Name: in vivo application of the remote-control system for the manipulation of endogenous gene expression
Uploaded: 2019-03-29T14:00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In vivo Application of the REMOTE-control System for the Manipulation of Endogenous Gene Expression at JoVE.com

אנו מודים Scrable היידי מאוחר את ד ר שלה מתנה נדיבה של הבונה ג'ין לצי יונקים (Mayo Clinic, רוצ'סטר, MN), ד ר דניאל Louvard (ובמכון קירי, פריז, צרפת) על מתן ייצוג המקדם Villin, ד ר לורי ג'קסון-Grusby (בית החולים לילדים, בוסטון, MA) תרומתו שלה בשלבים המוקדמים של התפתחות טכנולוגיה זו. אנחנו אסירי תודה על ד ר ננסי Wu וד ר רוברט מקסון לסיוע שלהם ביצירת העכברים הטרנסגניים ו נוקאאוט אנו מודים חברי המעבדה ליירד לדיונים מועיל ותמיכה. עבודה זו נתמכה על ידי מכוני הבריאות הלאומיים [R01 CA75090 R01 DA030325, R01 CA157918, R01 CA212374 כדי P.W.L., 1F31CA213897-01A1 כדי N.A.V.S].

PWL מגישה על לוחות המייעצת המדעית של AnchorDx ו Progenity, inc.

שלב קריטי והגבלת פוטנציאל מערכת שליטה מרחוק הוא האתגר המשויך ההוספה מדכא. שבולם ו/או אתרי קישור activator מבלי להשפיע על ביטוי גנים היעד. הגישה דיכוי המקורי שלנו, כפי שהוא מיושם הגן Dnmt1 , מעורב ההכנסה של אתרי קישור מדכא. שבולם לאק בתוך אזורים transcriptionally קריטיים של מקדם מכירות. על מנת להפחית את הסיכון המשפיעים על תפקוד יזם ובכך כדי לשפר את תחולתה הכללית של מערכת שליטה מרחוק, פיתחנו גישה מבוססת-אינטרון הדיכוי. העוצמה של מערכת משופרת לאק שלנו מאפשרת לנו להדחיק בחוזקה שעתוק של כל היזמים חזקה. בדקנו-מפעילי הממוקם מאות מספר kilobases במורד הזרם של שעתוק להתחיל אתרים (איור 3A-C) 10. חשוב, הרמות של דיכוי היו עצמאיים. היתרונות תעתיק של היזמים (איור 3A-C)10. הדבר מצביע על כי הקיבולת דיכוי של המערכת שלנו מבוססת-אינטרון דיכוי חורגת הכוח תעתיק של היזמים שנבדקו. בגישה זו מבוססת-אינטרון, סביר כי הדיכוי מתווך דרך הפרעה פיזית בין שני מרכיבים, המכונות התארכות שעתוק של lac repressors57. מנגנון דיכוי פשוט זה ואת החוסן והפגינו של השיטה מבוססת-אינטרון עלול להפוך גישה זו חלים באופן כללי על גנים שונים, רקמות, ואת היצורים.
קולטנים upregulation על ידי מערכת שליטה מרחוק מחייבת את רצפי איגוד transactivator כדי להיות קרוב מקדם ג'ין היעד, אשר כרוך סיכון של להשפיע על תפקוד יזם. עם זאת, מצאנו כי העמדה של איגוד רצפים יכול להיות מחוץ לאזור transcriptionally קריטי. היזמים הן Dnmt1 והן EF1α היו robustly upregulated מ ט מפעילי ממוקם כמה מאות בסיסים במעלה הזרם של שעתוק התחלה אתרים10. אילוץ זה רגוע מקטינה באופן משמעותי את הסיכוי להשפיע על יזם פונקציה של גנים היעד בהיעדר transactivator. הגדלת מספר איגוד רצף ו/או השימוש transactivators חזק יותר יכול לעזור לצמצם עוד יותר את הסיכון על-ידי הפעלת קולטנים upregulation מכל אתרי יותר רחוק מן האתר התחלה שעתוק.
מערכת שליטה מרחוק שלנו מספק שליטה אלגנטי של רמה, תזמון, המיקום של ביטוי גנים אנדוגני, המאפשר בדיקה של הפיכות של הפנוטיפ ואת ההשלכות של רמות ביטוי שונה, אשר אינם ניתנים להשגה בקלות על ידי טכנולוגיות בקרת ביטוי גנים ויוו הנוכחי. חשוב לציין כי רוב בניתוח ביטוי גנים, כולל שלנו, ביטוי ערכים מייצגים את הממוצע של אוכלוסיית תאים וביניהם ניתן למצוא מגוון. הטרוגניות זו עשויים להשפיע הסלולר בתהליכי קבלת החלטות, כגון בידול או אפופטוזיס58. למרות הדיוק של בקרת ביטוי גנים יכולים סביר עוד יותר להשתפר על ידי הנדסה נוספים במעגל גנטי59, נצפתה עוצמת המערכת הנוכחית שלנו יאפשר שימושי חקירת פונקציה ג'ין בהקשרים ביולוגיים רבים. בנוסף, רמה גבוהה של ירידה לפרטים היעד צפוי בגלל המורכבות של הרצפים המפעיל, כמו גם המרחק אבולוציונית גדולה בין היונקים מינים שמקורם של רכיבים רגולטוריות60. יתר על כן, קווים העכבר הטרנסגניים של repressors, מפעילים יכולים להיות פיתח, מועסק בכל גן אנדוגני. לדוגמה, ניתן להתאים המודלים הקיימים של העכבר transactivator ט לבצע קולטנים upregulation של גנים היעד ברקמות העכבר הרצויה. לאחרונה פיתחנו קו הטרנסגניים יכול לנהוג רקמות ספציפיות חזקים, הבעת מדכא. שבולם שלנו לאק משופרת של מספר סוגי רקמות בשילוב עם שורות Cre קיימות על ידי החדרת הגן lacIGY לתוך מיקומה Hipp11 48 תחת השליטה של רכיב סלומון-עצור-לקס (לא פורסם). קו זה להקל באופן משמעותי היישום רקמות ספציפיות של מערכת שליטה מרחוק.
קולטנים upregulation הגן על ידי מערכת שלט מספקת מספר יתרונות בהשוואה לגישות הטרנסגניים inducible. . זה לא דורש דור של שורות מרובות הטרנסגניים כדי לבדוק את מיקום השפעת ההוספה, כאשר הוא מנצל את לוקוס אנדוגני. בנוסף, גישה זו הוא מתאים היטב קולטנים upregulation של גנים עם ביטוי בסיסית חזקה כי היא מגבירה ביטוי מ מקדם כבר חזקים, ואילו מודלים מהונדס קונבנציונאלי להסתמך על היזמים ויראלי מינימלי. לבסוף, הרקמה ירידה לפרטים, בקרה מחזור התא, החדרת וריאציות של גן היעד עשויות להישמר על קולטנים upregulation על ידי הגישה שלנו, כפי שומרת על אלמנטים של תקנה טבעיים כגון מולדת cis-אלמנטים רגולטוריות. כניסתו של CRISPR/Cas-מתווכת טכנולוגיה פילוח ג'ין יקל מאוד היישום של טכנולוגיה זו במערכות דגם מגוונות.

נוקאאוט גנטי או גישות הטרנסגניים היו אמצעי יעיל ללמוד ג'ין פונקציה במודלים של בעלי חיים. עם זאת, הביטוי רגולציה על ידי גישות אלה דיכוטומי (פועל/לא פועל), שאינם-טמפורלית, ולכן הוא לא מסוגל לחשוף את מלוא הספקטרום פונקציונלי של גנים. מותנה Cre/LoxP טכנולוגיות אפשרו איון-עתיים או הפעלה של תפקוד הגן, אך טבעם דיכוטומי ממשיכה לדגמן מגבלות, כגון תא קטלני, irreversibility1,2 , 3. על מנת למלא את החלל הזה, מותנה גישות תמונות ציפורים אלו פותחו ט-מוסדר shRNA או miRNA4. עם זאת, אפקטים את המטרה להישאר דאגה RNAi5 , יש כבר מאתגר כדי לשלוט ויוו. לאחרונה, יש טכנולוגיות בקרת גנים ברמת השעתוק CRISPR/Cas-מתווכת ' הציג גישה תכליתיות להשגת הן. ואת downregulation של ביטוי גנים אנדוגני והפגינו שלהם כלי עזר6,7 . עם זאת, האפקטיביות של הבקרה תעתיק CRISPR/Cas-מתווכת ברור עדיין אין ויוו, ו הפיכות של דיכוי מבוסס-קראב נותר דיכוי שיראו אותו, חזקה על ידי קראב, שלה חלבון שמעצבת KAP1 הוכח לגרום גן קבוע להשתיק8,9.
על מנת לטפל מגבלות אלה, פיתחנו הרומן גנים ברמת השעתוק מערכת היכולים לשלוט באופן מותנה ביטוי גנים אנדוגני של זאזא ומתוכננים בצורה tunable בעכברים באמצעות גנים ברמת השעתוק prokaryotic בינארי מערכות רגולטוריות10. Prokaryotic מערכות רגולטוריות בינארי תעתיק עם ליגנדים רגולטוריות, lac ו ט, אפשרו כזה הפיך ולשלוט ביטוי tunable11,12,13, 14. עם זאת, העוצמה דיכוי לקוי של מערכות בינאריות הנוכחי יש המניע שלהם אימוץ רחב לשליטה על ביטוי גנים אנדוגני ביונקים. אנו פיתחה מערכת הדיכוי לאק משופרת מספיק חזק בשביל הדיכוי של גנים אנדוגני, המועסקים אסטרטגיה הרומן של פילוח ט מפעילים תעתיק ישירות אל cognate האמרגן של ג'ין אנדוגני כדי להשיג קולטנים upregulation חזקים (איור 1)10. באמצעות טכנולוגיה זו, השגנו כמעט שני סדרי גודל בקרת ביטוי של הגן Dnmt1 אנדוגני באופן tunable, inducible ו הפיך10. כאן אנו מספקים הוראות שלב אחר שלב את תחולת ויוו אחרות הגנים ואורגניזמים שימוש בעכברים כמין מודל.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59235/59235fig1.jpg"> איור 1 : סקירה כללית של מערכת שלט. שעתוק של גנים היעד אנדוגני יכול להיות מוסדר באמצעות הנדסה לאק מדכא. שבולם ומערכות activator ט . היעד ג'ין יזם או אינטרון והוא מתוכנן להכיל אופרטורים של איגוד חזק LacIGY מדכא. שבולם ו/או את rtactivator TA-M2. R מציין Repron (נציגression intrעל), אשר מכיל לאק סימטרי 12 אופרטורים (S) ובנוסף אינטרון בטא-גלובין ארנב חלקית. T מציין ט למפעיל. מדכא. שבולם את ו/או מפעיל/באים לידי ביטוי של מקדם רקמות ספציפיות. הביטוי של הגן היעד ניתן לאחר מכן הפיכה לכוונן אותו רמת הביטוי הרצוי על-ידי מינהל IPTG (איזופרופיל β-D-1-thiogalactopyranoside, אנטגוניסט של מדכא. שבולם LacIGY) או דוקסיציקלין (Dox). איור זה השתנה לי ואח10<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59235/59235fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
לפני תחילת פרוטוקול זה, עיין טבלה 1 כדי לזהות את השלבים הרלוונטיים עבור הפקד הרצוי של ביטוי גנים. לדוגמה, כדי להנדס עכבר המאפשרת downregulation הפיך של ג'ין אקס, להשלים את סעיפים 1, 3 ו- 4 של להלן פרוטוקול. טבלה 1 מסכמת גם את הרכיבים הדרושים של מערכת שליטה מרחוק.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>שינוי הביטוי הרצוי</td>
			<td>דיכוי בלבד</td>
			<td>הפעלה בלבד</td>
			<td>דיכוי והפעלה</td>
		</tr>
<tr>
<td>החלקים הרלוונטיים של פרוטוקול</td>
			<td>1, 3-4</td>
			<td>2-4</td>
			<td>1-4</td>
		</tr>
<tr>
<td>שלט רצף הצורך בהיעד ג'ין</td>
			<td>Repron ("דיכוי אינטרון"; 12 לאק סימטרי מפעילי בתוספת אינטרון בטא-גלובין ארנב חלקית)</td>
			<td>ט operator(s)</td>
			<td>Operator(s) Repron וט</td>
		</tr>
<tr>
<td>שלט רצף מיקום</td>
			<td>אינטרון</td>
			<td>יזם</td>
			<td>אינטרון & יזם</td>
		</tr>
<tr>
<td>Activator/מדכא. שבולם הדרושים עבור הפקד הרצוי</td>
			<td>LacIGY מדכא. שבולם</td>
			<td>rtTA-M2 Activator</td>
			<td>מדכא. שבולם LacIGY ו- rtTA-M2 Activator</td>
		</tr>
<tr>
<td>ליגנדים רגולטוריות</td>
			<td>IPTG</td>
			<td>דוקסילין</td>
			<td>IPTG ו/או דוקסיציקלין</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 1: סקירה של רכיבים שלט.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:715px;" width="715">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">B6C3F1/J</td>
			<td style="width:149px;">The Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:183px;">100010</td>
			<td style="width:167px;">https://www.jax.org/strain/100010</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cas9 Protein</td>
			<td style="width:149px;">PNA Bio</td>
			<td style="width:183px;">CP04</td>
			<td>http://www.pnabio.com/products/CRISPR_Cas9.htm?gclid=EAIaIQobChMIsoG8pLL33QIVBr7ACh0naQ4dEAAYAiAAEgKyHvD_BwE</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CRISPOR</td>
			<td>Haeussler et al. 2016</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td>http://crispor.tefor.net/</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Doxycycline-Containing Mouse Diet</td>
			<td style="width:149px;">Envigo</td>
			<td style="width:183px;">Varies by concentration</td>
			<td>https://www.envigo.com/products-services/teklad/laboratory-animal-diets/custom-research/doxycycline-diets/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ENCODE Database</td>
			<td style="width:149px;">Stanford University</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td>https://www.encodeproject.org/</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">iCre mRNA synthesis plasmid (pBBI)</td>
			<td style="width:149px;">Addgene</td>
			<td>65795</td>
			<td>https://www.addgene.org/65795/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">IPTG</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td style="width:183px;">I2481C</td>
			<td>https://www.goldbio.com/search?isSearch=Y&#38;q=iptg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">pGL3-Basic</td>
			<td style="width:149px;">Promega</td>
			<td style="width:183px;">E1751</td>
			<td>https://www.promega.com/products/reporter-assays-and-transfection/reporter-vectors-and-cell-lines/pgl3-luciferase-reporter-vectors/?catNum=E1751</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">SVM-BPfinder</td>
			<td style="width:149px;">Regulatory Genomics, Pompeu Fabra University</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td>http://regulatorygenomics.upf.edu/Software/SVM_BP/</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">TiProD: Tissue specific promoter Database</td>
			<td style="width:149px;">Department of Bioinformatics, UMG,&#160;University of G&#246;ttingen&#160;</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td>http://tiprod.bioinf.med.uni-goettingen.de</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">UCSC Genome Browser</td>
			<td style="width:149px;">University of California Santa Cruz</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td>https://genome.ucsc.edu/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo application of the remote-control system for the manipulation of endogenous gene expression

כאן נתאר פרוטוקול להטמעת מערכת שליטה מרחוק (Reversible Manipulation of Transcription- Endogenous לוקוסים), אשר מאפשר ביטוי הפיך, tunable שליטה ג'ין אנדוגני עניין בחיים מודל מערכות. מערכת שלט מעסיקה משופרת לאק דיכוי ו ט הפעלת מערכות להשיג למטה - או קולטנים upregulation של גנים היעד בתוך מערכת ביולוגית יחידה. דיכוי חזק יכולה להיות מושגת מ מדכא. שבולם מחייב אתרים בגמישות הממוקמים רחוק במורד הזרם של אתר התחלת שעתוק על ידי עיכוב התארכות שעתוק. קולטנים upregulation חזקים בר השגה על ידי שיפור שעתוק של גנים אנדוגני על ידי מיקוד ט מפעילים תעתיק את האמרגן cognate. פקד זה הפיך והביטוי tunable יכול להיות מיושם, מסוגר שוב ושוב אורגניזמים. האונות ואת צדדיות של המערכת, כפי שמתואר עבור אנדוגני Dnmt1 כאן, יאפשר ניתוחים פונקציונליים ויוו מדויקת יותר על-ידי הפיכת החקירה של ג'ין תפקוד ברמות שונות של ביטוי ועל -ידי בדיקות של הפיכות של פנוטיפ.

יכולת דיכוי של מערכת שלט הוכח בשתי גישות שונות עד כה. בגישה הראשונה, אתרי קישור מדכא. שבולם לאק הוכנסו את האמרגן אנדוגני של הגן Dnmt1 . בגישה השנייה, אשר מומלץ על ידי פרוטוקול זה, האתרים מחייב מדכא. שבולם הוכנסו לתוך אינטרון במורד הזרם כדי למנוע את הסיכון הפוטנציאלי של להשפיע על יזם פונקציה על-ידי ההוספה, ובכך לפשט את היישום של השלט- מערכת. שתי הגישות הביא הדחקה מוצלחת (איור 2A, B ו- 3A איור-C)10. Dnmt1 הביטוי היה מדוכא. 15% של רמות ללא פיקוח באמצעות גישה מבוססת-יזם (איור 2א). דיכוי חזק זה פעלה באופן תלוי מינון על ידי טיפול עכברים עם כמויות משתנות של IPTG (איור 2א). הדיכוי Dnmt1 נצפתה שהוכח ברמת החלבון על ידי immunostaining (איור 2B). לא נתבונן כל הבדל ניכר בביטוי Dnmt1 בין Dnmt1+ + Dnmt1LO/LO בעכברים, המאשר כי ההכנסה אופרטור לאק שלנו היה לא שיבשו יזם רגיל הפונקציה10. הגישה מבוססת-אינטרון מושגת יותר 90% הדיכוי של מפעילי ממוקם מספר kilobases במורד הזרם של אתר התחלת שעתוק attenuating שעתוק התארכות (איור 3A, B)10. גישה זו מבוססת-אינטרון אומתה נוסף על היזמים חזקים נוספים שבעה (איור 3ג'). דיכוי תמיד חזק הושג מכל היזמים נבדק. אין קורלציה בין רמות ביטוי שיורית החוזק של היזמים נצפתה, רומז כי הקיבולת דיכוי של המערכת שלנו מבוססת-אינטרון דיכוי חורגת את העוצמה תעתיק של כל היזמים חזקים בדקנו ( איור 3 C).
היכולת קולטנים upregulation ויוו של מערכת שלט הודגם גם על הגן Dnmt1 . הצגנו שני עותקים של האופרטור ט לתוך Dnmt1 המקדם, יחד עם לאק אופרטור רצפים, כדי לאפשר קולטנים upregulation או downregulation תלוי איזה אפקטור חלבון קיים. קולטנים upregulation חזקים, downregulation של הביטוי Dnmt1 , קרוב בשני סדרי גודל (10% עד 650%), הושגו ב ESCs המכיל אלל Dnmt1 אנדוגני ששונתה (Dnmt1LGT) (איור 4א)10 . תקנות הן היו הפיך באופן מלא inducible מאת IPTG Dox טיפולים, בהתאמה (איור 4א). לאחר מכן הצגנו את השינוי Dnmt1LGT לתוך germline העכבר כדי לבחון את יכולת קולטנים upregulation ויוו של מערכת שליטה מרחוק. קולטנים upregulation חזקה של Dnmt1 נצפתה מן הכבד, הטחול, הכליות, ואילו אין קולטנים upregulation לזיהוי בלב נצפתה (איור 4B)7. הדפוס תלויי-מחזור התא הביטוי של Dnmt1 ואת המחסור בתאי proliferative בלב עשויה ביסוד הזה10,תצפית56. זה נותר לראות אם מגבלה זו ניתן להתגבר על ידי הגדלת רמת ביטוי activator או מספר אתרי קישור שלה.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59235/59235fig2.jpg"> איור 2 : אין ויוו דיכוי של Dnmt1 על ידי מדכא. שבולם LacIGY. (א) עכברים עם מפעילי לאק (LO) מוכנס לתוך מקדם Dnmt1 , עם או בלי ביטוי של LacIGY, טופלו במינונים שונים של IPTG. ניתוח לרביעיית-PCR של הביטוי Dnmt1 מציגה היפוך למינון של דיכוי Dnmt1 ויוו באמצעות טיפול IPTG. כל עמודה מייצגת נתונים מעכבר שונים. נתונים מייצגים זאת אומרת ± SEM (n = 3). Immunostaining (B) של חלבון Dnmt1 באולמות חוקן של עכברים מסופקים מי שתייה עם או בלי 160 ממ IPTG למשך 3 שבועות. איור זה השתנה לי ואח10<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59235/59235fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59235/59235fig3.jpg"> איור 3 : אין ויוו ודיכוי במבחנה של היזמים השונים על ידי מערכת שלט. (א) גרסה מוקדמת של הרצף Repron (R *) הוכנס לתוך אינטרון במורד הזרם של האמרגן Villin ב Villin-mKate2 עכבר (VilmKate2). ניתוח לרביעיית-PCR של הביטוי mKate2 במעי הדק של עכברים עם או בלי מדכא. שבולם את LacIGY מוצג. כל עמודה מייצגת נתונים מעכבר שונים. (B) תמונות mKate2 קונאפוקלית של המעי הדק עם ובלי LacIGY הביטוי. (ג) 6 לאק סימטרי אופרטורים (S) הוכנסו בין היזמים השונים כתב לוציפראז. כתבים (50 ng/טוב בצלחת 96-ובכן), מדכא. שבולם פלסמידים הוצגו transiently לתאי NIH/3T3 ביחס 1:1 שן טוחנת. לוציפראז הערכים היו המוערך 24 שעות לאחר תרביות תאים. אלה נתונים במבחנה לייצג את אחוז לוציפראז ביטוי LacIGY-ביטוי תאים ביחס לאלה לבטא פונקציונלי לצי (NFlacI). T-בדיקות שימשו כדי לקבוע מובהקות סטטיסטית. נתונים מייצגים זאת אומרת ± SEM (n = 3). P ≤ 0.05, * *P ≤ 0.01. איור זה השתנה לי ואח10<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59235/59235fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59235/59235fig4.jpg"> איור 4 : למטה - ו/או קולטנים upregulation Dnmt1 הביטוי במבחנה, ויוו. (א) מערכת שליטה מרחוק שלמה היה מהונדסים ב ESCs בתרבית על ידי ג'ין מיקוד אלקטרופורציה גישות. דיכוי מקסימלי של ביטוי Dnmt1 הושגה עם שום טיפול בזמן הפעלה מקסימלי הושג על ידי טיפול IPTG והן Dox. נתונים מייצגים זאת אומרת ± SEM (n = 3). P ≤ 0.05, * *P ≤ 0.01 (של וולש t-בדיקות). (B) In vivo הפעלה של Dnmt1 על ידי מערכת שליטה מרחוק, כפי שמגלה immunostaining Dnmt1 החלבון ברקמות השונות של עכברים בשלט רחוק. אלל LGT מייצג מקדם שינוי של Dnmt1 להכיל אתרי קישור activator המפעיל לבין ט lac . עכברים טופלו בדיאטה רגילה או המכילים Dox (5000 מ"ג/ק"ג Hyclate דוקסיציקלין) למשך חודש אחד. איור זה השתנה לי ואח10<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59235/59235fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Supplementary Figure 1" src="/files/ftp_upload/59235/59235supfig1.jpg"> משלים איור 1 : דוגמה של נחיתה pad הכניסה לתוך Dnmt1 מאתר אינטרון 1. תיאור סכמטי של תבנית ה-DNA הנחיתה ההכנסה pad, משנת הקואדרוס et al. (2015)31(א). אתרים heterotypic loxP , JT15, Lox2272, המופרדים באמצעות רצף מרווח קצר (sp), ולצדו בכל צד 60-bp של ה-DNA זה הומולוגי לאזור היעד גנומית. (B) דגימת DNA תבנית הנחיתה pad הכניסה לתוך אינטרון Dnmt1 באמצעות את sgRNA הבאים: CTAGTACCACTCCTGTACCG (אשר מטרות סטרנד הפוכה). האזור intronic שנבחר היה bioinformatically הודיע על ידי צעד 1.1, sgRNA היה מזוהה באמצעות CRISPOR29. (ג) דוגמה PCR עיצוב תחל להערכת ההכנסה של המנחת. PCR תחל תוכננו מחוץ לזרועות הומולוגיה של התבנית כדי לאשר שילוב אנדוגני Dnmt1. אמפליקון PCR wildtype הוא 213 bp; בעת הכניסה, הוא הופך להיות 291 bp. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59235/59235supfig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about In vivo Application of the REMOTE-control System for the Manipulation of Endogenous Gene Expression at JoVE.com

In vivo Application of the REMOTE-control System for the Manipulation of Endogenous Gene Expression

In vivo היישום של מערכת שליטה מרחוק עבור הביטוי מניפולציה של ג'ין אנדוגני

פרוטוקול זה מתאר את השלבים הדרושים כדי ליצור מערכת מודל שבו שעתוק של גנים אנדוגני עניין יכול להיות מותנה נשלט בעלי חיים או תאים באמצעות מדכא. שבולם משופרת lac ו/או מערכות activator ט .

Here we describe a protocol for implementing the REMOTE-control system (Reversible Manipulation of Transcription at Endogenous loci), which allows for ...

משמעות השיטה שלנו היא הרבגוניות והעוצמה שלה. זה מאפשר לחוקרים יש שליטה חזקה על ביטוי גנים אנדוגני בדרכים כי היו מאתגרים להשיג באמצעות שיטות קיימות. היא מאפשרת לחוקרים לחקור את תפקודו של גן ברמות ביטוי שונות ובאופן מרחבי-זמני.לכן זה מאפשר בדיקת הפיך של פנוטיפ, אשר שימושי בעת לימוד גנים הקשורים למחלות. כדי להשיג דיכוי, גן היעד intron מתוכנן להכיל reron R, אשר מכיל 12 אופרטורים לאק סימטרי. כאשר מדכא LacIGY בא לידי ביטוי מן האמרגן הספציפי לרקמות הרצוי, גן היעד מודחק.דיכוי של גן היעד יכול להיות הפוך או מותאם לרמת הביטוי הרצויה על ידי הממשל של IPTG, אנטגוניסט של מדכא LacIGY. כדי להשיג רגולציה, מקדם הגנים היעד מתוכנן להכיל ארבעה או יותר מפעילי Tat, T, כאתרים מחייבים עבור מפעילי rtTA-M2. כאשר המפעיל בא לידי ביטוי מן האמרגן הרצוי ספציפי לרקמות בנוכחות דוקסיציקלין, upregulation של גן היעד הוא המושרה.Upregulation של גן היעד יכול להיות הפוך או מותאם לרמת הביטוי הרצוי על ידי משיכת או שינוי הריכוז של דוקסיציקלין. כדי להשיג הן דיכוי והן הפעלה, ניתן לשלב את מערכות הדיכוי של Lac ו- Tat activator. כדי לשנות את הגן של עניין להדחקה, intron אינרטי שעתוק לקראת הקצה העיקרי של הגן של עניין צריך להיות מזוהה להכנסת רצף repron.כדי להשיג את הרצף הגנומי עבור הגן של עניין, לנווט לדפדפן הגנום UCSC ולבחור את הטיוטה האחרונה של הגנום העכבר תחת לשונית הגנום. הזן את השם או הסמל של הגן המעניין לתוך סרגל החיפוש כדי להציג את התעתיקים של הגן ולאחר מכן לחץ על עבור. לאחר מכן, בחר את וריאנט התמליל הרצוי עבור הגן של עניין ולחץ על סמל הגן ליד וריאנט התמליל של עניין.לאחר מכן, תחת הרצף וקישורים לכלים ומסדי נתונים באנר, לחץ על הקישור רצף גנומי. עבור אפשרויות אזור אחזור רצף, בחר רק exons, introns ואת רשומת FASTA אחת ברירת המחדל לכל גן. לקבלת אפשרויות עיצוב רצף, בחר exons באותיות רישיות, כל השאר באותיות רישיות ומסכה חוזרת ל- N.Then, לחץ על שלח.לבסוף, שמור רצף זה, תוך שמירה על העיצוב באותיות רישיות וקטנות במסמך או בתוכנית שניתן להוסיף להם ביאורים. כדי למנוע הפרעה של איי CpG, בחר הצג עבור מסלול איי CpG תחת כרזת הביטוי והרגולציה של דפדפן הגנום של UCSC ולחץ על רענן. התקרבות על חמשת introns הממשלה, לחץ על כל אי CpG המוצג בירוק, ובחר להציג DNA עבור תכונה זו.לאחר בחירת מסיכה חוזרת N, לחץ על לקבל DNA כדי להשיג את רצף איי CpG. לבסוף, שכבת-על של רצפים אלה עם קובץ הרצף המקורי, ובאר אותם כאזורים אסטרוניים שיש להימנע מהם. כדי להימנע מאזורים intronic עם חתימות משפר ברקמות של עניין, לנווט אל בסיס הנתונים ENCODE ולבחור את סמל הניסויים.עבור סוג ההתזה, בחר ChiP-seq או DNase-seq ואכלס את הקטגוריות האחרות בהתאם לתאים שיש להנדס. לאחר בחירת התכונה, בחר את הפיקטוגרמה השמאלית ביותר בכחול, שעבורה מופיעות תוצאות התצוגה כרשימה. לאחר מכן, בחר את ערכות הנתונים עבור המטרות של מונומטילציה h3k4, h3k27 אצטילציה, DNase 1 ו- CTCF שהתאימו ביותר לתאים שיש להנדס.בתוך כל ערכת נתונים רלוונטית, גלול אל מקטע הקובץ, ודא שה- mm10 ו- UCSC נבחרו ולחץ על לחצן הפריט החזותי. עכשיו, בדפדפן הגנום של UCSC, התקרבו לחמשת האסטרונים המובילים ולחצו על כל שיא במסלולי השיא המבארים. השג את רצף הדנ"א עבור כל אזור שיא על ידי לחיצה על הקואורדינטות הכרומוזומליות לכל שיא.בתפריט הנפתח של התצוגה, בחר DNA ולחץ על מסיכה חוזרת ל- N.Finally, שכבת-על רצפים אלה עם קובץ הרצף המקורי ובאר אותם כאזורים אנטרוניים שיש להימנע מהם. כדי לזהות sgRNA באזורים האסטרוניים הנותרים עם ספציפיות גבוהה וציוני יעילות חזויים, נווט אל כלי עיצוב sgRNA מקוון לבחירה, כגון CRISPOR. הזן את הרצף של אזור העניין האסטרוני, ציין את גנום הייחוס הרלוונטי ובחר את המוטיב הסמוך לפרוטוספייסר הרצוי.לאחר מכן, לחץ על שלח. לאחר מכן, למיין את sgRNA של חזוי לפי ציון ספציפיות ולבחור אחד או יותר sgRNA של כי יש גם ציון יעילות חזוי גבוה. לבסוף, תכנן תבנית דנ"א המכילה רצף משטח נחיתה PITT מוקף משני הצדדים בזרועות הומולוגיה של 60 בסיס התואמות לאתר החיתוך sgRNA.עבור היפוך של דיכוי גנים היעד, לנהל IPTG במי השתייה של עכברים הומוזיגוס bred עם אלל שונה של עניין על ידי המסה מלאה את הכמות הרצויה של IPTG במים מזוקקים סטריליים ביום הממשל. עוטפים את הבקבוק בנייר כסף ומנהלים את מי ה-IPTG בבקבוק מוגן באור לעכברים של הגנוטיפ המתאים ושולטים במשך שבוע לפחות. המשך לניתוח הביטוי של הגן של עניין ברקמת היעד.כדי לגרום לגן upregulation, לנהל דוקסיציקלין בתזונה במשך שבוע ולהמשיך לנתח את הביטוי של הגן של עניין ברקמת היעד. qRT PCR anaylisis הראה כי ביטוי DNMT1 הודחק ל 15% של רמות ללא פיקוח באמצעות גישה מבוססת מקדם. הדיכוי התהפך באופן תלוי מינון על ידי טיפול בעכברים עם כמויות משתנות של IPTG.דיכוי DNMT1 שנצפה ואת היפוך של דיכוי DNMT1 על ידי טיפול IPTG אומת ברמת החלבון על ידי immunostaining. ניתוח PCR qRT של ביטוי mKate2 הראה כי הגישה מבוססת intron השיגה יותר מ 90% דיכוי ממפעילים הממוקמים כמה קילו-בייזר במורד הזרם של אתר התחלת שעתוק על ידי הארכת שעתוק. תמונות קונפוקליות של ביטוי mKate2 ב intenstine הקטן של העכברים עם או בלי מדכא LacIGY מאומת הגישה מבוססת intron.רגולציה חזקה ורגולציה של ביטוי DNMT1 הושגו בתאי גזע עובריים המכילים את אלל DNMT1 אנדוגני שונה עם רצפי אופרטור Tat ו Lac. שתי התקנות היו הפיכות לחלוטין ובלתי ניתנות לעיכול על ידי טיפולים IPTG ו- Dox. upregulation חזק של DNMT1 נצפתה מן הכבד, הטחול, והכליות.עם זאת, לא נצפתה שום רגולציה ניתנת לגילוי בלב, דבר המצביע על כך שדפוס הביטוי התלוי במחזור התא של DMNT1 והמחסור בתאים מתרבים בלב עשויים ביסוד תצפית זו. לימוד הפונקציה in vivo של גן קריטי על ידי מניפולציה הביטוי שלה היה לעתים קרובות מאתגר בשל קטלניות. השיטה שלנו אפשרה לנו להתגבר על הפנוטיפ הקטלני לגן העניין שלנו ואיפשרה לנו ללמוד את תפקידה בגידולוגנזה ב-vivo.כמו כן, טכנולוגיה זו תאפשר חקירה של גנים חיוניים אחרים שהיה קשה ללמוד.

Research

JoVE Journal

Genetics

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

במבחנת תמלול מבחנים ויישומם ותרופות דיסקברי

In vitro transcription assays have been developed and widely used for many years to study the molecular mechanisms involved in transcription. This process ...

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

מניפולציה גנטית של פתוגן הצמח<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; ללמוד ביולוגיה פטרייתי אינטראקציות חיידק צמח

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the ...

Inducible T7 RNA Polymerase-mediated Multigene Expression System, pMGX

T7 RNA פולימראז בתיווך Multigene הביטוי מערכת, pMGX

Co-expression of multiple proteins is increasingly essential for synthetic biology, studying protein-protein complexes, and characterizing and harnessing ...

Controllable Ion Channel Expression through Inducible Transient Transfection

ביטוי ערוץ יון לשליטה באמצעות Transfection ועין מתנהל חלוף

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be ...

Studying Cell Cycle-regulated Gene Expression by Two Complementary Cell Synchronization Protocols

לימוד מחזור גנים ביטוי מוסדר על ידי שני פרוטוקולי סינכרון התא

The gene expression program of the cell cycle represents a critical step for understanding cell cycle-dependent processes and their role in diseases such ...

Production and Purification of Baculovirus for Gene Therapy Application

ייצור, טיהור של Baculovirus עבור יישום ריפוי גנטי

Baculovirus has traditionally been used for the production of recombinant protein and vaccine. However, more recently, baculovirus is emerging as a ...

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

מניפולציה של פלואידיות ב Caenorhabditis elegans

Mechanisms that involve whole genome polyploidy play important roles in development and evolution; also, an abnormal generation of tetraploid cells has ...

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

לחקור את השורש Microbiome: שליפת נתונים הקהילה חיידקי מן האדמה, Rhizosphere, Endosphere שורש

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...

Manipulation of Gene Function in Mexican Cavefish

מניפולציה של פונקציית ג'ין Cavefish מקסיקני

Cave animals provide a compelling system for investigating the evolutionary mechanisms and genetic bases underlying changes in numerous complex traits, ...

Efficient Transcriptionally Controlled Plasmid Expression System for Investigation of the Stability of mRNA Transcripts in Primary Alveolar Epithelial Cells

יעיל טראנסקריפט מבוקרת פלמיד ביטוי מערכת לחקירת היציבות של התעתיקים mRNA בתוך הראשי מכתשי אפיתל תאים

Studying posttranscriptional regulation is fundamental to understanding the modulation of a given messenger RNA (mRNA) and its impact on cell homeostasis ...