp11 48 onder de controle van een element van de Lox-STOP-Lox (niet uitgegeven). Deze regel zou aanzienlijk vergemakkelijken van de weefsel-specifieke toepassing van het systeem van de afstandsbediening.
Gene opregulatie door het afstandsbediening systeem biedt verschillende voordelen in vergelijking met de huidige afleidbare transgene benaderingen. Het vereist geen generatie van meerdere transgene lijnen om te testen voor de effecten van de positie van de invoegpositie, zoals het maakt gebruik van de endogene locus. Bovendien, is deze aanpak geschikt voor opregulatie van genen met sterke basislijn uitdrukking omdat het verbetert de expressie van een reeds robuuste promotor, overwegende dat conventionele transgene modellen op minimale virale initiatiefnemers vertrouwen. Tot slot, het weefsel specificiteit, celcyclus controle, egaliseren en lamineren varianten van een target-gen kunnen worden gehandhaafd op opregulatie door onze aanpak, daar het behoudt onderdelen van natuurlijke verordening zoals aangeboren cis-regelgevende elementen. De komst van CRISPR/Cas-gemedieerde gentargeting technologie zal aanzienlijk vergemakkelijken van de toepassing van deze technologie in verschillende modelsystemen.

Genetische knock-out of transgene benaderingen zijn effectieve middelen voor het bestuderen van de genfunctie in diermodellen. Expressie verordening door deze benaderingen is echter dichotome (aan/uit), niet-stoffelijke, en dus niet in staat is van het openbaren van het volledige functionele spectrum van een gen. Voorwaardelijke Cre/LoxP technologieën hebben toegestaan spatio-temporele inactiverings- of activering van de genfunctie, maar hun dichotome natuur blijft vormen van beperkingen, zoals de cel letaliteit en onomkeerbaarheid1,2 , 3. om deze leemte opvullen, voorwaardelijke vechtpartij benaderingen zijn ontwikkeld met behulp van tet-shRNA of miRNA4geregeld. Echter, af-target effecten blijven een zorg voor RNAi5 en hebben zijn uitdagend om te bepalen van in vivo. Meer recent, CRISPR/Cas-gemedieerde transcriptionele-besturingstechnologieën hebben ingevoerd een meer veelzijdige aanpak tot zowel up- en Downregulatie van endogene genexpressie en blijk gegeven van hun hulpprogramma's6,7 . De doeltreffendheid van de CRISPR/Cas-gemedieerde Transcriptionele controle is nog onduidelijk in vivo, en de omkeerbaarheid van KRAB gebaseerde onderdrukking blijft echter om gezien, zo sterk repressie door KRAB en haar interactie eiwit KAP1 gebleken voor het opwekken van permanente gene zwijgen8,9.
Om deze beperkingen, hebben we een nieuwe transcriptionele regelgevingssysteem kunnen voorwaardelijk regelen endogene genexpressie in een reversibele en afstembare wijze in muizen met behulp van gemanipuleerde prokaryote binaire transcriptionele toezicht-en regelgevingsstelsels10. Prokaryote binaire transcriptionele toezicht-en regelgevingsstelsels met regelgevende liganden, zoals lac en tet, dergelijke omkeerbare hebt ingeschakeld en afstembare expressie controle11,12,13, 14. echter de ontoereikende repressie potentie van de huidige binaire systemen hun brede goedkeuring voor het beheersen van de expressie van endogene genen in zoogdieren heeft belemmerd. We een verbeterde lac onderdrukking systeem voldoende krachtig voor de onderdrukking van endogene genen ontwikkeld en een nieuwe strategie van gerichte tet transcriptionele activators rechtstreeks naar de cognaat promotor van een endogene gen te bereiken in dienst robuuste opregulatie (Figuur 1)10. Met deze technologie, hebben wij bijna twee ordes van grootte expressie controle van het endogene Dnmt1 gen in een afstembare, afleidbare en omkeerbare wijze10bereikt. Hier bieden wij de stapsgewijze instructies voor de in vivo toepassing ervan op andere genen en organismen met behulp van muizen als een soort model.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59235/59235fig1.jpg"> Figuur 1 : Overzicht van de afstandsbediening systeem. De transcriptie van een endogene target-gen kan worden geregeld met behulp van gemanipuleerde lac -onderdrukker en tet activator systemen. De doelgroep gene promotor of intron is ontworpen om de exploitanten voor de strakke-bindende LacIGY onderdrukker en/of de rtbevatten TA-M2 activator. R geeft aan Repron (Repression introp), die 12 symmetrische lac operators (S) plus een gedeeltelijke konijn bèta-globin intron bevat. T geeft aan tet exploitant. De onderdrukker en/of activator is/van de promotor van een weefsel-specifieke worden uitgedrukt. De expressie van het target-gen kan vervolgens omkeerbaar afgestemd op het niveau van de gewenste expressie door toediening van IPTG (isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside, een antagonist van de onderdrukker LacIGY) of Doxycycline (Dox). Dit cijfer is gewijzigd van Lee et al.10<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59235/59235fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
Controleer voordat u begint met dit protocol, tabel 1 ter identificatie van de relevante stappen voor het gewenste besturingselement van genexpressie. Bijvoorbeeld, als u wilt een muis waarmee omkeerbare Downregulatie van "Gene X" ingenieur, voltooien secties 1, 3 en 4 van de onderstaande protocol. Tabel 1 bevat ook een overzicht van de benodigde componenten van het systeem van de afstandsbediening.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Gewenste expressie wijzigen</td>
			<td>Repressie alleen</td>
			<td>Activering alleen</td>
			<td>Zowel de repressie en de activering</td>
		</tr>
<tr>
<td>Relevante onderdelen van het Protocol</td>
			<td>1, 3-4</td>
			<td>2-4</td>
			<td>1-4</td>
		</tr>
<tr>
<td>Afstandsbediening volgorde nodig in Target-gen</td>
			<td>Repron ("Repressie intron"; 12 symmetrische lac operatoren plus een gedeeltelijke konijn bèta-globin intron)</td>
			<td>Tet exploitant(en)</td>
			<td>Repron en Tet exploitant(en)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Afstandsbediening reeks locatie</td>
			<td>Intron</td>
			<td>Promotor</td>
			<td>Intron & promotor</td>
		</tr>
<tr>
<td>Activator/onderdrukker die nodig zijn voor het gewenste besturingselement</td>
			<td>LacIGY onderdrukker</td>
			<td>rtTA-M2 Activator</td>
			<td>LacIGY onderdrukker en rtTA-M2 Activator</td>
		</tr>
<tr>
<td>Regelgevende liganden</td>
			<td>IPTG</td>
			<td>Doxycycline</td>
			<td>IPTG en/of Doxycycline</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: Overzicht van REMOTE-control componenten.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:715px;" width="715">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">B6C3F1/J</td>
			<td style="width:149px;">The Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:183px;">100010</td>
			<td style="width:167px;">https://www.jax.org/strain/100010</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cas9 Protein</td>
			<td style="width:149px;">PNA Bio</td>
			<td style="width:183px;">CP04</td>
			<td>http://www.pnabio.com/products/CRISPR_Cas9.htm?gclid=EAIaIQobChMIsoG8pLL33QIVBr7ACh0naQ4dEAAYAiAAEgKyHvD_BwE</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CRISPOR</td>
			<td>Haeussler et al. 2016</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td>http://crispor.tefor.net/</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Doxycycline-Containing Mouse Diet</td>
			<td style="width:149px;">Envigo</td>
			<td style="width:183px;">Varies by concentration</td>
			<td>https://www.envigo.com/products-services/teklad/laboratory-animal-diets/custom-research/doxycycline-diets/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ENCODE Database</td>
			<td style="width:149px;">Stanford University</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td>https://www.encodeproject.org/</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">iCre mRNA synthesis plasmid (pBBI)</td>
			<td style="width:149px;">Addgene</td>
			<td>65795</td>
			<td>https://www.addgene.org/65795/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">IPTG</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td style="width:183px;">I2481C</td>
			<td>https://www.goldbio.com/search?isSearch=Y&#38;q=iptg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">pGL3-Basic</td>
			<td style="width:149px;">Promega</td>
			<td style="width:183px;">E1751</td>
			<td>https://www.promega.com/products/reporter-assays-and-transfection/reporter-vectors-and-cell-lines/pgl3-luciferase-reporter-vectors/?catNum=E1751</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">SVM-BPfinder</td>
			<td style="width:149px;">Regulatory Genomics, Pompeu Fabra University</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td>http://regulatorygenomics.upf.edu/Software/SVM_BP/</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">TiProD: Tissue specific promoter Database</td>
			<td style="width:149px;">Department of Bioinformatics, UMG,&#160;University of G&#246;ttingen&#160;</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td>http://tiprod.bioinf.med.uni-goettingen.de</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">UCSC Genome Browser</td>
			<td style="width:149px;">University of California Santa Cruz</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td>https://genome.ucsc.edu/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo application of the remote-control system for the manipulation of endogenous gene expression

Hier beschrijven we een protocol voor de uitvoering van het systeem met afstandsbediening (Reversible Manipulation of TTranscription op Endogenous loci), dat voor controle van de omkeerbare en afstembare expressie van zorgt een endogene gen van belang in het leven model systemen. De afstandsbediening systeem maakt gebruik van verbeterde lac repressie en tet activeringssysteem down- of opregulatie van een target-gen binnen een enkele biologisch systeem te bereiken. Strakke repressie kan worden bereikt van onderdrukker bindend sites flexibel gelegen ver stroomafwaarts van een site start transcriptie door remming van de transcriptie rek. Robuuste opregulatie kan worden bereikt door verbetering van de transcriptie van een endogene gen door zich te richten tet transcriptionele activators aan de promotor cognaat. Dit besturingselement omkeerbaar en afstembare expressie kan worden toegepast en ingetrokken herhaaldelijk in organismen. De potentie en de veelzijdigheid van het systeem, zoals aangetoond voor de endogene Dnmt1 hier, zal toestaan nauwkeuriger in vivo functionele analyses door onderzoek van de genfunctie op verschillende niveaus van de expressie in te schakelen en door het testen van de omkeerbaarheid van een fenotype.

Het vermogen van de onderdrukking van de afstandsbediening systeem is aangetoond in twee verschillende benaderingen tot nu toe. In de eerste benadering, werden lac -onderdrukker bandplaatsen ingevoegd op de endogene promotor van het Dnmt1 -gen. In de tweede benadering, die wordt aanbevolen door dit protocol, werden de onderdrukker bandplaatsen ingevoegd in een stroomafwaartse intron om te voorkomen dat het potentiële risico van invloed op promotor functie door de invoegpositie en daarmee ter vereenvoudiging van de toepassing van de afstandsbediening systeem. Beide benaderingen resulteerde in de succesvolle onderdrukking (Figuur 2A, B en figuur 3A-C)10. Dnmt1 expressie werd onderdrukt tot 15% van de niet-gereglementeerde niveaus met behulp van de promotor gebaseerde benadering(Figuur 2). Deze strakke repressie ongedaan werd gemaakt op een dosis-afhankelijke manier door de behandeling van muizen met wisselende hoeveelheden van IPTG(Figuur 2). De waargenomen Dnmt1 repressie werd gevalideerd op het niveau van de eiwitten door immunokleuring (Figuur 2B). Wij deden niet waarnemen merkbaar verschil in Dnmt1 expressie tussen Dnmt1+/ + en Dnmt1LO/LO muizen, bevestigen dat onze lac exploitant invoeging normale promotor had niet worden verstoord functie10. De intron gebaseerde benadering bereikt meer dan 90% repressie van exploitanten gelegen verscheidene kilobases stroomafwaarts van de transcriptie start site door verzachtende transcriptie rek (Figuur 3A, B)10. Deze intron gebaseerde benadering was verder gevalideerd op zeven extra robuuste initiatiefnemers (Figuur 3C). Steevast strakke onderdrukking werd uit alle van de initiatiefnemers getest bereikt. Geen correlatie tussen de ontwikkelingsniveaus van de resterende expressie en de sterke punten van de initiatiefnemers werd waargenomen, wat suggereert dat de capaciteit van de repressie van onze intron gebaseerde onderdrukking systeem groter is dan de transcriptionele potentie van alle van de robuuste initiatiefnemers we getest () Figuur 3 C).
Het vermogen van de in vivo opregulatie van de afstandsbediening systeem werd ook aangetoond op het Dnmt1 -gen. Wij binnengebracht twee exemplaren van de tet exploitant in de Dnmt1 -promotor, samen met lac exploitant sequenties, te voorzien in opregulatie of Downregulatie afhankelijk van welke effector eiwit aanwezig is. Robuuste opregulatie en Downregulatie van Dnmt1 expressie, dicht bij twee ordes van grootte (10% tot 650%), werden bereikt in SER's met het gemodificeerde endogene Dnmt1 allel (Dnmt1LGT) (Figuur 4A)10 . Beide verordeningen werden volledig omkeerbaar en afleidbare door IPTG en Dox behandelingen, respectievelijk (Figuur 4A). Volgende introduceerden we de wijziging van de Dnmt1LGT in de kiemcellen van de muis voor het testen van het vermogen van de in vivo opregulatie van het systeem van de afstandsbediening. Sterke opregulatie van Dnmt1 werd waargenomen van de lever, milt en nieren, overwegende dat geen detecteerbare opregulatie in het hart werd waargenomen (Figuur 4B)7. Het patroon van de celcyclus-afhankelijke uitdrukking van Dnmt1 en de schaarste van proliferatieve cellen in het hart kunnen ten grondslag liggen aan deze observatie10,-56. Het valt nog te bezien of deze beperking kan worden overwonnen door het verhogen van het niveau van de expressie van de activator of het nummer van de bandplaatsen.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59235/59235fig2.jpg"> Figuur 2 : In vivo onderdrukking van Dnmt1 door de onderdrukker LacIGY. (A) muizen met lac exploitanten (LO) ingevoegd van de promotor van de Dnmt1 , met of zonder expressie van LacIGY, werden behandeld met verschillende doses van IPTG. qRT-PCR analyse van Dnmt1 expressie blijkt de dosis-afhankelijke omkering van Dnmt1 repressie in vivo door IPTG behandeling. Elke staaf vertegenwoordigt gegevens uit een andere muis. Gegevens vertegenwoordigen gemiddelde ± SEM (n = 3). (B) immunokleuring van Dnmt1 eiwitten in Colon crypten van muizen verstrekt drinkwater met of zonder 160 mM IPTG voor 3 weken. Dit cijfer is gewijzigd van Lee et al.10<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59235/59235fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59235/59235fig3.jpg"> Figuur 3 : In vivo en in vitro onderdrukking van verschillende initiatiefnemers door het systeem van de afstandsbediening. (A) een vroege versie van de Repron-reeks (R *) is ingevoegd in een intron stroomafwaarts van de promotor van de Villin in een transgene muis van Villin-mKate2 (VilmKate2). qRT-PCR analyse van mKate2 expressie in de dunne darm van muizen met of zonder de onderdrukker van de LacIGY wordt weergegeven. Elke staaf vertegenwoordigt gegevens uit een andere muis. (B) confocale mKate2 beelden van de dunne darm met en zonder LacIGY expressie. (C) zes symmetrische lac exploitanten (S) zijn ingevoegd tussen diverse initiatiefnemers en een luciferase verslaggever. Verslaggevers (50 ng/putje in 96-wells-plaat) en onderdrukker plasmiden werden Transient binnengebracht met NIH/3T3 cellen in een molaire verhouding van 1:1. Luciferase waarden werden beoordeeld 24u na transfectie. Deze in vitro gegevens vertegenwoordigen het percentage van luciferase meningsuiting in LacIGY-uiting geven aan cellen ten opzichte van die uiting geven aan niet-functionele LacI (NFlacI). T-tests werden gebruikt om te bepalen van de statistische significantie. Gegevens vertegenwoordigen gemiddelde ± SEM (n = 3). P ≤ 0,05, **P ≤ 0,01. Dit cijfer is gewijzigd van Lee et al.10<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59235/59235fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59235/59235fig4.jpg"> Figuur 4 : Down - en/of opregulatie van Dnmt1 expressie in vitro en in vivo. (A) het volledige afstandsbediening systeem werd ontworpen in gekweekte SER's door gene targeting en electroporation benaderingen. Maximale onderdrukking van Dnmt1 expressie werd bereikt met geen behandeling, terwijl de maximale activering werd bereikt door zowel de IPTG als de Dox behandeling. Gegevens vertegenwoordigen gemiddelde ± SEM (n = 3). P ≤ 0,05, **P ≤ 0,01 (Welch's t-tests). (B) In vivo activering van Dnmt1 door het systeem van de afstandsbediening, zoals blijkt uit immunokleuring van Dnmt1 eiwitten in verschillende weefsels van afstandsbediening muizen. Het allel LGT vertegenwoordigt promotor wijziging van Dnmt1 lac operator en tet activator bandplaatsen bevatten. Muizen werden behandeld met een normale of Dox-bevattende voeding (Doxycycline Hyclate 5000 mg/kg) gedurende één maand. Dit cijfer is gewijzigd van Lee et al.10<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59235/59235fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Supplementary Figure 1" src="/files/ftp_upload/59235/59235supfig1.jpg"> Aanvullende figuur 1 : Voorbeeld van de landing pad invoegen in lymfkliertest Dnmt1 intron 1. (A) schema van DNA sjabloon voor het aanlanden van pad inbrengen, aangepast van Quadros et al. (2015)31. Heterotypic loxP sites, JT15 en Lox2272, worden gescheiden door een opeenvolging van korte spacer (sp) en aan weerskanten geflankeerd door 60-bp van DNA dat homoloog aan de genomic regio van doel. (B) monster DNA sjabloon voor het aanlanden van pad invoegen in de Dnmt1 intron met behulp van de volgende sgRNA: CTAGTACCACTCCTGTACCG (die gericht is op de omgekeerde strand). De geselecteerde intronic regio was bioinformatically door stap 1.1 in kennis gesteld, en de sgRNA werd geïdentificeerd met behulp van CRISPOR29. (C) voorbeeld van PCR primer design voor de beoordeling van de invoeging van het stootkussen van de landing. PCR de inleidingen werden ontworpen buiten de homologie takken van de sjabloon te integreren endogene Dnmt1bevestigen. De amplicon van wildtype PCR is 213 bp; wordt op de invoegpositie, 291 bp. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59235/59235supfig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>

Watch this Scientific Journal Video about In vivo Application of the REMOTE-control System for the Manipulation of Endogenous Gene Expression at JoVE.com

In vivo Application of the REMOTE-control System for the Manipulation of Endogenous Gene Expression

In vivo toepassing van het systeem van de afstandsbediening voor de manipulatie van de endogene genexpressie

Dit protocol beschrijft de stappen die nodig zijn voor het genereren van een modelsysteem waarin de transcriptie van een endogene gen van belang voorwaardelijk kan worden gecontroleerd in de levende dieren of cellen met behulp van verbeterde lac -onderdrukker en/of tet activator systemen.

Here we describe a protocol for implementing the REMOTE-control system (Reversible Manipulation of Transcription at Endogenous loci), which allows for ...

De betekenis van onze methode is de veelzijdigheid en potentie. Het stelt onderzoekers in staat om robuuste controle over endogene genexpressie hebben op manieren die zijn uitdagend om te bereiken met behulp van bestaande methoden. Het stelt onderzoekers in staat om de functie van een gen te onderzoeken op verschillende expressieniveaus en op een spatio-temporele manier.Zo maakt het mogelijk om de omkeerbaarheid van een fenotype te testen, wat handig is bij het bestuderen van ziektegerelateerde genen. Om repressie te bereiken, is het doelgenintron ontworpen om repron R te bevatten, die 12 symmetrische lacoperators bevat. Wanneer de LacIGY-repressor wordt uitgedrukt uit de gewenste weefselspecifieke promotor, wordt het doelgen onderdrukt.De onderdrukking van het doelgen kan aan het gewenste uitdrukkingsniveau door beleid van IPTG, een antagonist van de repressor LacIGY worden omgekeerd of worden aangepast. Om upregulation te bereiken, is de beoogde genpromotor ontworpen om vier of meer Tat-operators, T, te bevatten als bindende locaties voor de rtTA-M2-activators. Wanneer de activator wordt uitgedrukt uit de gewenste weefselspecifieke promotor in aanwezigheid van doxycycline, wordt upregulatie van het doelgen geïnduceerd.Upregulatie van het doelgen kan worden teruggedraaid of aangepast aan het gewenste expressieniveau door de concentratie van doxycycline in te trekken of te wijzigen. Om zowel repressie als activering te bereiken, kunnen de Lac-drukpers- en Tat-activatorsystemen worden gecombineerd. Om het gen van belang voor repressie te wijzigen, moet een transcriptionally inert intron naar het vijfprimeeind van het gen van belang worden geïdentificeerd voor het inbrengen van de repronsequentie.Om de genomische sequentie voor het gen van belang te verkrijgen, navigeer je naar de UCSC genoombrowser en selecteer je het nieuwste ontwerp van het muisgenoom onder het tabblad genomen. Voer de naam of het symbool van het gen van belang in de zoekbalk in om de transcripties voor het gen te bekijken en klik op gaan. Selecteer vervolgens de gewenste transcriptievariant voor het gen van belang en klik op het gensymbool naast de transcriptievariant van belang.Klik vervolgens onder de reeks en koppelingen naar de banner tools en databases op de genomische sequentiekoppeling. Selecteer alleen exonen, introns en de standaardoptie FASTA-record per gen voor opties voor het ophalen van reeksen. Voor sequencing-opmaakopties selecteert u exonen in hoofdletters, al het andere in kleine letters en masker herhalingen naar N.Klik vervolgens op Verzenden.Sla ten slotte deze reeks op, waarbij de opmaak in de bovenste en onderste letters behouden blijft in een document of programma dat kan worden geannoteerd. Om onderbreking van de CpG-eilanden te voorkomen, selecteert u de show voor het cpg-eilandenspoor onder de expressie- en regelgevingsbanner van de UCSC-genoombrowser en klikt u op vernieuwen. Inzoomen op de vijf prime introns, klik op elk CpG-eiland dat in het groen wordt weergegeven en selecteer DNA bekijken voor deze functie.Na het selecteren van masker herhalingen naar N, klik op DNA om de CpG eilanden sequentie te verkrijgen. Tot slot, overlay deze sequenties met de oorspronkelijke sequentie bestand, en annoteren deze als intronic regio's te vermijden. Als u intronic-gebieden met versterkerhandtekeningen in de weefsels van belang wilt vermijden, gaat u naar de ENCODE-database en selecteert u het pictogram experimenten.Selecteer voor het testtype ChiP-seq of DNase-seq en vul de andere categorieën in op basis van de cellen die moeten worden ontworpen. Selecteer na functieselectie het meest linkse pictogram in het blauw, waarvoor de resultaten worden weergegeven als lijst. Selecteer vervolgens de gegevenssets voor de doelen van h3k4 monomethylatie, h3k27-acetylatie, DNase 1 en CTCF die het meest overeenkomen met de cellen die moeten worden ontworpen.Schuif in elke relevante gegevensset naar de bestandssectie, controleer of de mm10 en UCSC zijn geselecteerd en klik op de knop Visualiseren. Zoom nu in de UCSC genoombrowser in op de vijf priemgetallen en klik op elke piek in de geannoteerde pieksporen. Verkrijg de DNA-sequentie voor elk piekgebied door op de chromosomale coördinaten voor elke piek te klikken.Selecteer in het vervolgkeuzemenu weergave DNA en klik op maskerrehals naar N.Ten slotte overlay deze sequenties met het oorspronkelijke sequentiebestand en annoteren deze als intronic-gebieden om te vermijden. Om een sgRNA te identificeren in de resterende intronic regio's met een hoge specificiteit en voorspelde efficiëntiescores, navigeer je naar een online sgRNA-ontwerptool naar keuze, zoals CRISPOR. Voer de volgorde van het intronic-gebied van belang in, geef het relevante referentiegenoom op en selecteer het gewenste naast elkaar motief protospacer.Klik vervolgens op verzenden. Sorteer vervolgens de voorspelde sgRNA's op specificiteitsscore en selecteer een of meer sgRNA's die ook een hoge voorspelde efficiëntiescore hebben. Tot slot, ontwerp een DNA-sjabloon met een PITT landingsplatform sequentie geflankeerd aan beide zijden door 60-base homologie armen die overeenkomen met de sgRNA cut site.Voor omkering van de onderdrukking van doelgen, beheren IPTG in het drinkwater van de homozygoot gefokte muizen met de gewijzigde allel van belang door volledig oplossen van de gewenste hoeveelheid IPTG in steriel gedestilleerd water op de dag van toediening. Wikkel de fles met folie en beheer het IPTG-water in een licht beschermde fles aan de muizen van het juiste genotype en controleert gedurende ten minste een week. Ga over tot het analyseren van de expressie van het gen van belang in het doelweefsel.Om de gen upregulatie te induceren, toedient doxycycline in het dieet voor een week en ga over tot het analyseren van de expressie van het gen van belang in het doelweefsel. qRT PCR anaylisis toonde aan dat DNMT1 expressie werd onderdrukt tot 15% van de niet-gereglementeerde niveaus met behulp van de promotor-gebaseerde aanpak. De repressie werd op een dosisafhankelijke manier teruggedraaid door muizen met verschillende hoeveelheden IPTG te behandelen.De waargenomen DNMT1-onderdrukking en de omkering van DNMT1-onderdrukking door IPTG-behandeling werden op eiwitniveau gevalideerd door immunostaining. qRT PCR-analyse van mKate2-expressie toonde aan dat de intron-gebaseerde aanpak meer dan 90% repressie bereikte van exploitanten die zich meerdere kilobases stroomafwaarts van de transcriptiestartsite bevonden door transcriptieverlenging te verzachten. Confocale beelden van de mKate2 expressie in de kleine intenstine van de muizen met of zonder de LacIGY onderdrukker valideerden de intron-gebaseerde aanpak.Robuuste upregulatie en downregulatie van DNMT1 expressie werden bereikt in embryonale stamcellen met de gewijzigde endogene DNMT1 allel met Tat en Lac operator sequenties. Beide voorschriften waren volledig omkeerbaar en induceerbaar door IPTG en Dox behandelingen. Sterke upregulatie van DNMT1 werd waargenomen vanuit de lever, milt en nier.Er werd echter geen detecteerbare upregulatie in het hart waargenomen, wat suggereert dat het celcyclusafhankelijke expressiepatroon van DMNT1 en de schaarste van proliferative cellen in het hart aan deze observatie kunnen ten grondslag liggen. Het bestuderen van de in vivo functie van een kritisch gen door het manipuleren van de expressie is vaak uitdagend als gevolg van letaliteit. Onze methode stelde ons in staat om het dodelijke fenotype voor ons gen van belang te overwinnen en stelde ons in staat om zijn rol in tumorogenese in vivo te bestuderen.Ook deze technologie zal het mogelijk maken onderzoek van andere essentiële genen die moeilijk te bestuderen.

Research

JoVE Journal

Genetics

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

In vitro transcriptie Testen en hun toepassing in Drug Discovery

In vitro transcription assays have been developed and widely used for many years to study the molecular mechanisms involved in transcription. This process ...

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Genetische Manipulatie van de Plant Pathogeen<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; Om Fungal Biology and Plant Microbe Interactions Studie

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the ...

Inducible T7 RNA Polymerase-mediated Multigene Expression System, pMGX

Induceerbaar T7 RNA Polymerase-gemedieerde Multigene Expression System, pMGX

Co-expression of multiple proteins is increasingly essential for synthetic biology, studying protein-protein complexes, and characterizing and harnessing ...

Controllable Ion Channel Expression through Inducible Transient Transfection

Controleerbaar Ion Channel Expression door middel Induceerbare tijdelijke transfectie

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be ...

Studying Cell Cycle-regulated Gene Expression by Two Complementary Cell Synchronization Protocols

Het bestuderen van celcyclusreguleerde genuitdrukking door twee complementaire celsynchronisatieprotocollen

The gene expression program of the cell cycle represents a critical step for understanding cell cycle-dependent processes and their role in diseases such ...

Production and Purification of Baculovirus for Gene Therapy Application

Productie en zuivering van Baculovirus voor toepassing van de gentherapie

Baculovirus has traditionally been used for the production of recombinant protein and vaccine. However, more recently, baculovirus is emerging as a ...

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

Manipulatie van ploïdie in Caenorhabditis elegans

Mechanisms that involve whole genome polyploidy play important roles in development and evolution; also, an abnormal generation of tetraploid cells has ...

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

Verkennen van de wortel Microbiome: extraheren van gegevens van de bacteriële Gemeenschap uit de bodem, de rhizosfeer, en de wortel Endosphere

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...

Manipulation of Gene Function in Mexican Cavefish

Manipulatie van de genfunctie in Mexicaanse Cavefish

Cave animals provide a compelling system for investigating the evolutionary mechanisms and genetic bases underlying changes in numerous complex traits, ...

Efficient Transcriptionally Controlled Plasmid Expression System for Investigation of the Stability of mRNA Transcripts in Primary Alveolar Epithelial Cells

Efficiënt transcriptionally Gecontroleerd Plasmid Expression System voor onderzoek van de stabiliteit van mRNA Transcripts in primaire Alveolar EpitheelCellen

Studying posttranscriptional regulation is fundamental to understanding the modulation of a given messenger RNA (mRNA) and its impact on cell homeostasis ...