Name: in vivo application of the remote-control system for the manipulation of endogenous gene expression
Uploaded: 2019-03-29T14:00:00
Duration: 8 min 54 s
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Wir bedanken uns bei den späten Dr. Heidi Scrable für ihre großzügige Gabe von den Säugetieren LacI Genkonstrukt (Mayo Clinic, Rochester, MN), Dr. Daniel Louvard (Institut Curie, Paris, Frankreich) für die Bereitstellung der Villin-Promoter und Dr. Laurie Jackson-Grusby (Kinderklinik, Boston, MA) für ihre Verdienste um den frühen Stadien der Technologieentwicklung. Wir sind dankbar für Dr. Nancy Wu und Dr. Robert Maxson für ihre Unterstützung bei der Erzeugung transgenen und Knockout-Mäusen. Wir bedanken uns bei die Mitgliedern des Laird Labors für hilfreiche Gespräche und unterstützen. Diese Arbeit wurde von der National Institutes of Health [R01 CA75090, R01 DA030325 R01-CA157918 und R01 CA212374, P.W.L. und 1F31CA213897-01A1, N.A.V.S] unterstützt.

PWL dient auf der Scientific Advisory Boards von AnchorDx und Progenity, Inc.

Ein wichtiger Schritt und mögliche Einschränkung des REMOTE-Control-Systems ist die Herausforderung, verbunden mit dem Einführen der Repressor bzw. Aktivator Bindungsstellen ohne Ziel Genexpression. Unsere ursprüngliche Unterdrückung Ansatz involviert, da auf das Dnmt1 gen angewendet Einfügen von Lac Repressor Bindungsstellen innerhalb transcriptionally kritischen Regionen eines Promotors. Zur Verringerung des Risikos des Projektträgers Funktion beeinträchtigen und damit zu verbessern die allgemeine Anwendbarkeit der REMOTE-Steuerung, entwickelten wir einen Unterdrückung Intron-basierten Ansatz. Die Wirkstärke von unserem erweiterten Lac -System erlaubt uns, fest die Transkription der starke Promotoren unterdrücken wir bei Betreibern befindet sich getestet hundert bis zu mehreren Kilobases flussabwärts der Transkription beginnen Websites (Abbildung 3A – C) 10. wichtig ist, das Niveau der Unterdrückung wurden unabhängig von transkriptionellen Stärken der Promotoren (Abbildung 3A – C)10. Dies deutet darauf hin, dass die Repression Kapazität unseres Repression Intron-basierten Systems die transkriptionelle Stärke der getesteten Promotoren übersteigt. In diesem Intron-basierten Ansatz ist es wahrscheinlich, dass die Unterdrückung durch körperliche Störungen zwischen zwei Komponenten, die Dehnung Transkriptionsmaschinerie und Lac Repressoren57vermittelt wird. Dieser einfache Unterdrückung Mechanismus und die nachgewiesene Robustheit der Intron-basierte Methode können dieser Ansatz generell für verschiedene Gene, Geweben und Organismen machen.
Die Hochregulation von der REMOTE-Steuerung erfordert die Transaktivator Bindung Sequenzen in der Nähe der Ziel-gen-Veranstalter, die eine Gefahr der Projektträger Funktion beeinträchtigen. Allerdings haben wir festgestellt, dass die Position der verbindlichen Sequenzen außerhalb der transcriptionally kritische Region sein kann. Dnmt1 und EF1α Projektträger waren robust hochreguliert Tet Postbetreibern befindet sich ein paar hundert Basen stromaufwärts der Transkription Start Seiten10. Diese entspannte Einschränkung reduziert die Chance der Projektträger Funktion des Zielgens in Ermangelung der Transaktivator beeinträchtigen. Erhöhung der Zahl der Bindung-Sequenzen und/oder Verwendung von stärkeren Transactivators könnte helfen, weiter zu reduzieren das Risiko durch Hochregulation von Websites weiter entfernt von der Transkription Startsite aktivieren.
Unser REMOTE-Control-System bietet elegante Kontrolle über die Höhe, Zeitpunkt und Ort der endogenen Genexpression, so dass für die Prüfung der Reversibilität des Phänotyps und die Folgen eines anderen Ausdruck Niveaus, die nicht ohne weiteres erreichbar sind aktuelle in-vivo-Expressions Gentechnologien. Es ist wichtig zu beachten, dass in den meisten Genexpressionsanalysen, einschließlich der unsrigen, Ausdruckswerte im Durchschnitt von einer Bevölkerung der Zellen repräsentieren unter denen erhebliche Unterschiede gefunden werden kann. Diese Heterogenität beeinflussen zellulären Entscheidungsprozesse, wie Differenzierung oder Apoptose58. Wenn die Genauigkeit der gen-Expressions durch zusätzliche genetische Schaltung engineering59wahrscheinlich weiter verbessert werden könnte, ermöglicht die beobachteten Wirksamkeit von unserem derzeitigen System nützliche Untersuchung der Genfunktion in vielen biologischen zusammenhängen. Darüber hinaus wird ein hohes Maß an Ziel-Spezifität aufgrund der Komplexität der die Operator-Sequenzen sowie der großen evolutionären Abstand zwischen Säugetieren und die ursprünglichen Arten der regulatorische Komponenten60erwartet. Darüber hinaus können transgene Mauslinien Repressors und Aktivatoren entwickelt und für jedes endogenen gen eingesetzt werden. Zum Beispiel können bestehende Tet Transaktivator Mausmodellen um Hochregulation von Zielgen in den gewünschten Maus Geweben zu erreichen angepasst werden. Kürzlich entwickelten wir eine transgene Linie, die robuste gewebespezifischen Ausdruck unserer verstärkten Lac Repressor in mehrere Gewebetypen durch die Einführung des LacIGY -Gens in der Hipp11 Locus48 in Kombination mit bestehenden Cre-Linien fahren kann unter der Kontrolle eines Lox-STOP-Lox-Elements (unveröffentlicht). Dieser Linie würde die gewebespezifischen Anwendung von REMOTE-Control-System erheblich erleichtern.
Gen Hochregulation von der REMOTE-Steuerung bietet mehrere Vorteile im Vergleich zu aktuellen induzierbaren transgene Ansätze. Es erfordert keine Generation von mehrere transgene Linien für Positionseffekte der Insertion, zu testen, wie es die endogenen Locus nutzt. Darüber hinaus eignet sich dieser Ansatz für Hochregulierung von Genen mit starken Grundlinie Ausdruck weil es Ausdruck von einem bereits stabile Promoter verbessert während herkömmliche transgene Modelle auf minimale virale Promotoren verlassen. Zu guter Letzt das Gewebe Spezifität, Zellzyklus Kontrolle und Spleißen Varianten eines Ziel-Gens können beibehalten werden auf Hochregulation von unserem Ansatz, wie es Elemente der natürlichen Regulierung wie angeborene GUSbewahrt-regulatorischen Elementen. Das Aufkommen der CRISPR/Cas-mediated Gene-targeting-Technologie wird die Anwendung dieser Technologie in verschiedenen Modellsysteme erheblich erleichtern.

Genetischen Ko oder transgene Ansätze wurden wirksame Mittel Genfunktion in Tiermodellen zu studieren. Jedoch Ausdruck Regulierung durch diese Ansätze ist dichotom (ein/aus), nichtzeitlichen, und so ist nicht in der Lage das komplette Funktionsspektrum eines Gens zu enthüllen. Bedingte Cre/LOxP Technologien haben räumlich-zeitliche Inaktivierung oder Aktivierung der Genfunktion zugelassen, aber ihre dichotomen Natur weiterhin Einschränkungen, z. B. Zelle Letalität und Irreversibilität1,2 , 3. um diese Lücke zu füllen, bedingte Knockdown Ansätze wurden entwickelt mit Tet-ShRNA oder MiRNA4geregelt. Ein Anliegen für RNAi5 bleiben jedoch Ziel Effekte und haben eine Herausforderung wurde, Steuern in-vivo. Vor kurzem haben CRISPR/Cas-vermittelten transkriptionellen-Steuerungstechnik führte einen vielseitigeren Ansatz zur Erreichung sowohl up- und Downregulation der endogenen Genexpression und demonstriert ihre Dienstprogramme6,7 . CRISPR/Cas-vermittelten transkriptionellen Kontrolle ist noch unklar, in Vivo und die Reversibilität der KRAB-basierte Unterdrückung bleibt jedoch zu gesehen, wie starke Unterdrückung durch KRAB und seine interagierenden Proteins KAP1 hat gezeigt, dass induzieren permanente Gen-silencing-8,9.
Um diese Einschränkungen zu beheben, haben wir ein neuartiges transkriptionelle regulatorische System in der Lage bedingt kontrollieren endogene Genexpression in eine Reversible und abstimmbaren Weise bei Mäusen mit engineered transkriptionelle prokaryotische Binär Regulierungssysteme10. Prokaryotische binäre transkriptionelle Regelungssysteme mit regulatorischen Liganden wie Lac und Tet, konnten solche reversibel und abstimmbaren Ausdruck Steuern11,12,13, 14. jedoch die unzureichende Unterdrückung Potenz des aktuellen binären Systemen hat ihre breite Akzeptanz für die Steuerung der endogenen Genexpression bei Säugetieren behindert. Wir eine verbesserte Lac Unterdrückung System ausreichend potenten für die Unterdrückung der endogenen Genen entwickelt und verwendet eine neuartige Strategie des Zielens Tet transcriptional Aktivatoren direkt an den cognate Promotor des endogenen Gens zu erreichen robuste Hochregulation (Abbildung 1)10. Mit dieser Technologie haben wir fast zwei Größenordnungen Expressions des endogenen Dnmt1 Gens in einer einstellbaren, induzierbaren und reversible Weise10erreicht. Hier bieten wir schrittweise Anleitungen für die in-vivo Anwendung auf andere Gene und Organismen mit Hilfe von Mäusen als Modell Spezies.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59235/59235fig1.jpg"> Abbildung 1 : Überblick über die Fernsteueranlage. Die Transkription des Zielgens eine endogene kann mit veränderter Lac Repressor und Tet Aktivator Systeme reguliert werden. Das Ziel gen Promoter oder Intron wurde entwickelt, um Operatoren für die feste Bindung LacIGY Repressor und/oder rtenthalten TA-M2-Aktivator. R steht für Repron (RepSitzung Intrauf), plus eine partielle Kaninchen Beta-Globin Intron enthält 12 symmetrische Lac Operatoren (S). T zeigt Tet Operator. Der Repressor und/oder Aktivator ist/sind von gewebespezifischen Promoter ausgedrückt. Der Ausdruck des Zielgens kann dann reversibel die gewünschte Expression durch Gabe von IPTG (Isopropyl-β-D-1-Thiogalactopyranoside, ein Antagonist von der LacIGY-Repressor) oder Doxycyclin (Dox) abgestimmt werden. Diese Zahl wurde von Lee Et Al.10geändert<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59235/59235fig1large.jpg" target="_blank">Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.</a>
Überprüfen Sie vor Beginn dieses Protokolls, Tabelle 1 , um die entsprechenden Schritte für die gewünschte Kontrolle der Genexpression zu identifizieren. Z. B. um eine Maus Ingenieur, die reversible Herabregulation der "Gen X" ermöglicht, abschließen, Abschnitte 1, 3 und 4 von den unter Protokoll. Tabelle 1 fasst auch die benötigten Komponenten der Fernsteueranlage.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Gewünschten Ausdruck ändern</td>
			<td>Repression nur</td>
			<td>Aktivierung nur</td>
			<td>Repression und Aktivierung</td>
		</tr>
<tr>
<td>Jeweiligen Abschnitten des Protokolls</td>
			<td>1, 3 und 4</td>
			<td>2-4</td>
			<td>1-4</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fernbedienung Sequenz in Zielgen benötigt</td>
			<td>Repron ("Repression Intron"; 12 symmetrische Lac Operatoren plus eine partielle Kaninchen Beta-Globin Intron)</td>
			<td>Tet Ortbestimmung</td>
			<td>Repron und Tet Ortbestimmung</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fernbedienung Sequenz Lage</td>
			<td>Intron</td>
			<td>Veranstalter</td>
			<td>Intron & Promoter</td>
		</tr>
<tr>
<td>Aktivator/Repressor für gewünschte Steuerelement benötigt</td>
			<td>LacIGY Repressor</td>
			<td>RtTA-M2-Aktivator</td>
			<td>LacIGY Repressor und RtTA-M2-Aktivator</td>
		</tr>
<tr>
<td>Regulatorischen Liganden</td>
			<td>IPTG</td>
			<td>Doxycyclin</td>
			<td>IPTG und/oder Doxycyclin</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1: Überblick über REMOTE-Control-Komponenten.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:715px;" width="715">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">B6C3F1/J</td>
			<td style="width:149px;">The Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:183px;">100010</td>
			<td style="width:167px;">https://www.jax.org/strain/100010</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cas9 Protein</td>
			<td style="width:149px;">PNA Bio</td>
			<td style="width:183px;">CP04</td>
			<td>http://www.pnabio.com/products/CRISPR_Cas9.htm?gclid=EAIaIQobChMIsoG8pLL33QIVBr7ACh0naQ4dEAAYAiAAEgKyHvD_BwE</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CRISPOR</td>
			<td>Haeussler et al. 2016</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td>http://crispor.tefor.net/</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Doxycycline-Containing Mouse Diet</td>
			<td style="width:149px;">Envigo</td>
			<td style="width:183px;">Varies by concentration</td>
			<td>https://www.envigo.com/products-services/teklad/laboratory-animal-diets/custom-research/doxycycline-diets/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ENCODE Database</td>
			<td style="width:149px;">Stanford University</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td>https://www.encodeproject.org/</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">iCre mRNA synthesis plasmid (pBBI)</td>
			<td style="width:149px;">Addgene</td>
			<td>65795</td>
			<td>https://www.addgene.org/65795/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">IPTG</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td style="width:183px;">I2481C</td>
			<td>https://www.goldbio.com/search?isSearch=Y&#38;q=iptg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">pGL3-Basic</td>
			<td style="width:149px;">Promega</td>
			<td style="width:183px;">E1751</td>
			<td>https://www.promega.com/products/reporter-assays-and-transfection/reporter-vectors-and-cell-lines/pgl3-luciferase-reporter-vectors/?catNum=E1751</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">SVM-BPfinder</td>
			<td style="width:149px;">Regulatory Genomics, Pompeu Fabra University</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td>http://regulatorygenomics.upf.edu/Software/SVM_BP/</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">TiProD: Tissue specific promoter Database</td>
			<td style="width:149px;">Department of Bioinformatics, UMG,&#160;University of G&#246;ttingen&#160;</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td>http://tiprod.bioinf.med.uni-goettingen.de</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">UCSC Genome Browser</td>
			<td style="width:149px;">University of California Santa Cruz</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td>https://genome.ucsc.edu/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo application of the remote-control system for the manipulation of endogenous gene expression

Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Implementierung des REMOTE-Control Systems (Rereversiblen MAnipulation of TRanscription an ENdogenous Loci), reversibel und abstimmbaren Ausdruck Kontrolle ermöglicht eine endogenen gen des Interesses an lebenden Modellsysteme. Die Fernsteueranlage beschäftigt erweiterte Lac Repression und Tet Aktivierung Systeme, Down- oder Hochregulation des Zielgens innerhalb eines biologischen Systems zu erreichen. Engen Unterdrückung erreicht werden, von Repressor Bindungsstellen flexibel befindet sich weit hinter der eine Transkription Startsite durch Hemmung der Transkription Dehnung. Robuste Hochregulation kann erreicht werden, durch die Stärkung der Transkription des endogenen Gens durch gezielte Tet transcriptional Aktivatoren für den cognate Projektträger. Diese reversible und abstimmbaren Expressions kann angewendet und in Organismen immer wieder zurückgezogen. Die Potenz und die Vielseitigkeit des Systems, wie für endogene Dnmt1 hier ermöglicht präzisere in-vivo Funktionsanalysen durch Untersuchung der Genfunktion auf verschiedenen Ebenen der Ausdruck aktivieren und testen die Reversibilität der eine Phänotyp.

Die Fähigkeit, Unterdrückung der REMOTE-Control-System wurde bisher in zwei verschiedene Ansätze nachgewiesen. Bei dem ersten Ansatz wurden Lac Repressor Bindungsstellen an der endogenen Promoter des Gens Dnmt1 eingefügt. Im zweiten Ansatz, der durch dieses Protokoll empfohlen wird, waren eine nachgeschaltete Intron potenzielle Förderer Funktion zu beeinträchtigen, durch die Einfügung zu vermeiden und damit zur Erleichterung der Anwendung der Fernbedienung Repressor-Bindungsstellen eingefügt. System. Beide Ansätze führte erfolgreiche Unterdrückung (Abbildung 2A, B und Abbildung 3A-C)10. Dnmt1 Ausdruck wurde auf 15 % der unregulierten Ebenen mit dem Promotor-basierte Ansatz (Abb. 2A) unterdrückt. Diese engen Unterdrückung wurde in einer Dosis-abhängigen Weise umgekehrt, durch Behandlung von Mäusen mit unterschiedlichen Mengen von IPTG (Abb. 2A). Die beobachteten Dnmt1 Unterdrückung wurde auf Proteinebene von Immunostaining (Abbildung 2B) validiert. Wir waren nicht darauf bedacht, keine merklichen Unterschied in Dnmt1 Ausdruck zwischen Dnmt1+ / + und Dnmt1LO/LO -Mäuse, bestätigt, dass unsere Lac -Operator einfügen nicht normal Promotor gestört hatte Funktion10. Die Intron-basierten Ansatz erreicht mehr als 90 % Unterdrückung von Betreibern liegt mehrere Kilobases stromabwärts von der Transkription Startsite mildernde Transkription Dehnung (Bild 3A, B)10. Diese Intron-basierten Ansatz wurde weiter auf sieben weitere robuste Promotoren (Abb. 3C) validiert. Immer eng Repression wurde von allen die Promotoren getestet erreicht. Keine Korrelation zwischen den verbleibenden Ausdruck und die Stärken der Förderer wurde beobachtet, was darauf hindeutet, dass die Repression Kapazität unseres Repression Intron-basierten Systems die transkriptionelle Potenz aller von der robusten Promotoren übersteigt wir getestet () Abbildung 3 ( C).
Die Fähigkeit, in-vivo Hochregulation der REMOTE-Control-System zeigte sich auch auf dem Dnmt1 gen. Wir führten zwei Kopien des Operators Tet in Dnmt1 Promotor, zusammen mit Lac -Operator-Sequenzen zu ermöglichen, entweder Hochregulation oder Downregulation, je nachdem, welche Effektor Protein vorhanden ist. Robuste Hochregulation und Downregulation der Dnmt1 Ausdruck, in der Nähe von zwei Größenordnungen (10 % bis 650 %) wurden in WSR, enthält das modifizierte endogene Dnmt1 Allel (Dnmt1LGT) (Abb. 4A) erreicht10 . Beide Verordnungen waren vollständig reversibel und induzierbaren durch IPTG und Dox Behandlungen bzw. (Abb. 4A). Als nächstes haben wir die Dnmt1LGT Änderung in der Maus Keimbahn, die Fähigkeit, in-vivo Hochregulation der Fernsteueranlage testen eingeführt. Starke Hochregulation der Dnmt1 wurde von Leber, Milz und Niere, beobachtet, während keine nachweisbaren Hochregulation im Herzen (Abbildung 4B)7beobachtet wurde. Der Zellzyklus-abhängiges Expressionsmuster der Dnmt1 und der Knappheit der proliferativen Zellen im Herzen können diese Beobachtung10,56zugrunde liegen. Es bleibt abzuwarten, ob diese Einschränkung überwunden werden kann, durch die Erhöhung der Expression der Aktivator oder die Anzahl von seinen Bindungsstellen.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59235/59235fig2.jpg"> Abbildung 2 : In vivo Unterdrückung der Dnmt1 durch die LacIGY-Repressor. (A) Mäuse mit Lac Operatoren (LO) in der Dnmt1 -Veranstalter, mit oder ohne Ausdruck des LacIGY, eingefügt mit verschiedenen Dosen von IPTG behandelt wurden. qRT-PCR Analyse der Dnmt1 Ausdruck zeigt die dosisabhängige Umkehrung der Dnmt1 Repression in-vivo durch IPTG Behandlung. Jeder Balken repräsentiert Daten aus eine andere Maus. Darstellung von Daten Mittelwert ± SEM (n = 3). (B) Immunostaining Dnmt1 Proteins im Kolon Krypten von Mäusen lieferte Trinkwasser mit oder ohne 160 mM IPTG für 3 Wochen. Diese Zahl wurde von Lee Et Al.10geändert<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59235/59235fig2large.jpg" target="_blank">Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59235/59235fig3.jpg"> Abbildung 3 : In vivo und in-vitro-Unterdrückung der verschiedenen Promotoren von der REMOTE-Steuerung. (A) eine frühe Version der Repron-Sequenz (R *) wurde in einem Intron stromabwärts des Veranstalters Villin in einer Villin-mKate2 transgenen Maus (VilmKate2) eingefügt. qRT-PCR-Analyse des mKate2 Ausdrucks im Dünndarm von Mäusen mit oder ohne LacIGY -Repressor wird angezeigt. Jeder Balken repräsentiert Daten aus eine andere Maus. (B) konfokale mKate2 Bilder des Dünndarms mit und ohne LacIGY Ausdruck. (C) sechs symmetrische Lac Operatoren (S) wurden zwischen verschiedenen Promotoren und Luciferase Reporter eingefügt. Reporter (50 ng/Well in 96-Well-Platte) und Repressor Plasmide wurden vorübergehend in NIH/3 t 3 Zellen in einem Molverhältnis von 1:1 eingeführt. Luciferase Werte wurden bewertet 24 h nach Transfektion. Diese in-vitro-Daten repräsentieren die Prozent der Luciferase Ausdruck in LacIGY-Zellen im Vergleich zu denen mit dem Ausdruck nicht-funktionale LacI (NFlacI) zum Ausdruck zu bringen. T-Tests wurden verwendet, um statistische Signifikanz bestimmen. Darstellung von Daten Mittelwert ± SEM (n = 3). P ≤ 0,05, **P ≤ 0,01. Diese Zahl wurde von Lee Et Al.10geändert<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59235/59235fig3large.jpg" target="_blank">Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59235/59235fig4.jpg"> Abbildung 4 : Down - und/oder Hochregulation der Dnmt1 Ausdruck in vitro und in vivo. (A) das komplette REMOTE-Control-System wurde in kultivierten WSR durch Gene targeting und Elektroporation Ansätze entwickelt. Maximale Unterdrückung der Dnmt1 Ausdruck wurde ohne Behandlung erreicht, während die maximale Aktivierung durch IPTG und Dox Behandlung erzielt wurde. Darstellung von Daten Mittelwert ± SEM (n = 3). P ≤ 0,05, **P ≤ 0,01 (Welch es t-Tests). (B) In vivo Aktivierung der Dnmt1 durch die Fernsteueranlage wie Immunostaining Dnmt1 Protein in verschiedenen Geweben von REMOTE-Control-Mäusen gezeigt. Die LGT -Allel stellt Promotor Änderung der Dnmt1 , Lac -Operator und Tet Aktivator Bindungsstellen enthalten. Mäuse wurden einen Monat lang mit einer normalen oder Dox-haltige Ernährung (5000 mg/kg Doxycycline Hyclate) behandelt. Diese Zahl wurde von Lee Et Al.10geändert<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59235/59235fig4large.jpg" target="_blank">Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Supplementary Figure 1" src="/files/ftp_upload/59235/59235supfig1.jpg"> Zusätzliche Abbildung 1 : Beispiel der landing Pad einfügen in murinen Dnmt1 Intron 1. (A) schematische Darstellung der DNA Schablone für landing Pad einlegen, adaptiert von Quadros Et Al. (2015)31. Zellkulturmodells LoxP -Websites, JT15 und Lox2272, sind getrennt durch eine kurze Abstandhalter-Sequenz (sp) und 60-bp DNA, die homolog zu der genomischen Zielregion ist auf jeder Seite flankiert. (B) Probe DNA Schablone für landing Pad einfügen in der Dnmt1 Intron mithilfe der folgenden SgRNA: CTAGTACCACTCCTGTACCG (die umgekehrten Strang Ziele). Die ausgewählte intronischen Region war Bioinformatically für Schritt 1.1 informiert, und die SgRNA wurde durch CRISPOR29identifiziert. (C) Beispiel für PCR Primer Design für die Beurteilung der Einfügung der Landeplatz. PCR-Primer wurden außerhalb der Homologie Wappen der Vorlage entwickelt, um die Integration in endogene Dnmt1bestätigen. Der Wildtyp-PCR-Amplifikate ist 213 bp; beim Einfügen, wird es 291 BP. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59235/59235supfig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

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In vivo Application of the REMOTE-control System for the Manipulation of Endogenous Gene Expression

In-vivo Anwendung der REMOTE-Steuerung für die Manipulation von endogenen Genexpression

Dieses Protokoll beschreibt die Schritte erforderlich, um ein Modellsystem, in dem die Transkription des endogenen Gens von Interesse bedingt gesteuert werden kann, in lebenden Tieren oder Zellen mit verstärkten Lac Repressor und/oder Tet Aktivator Systeme generieren.

Here we describe a protocol for implementing the REMOTE-control system (Reversible Manipulation of Transcription at Endogenous loci), which allows for ...

Die Bedeutung unserer Methode ist ihre Vielseitigkeit und Potenz. Es ermöglicht Forschern eine robuste Kontrolle über die endogene Genexpression in einer Weise, die mit bestehenden Methoden schwierig zu erreichen war. Es ermöglicht Forschern, die Funktion eines Gens auf verschiedenen Expressionsebenen und auf räumlich-zeitliche Weise zu untersuchen.So ermöglicht es, die Reversibilität eines Phänotyps zu testen, was beim Studium von krankheitsbedingten Genen nützlich ist. Um Repression zu erreichen, wird das Zielgen Intron entwickelt, um Repron R zu enthalten, das 12 symmetrische Lac-Operatoren enthält. Wenn der LacIGY-Repressor vom gewünschten gewebespezifischen Promotor exprimiert wird, wird das Zielgen unterdrückt.Die Unterdrückung des Zielgens kann durch Verabreichung von IPTG, einem Antagonisten des LacIGY-Repressors, umgekehrt oder an die gewünschte Expressionsstufe angepasst werden. Um eine Upregulation zu erreichen, ist der Zielgenpromotor so konzipiert, dass er vier oder mehr Tat-Operatoren, T, als Bindungsstellen für die rtTA-M2-Aktivatoren enthält. Wenn der Aktivator vom gewünschten gewebespezifischen Promotor in Gegenwart von Doxycyclin exprimiert wird, wird eine Upregulation des Zielgens induziert.Die Upregulation des Zielgens kann umgekehrt oder an die gewünschte Expressionsstufe angepasst werden, indem die Konzentration von Doxycyclin zurückgezogen oder verändert wird. Um sowohl Repression als auch Aktivierung zu erreichen, können die Lac-Repressor- und Tat-Aktivatorsysteme kombiniert werden. Um das Gen von Interesse für Repression zu modifizieren, sollte ein transkriptionsweise inertes Intron in Richtung des fünf Hauptendes des Gens von Interesse für die Einfügung der Repron-Sequenz identifiziert werden.Um die genomische Sequenz für das gen von Interesse zu erhalten, navigieren Sie zum UCSC-Genombrowser und wählen Sie den neuesten Entwurf des Mausgenoms unter der Registerkarte Genome aus. Geben Sie den Namen oder das Symbol des gens von Interesse in die Suchleiste ein, um die Transkripte für das Gen anzuzeigen, und klicken Sie dann auf "Gehen". Wählen Sie dann die gewünschte Transkriptvariante für das gen von Interesse aus und klicken Sie auf das Gensymbol neben der Transkriptvariante von Interesse.Als nächstes, unter der Sequenz und Links zu Werkzeugen und Datenbanken Banner, klicken Sie auf die genomische Sequenz Link. Wählen Sie für Sequenzabrufbereichsoptionen nur Exons, Introns und den standardmäßigen FASTA-Datensatz pro Gen aus. Um Formatierungsoptionen zu sequenzieren, wählen Sie Exons in Großbuchstaben, alles andere in Kleinbuchstaben und Maskenwiederholungen an N.Dann klicken Sie auf Absenden.Speichern Sie schließlich diese Sequenz, wobei die Groß- und Kleinschreibung in einem Dokument oder Programm beibehalten wird, das mit Anmerkungen beschriftet werden kann. Um eine Unterbrechung der CpG-Inseln zu vermeiden, wählen Sie show for the CpG islands track unter dem Ausdrucks- und Regelbanner des UCSC-Genombrowsers aus und klicken Sie auf Aktualisieren. Wenn Sie auf die fünf Prime-Introns zoomen, klicken Sie auf jede grün dargestellte CpG-Insel, und wählen Sie DNA für diese Funktion anzeigen aus.Nachdem Sie die Maskenwiederholungen auf N ausgewählt haben, klicken Sie auf DNA abrufen, um die Sequenz der CpG-Inseln zu erhalten. Schließlich überlagern Sie diese Sequenzen mit der ursprünglichen Sequenzdatei und kommentieren Diese als intronic-Regionen, um diese zu vermeiden. Um intronic-Regionen mit Enhancer-Signaturen in den geweben von Interesse zu vermeiden, navigieren Sie zur ENCODE-Datenbank und wählen Sie das Experimentsymbol aus.Wählen Sie für den Assay-Typ ChiP-seq oder DNase-seq aus, und füllen Sie die anderen Kategorien entsprechend den zu entwickelnden Zellen aus. Wählen Sie nach der Feature-Auswahl das linke Piktogramm in blau aus, für das die Angezeigtwerden als Liste angezeigt werden. Wählen Sie dann die Datensätze für die Ziele der h3k4-Monomethylierung, h3k27-Acetylierung, DNase 1 und CTCF aus, die den zu entwickelnden Zellen am ehesten entsprechen.Scrollen Sie in jedem relevanten Datensatz zum Dateiabschnitt, überprüfen Sie, ob mm10 und UCSC ausgewählt sind, und klicken Sie auf die Schaltfläche "Visualisierung". Zoomen Sie nun im UCSC-Genombrowser auf die fünf Prime-Introns und klicken Sie auf jeden Peak in den kommentierten Peak-Tracks. Erhalten Sie die DNA-Sequenz für jeden Spitzenbereich, indem Sie auf die Chromosomenkoordinaten für jeden Peak klicken.Wählen Sie im Dropdown-Menü Ansicht DNA aus, und klicken Sie auf Die Wiederholungen der Maske auf N.Endlich überlagern Sie diese Sequenzen mit der ursprünglichen Sequenzdatei und kommentieren diese als intronic-Bereiche, um diese zu vermeiden. Um eine sgRNA in den verbleibenden intronischen Regionen mit hoher Spezifität und vorhergesagten Effizienzwerten zu identifizieren, navigieren Sie zu einem Online-Designtool von sgRNA ihrer Wahl, wie CRISPOR. Geben Sie die Reihenfolge des intronischen Interessenbereichs ein, geben Sie das entsprechende Referenzgenom an und wählen Sie das gewünschte protospacer benachbarte Motiv aus.Klicken Sie dann auf Absenden. Als Nächstes sortieren Sie die vorhergesagte sgRNA nach Spezifitätsbewertung und wählen Sie eine oder mehrere sgRNA es aus, die auch einen hohen vorhergesagten Effizienzwert haben. Schließlich entwerfen Sie eine DNA-Vorlage mit einer PITT-Landepad-Sequenz, die auf beiden Seiten von 60-Basis-Homologiearmen flankiert wird, die der sgRNA-Schnittstelle entsprechen.Zur Umkehrung der Zielgenrepression IPTG im Trinkwasser der homozygot gezüchteten Mäuse mit dem modifizierten Allel von Interesse zu verabreichen, indem die gewünschte Menge an IPTG am Tag der Verabreichung vollständig in steriles destilliertes Wasser auflöst wird. Die Flasche mit Folie umwickeln und das IPTG-Wasser in einer lichtgeschützten Flasche den Mäusen des entsprechenden Genotyps und Kontrollen für mindestens eine Woche verabreichen. Analysieren Sie die Expression des Gens, das im Zielgewebe von Interesse ist.Um die Gen-Upregulation zu induzieren, verabreichen Sie Doxycyclin in der Ernährung für eine Woche und fahren Sie mit der Analyse der Expression des Gens von Interesse im Zielgewebe. qRT PCR-Anaylisis zeigte, dass die DNMT1-Expression mit dem Promoter-basierten Ansatz auf 15 % der unregulierten Werte unterdrückt wurde. Die Repression wurde dosisabhängig durch die Behandlung von Mäusen mit unterschiedlichen Mengen an IPTG rückgängig gemacht.Die beobachtete DNMT1-Repression und die Umkehrung der DNMT1-Repression durch IPTG-Behandlung wurde auf Proteinebene durch Immunfärbung validiert. die qRT PCR-Analyse des mKate2-Ausdrucks zeigte, dass der intron-basierte Ansatz mehr als 90% Repression von Bedienern erreichte, die mehrere Kilobasen unterhalb der Transkriptionsstartstelle durch Dämpfung der Transkriptionsdehnung lokalisierten. Konfokale Bilder des mKate2-Ausdrucks im kleinen Intenstin der Mäuse mit oder ohne LacIGY-Repressor bestätigten den Intron-basierten Ansatz.Robuste Upregulation und Downregulation der DNMT1-Expression wurden in embryonalen Stammzellen erreicht, die das modifizierte endogene DNMT1-Allel mit Tat- und Lac-Operatorsequenzen enthalten. Beide Vorschriften waren vollständig reversibel und durch IPTG- und Dox-Behandlungen induzierbar. Starke Upregulation von DNMT1 wurde von der Leber beobachtet, Milz, und Niere.Es wurde jedoch keine nachweisbare Upregulation im Herzen beobachtet, was darauf hindeutet, dass das zellzyklusabhängige Expressionsmuster von DMNT1 und die Knappheit proliferativer Zellen im Herzen dieser Beobachtung zugrunde liegen könnten. Die Untersuchung der In-vivo-Funktion eines kritischen Gens durch Manipulation seiner Expression war aufgrund der Letalität oft eine Herausforderung. Unsere Methode ermöglichte es uns, den tödlichen Phänotyp für unser Gen von Interesse zu überwinden und ermöglichte es uns, seine Rolle bei der Tumorogenese in vivo zu untersuchen.Ebenso wird diese Technologie die Untersuchung anderer wesentlicher Gene ermöglichen, die schwer zu untersuchen waren.

Research

JoVE Journal

Genetics

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

In - vitro - Transkriptionsassays und ihre Anwendung in der Drug Discovery

In vitro transcription assays have been developed and widely used for many years to study the molecular mechanisms involved in transcription. This process ...

Forschung

Genetik

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

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Genetische Manipulation der Pflanze Pathogen<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; Zu Pilzbiologie und Pflanzen Mikroben-Interaktionen Studie

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the ...

Inducible T7 RNA Polymerase-mediated Multigene Expression System, pMGX

Induzierbares T7-RNA-Polymerase-vermitteltes Multigen-Expressionssystem, pMGX

Co-expression of multiple proteins is increasingly essential for synthetic biology, studying protein-protein complexes, and characterizing and harnessing ...

Controllable Ion Channel Expression through Inducible Transient Transfection

Steuerbare Ionenkanal-Expression durch induzierbare Transiente Transfektion

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be ...

Studying Cell Cycle-regulated Gene Expression by Two Complementary Cell Synchronization Protocols

Das Studium der Zellzyklus-regulierten Genexpression durch zwei komplementäre Zellsynchronisationsprotokolle

The gene expression program of the cell cycle represents a critical step for understanding cell cycle-dependent processes and their role in diseases such ...

Production and Purification of Baculovirus for Gene Therapy Application

Herstellung und Reinigung des Baculovirus für Gentherapie Anwendung

Baculovirus has traditionally been used for the production of recombinant protein and vaccine. However, more recently, baculovirus is emerging as a ...

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

Manipulation der Diploidie in Caenorhabditis elegans

Mechanisms that involve whole genome polyploidy play important roles in development and evolution; also, an abnormal generation of tetraploid cells has ...

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Die Wurzel Mikrobiom zu erkunden: Extrahieren von Bakteriengemeinschaft Daten aus dem Boden, die Rhizosphäre und die Wurzel Endosphere

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...

Manipulation of Gene Function in Mexican Cavefish

Manipulation der Genfunktion in mexikanischen Cavefish

Cave animals provide a compelling system for investigating the evolutionary mechanisms and genetic bases underlying changes in numerous complex traits, ...

Efficient Transcriptionally Controlled Plasmid Expression System for Investigation of the Stability of mRNA Transcripts in Primary Alveolar Epithelial Cells

Effizientes transkriptionsgesteuertes Plasmidexpressionssystem zur Untersuchung der Stabilität von mRNA-Transkripten in primären Alveolar-Epithelzellen

Studying posttranscriptional regulation is fundamental to understanding the modulation of a given messenger RNA (mRNA) and its impact on cell homeostasis ...