Name: in vivo application of the remote-control system for the manipulation of endogenous gene expression
Uploaded: 2019-03-29T14:00:00
Duration: 8 min 54 s
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हम स्वर्गीय डॉ Heidi के स्तनधारी lacI जीन का निर्माण (मेयो क्लिनिक, रोचेस्टर, एमएन), डॉ डैनियल Louvard (Institut क्यूरी, पेरिस, फ्रांस) के विलिण प्रमोटर प्रदान करने के लिए उसे उदार उपहार के लिए धंयवाद Scrable, और Dr लॉरी जैक्सन-Grusby (बच्चों के अस्पताल, बोस्टन, एमए) इस प्रौद्योगिकी के विकास के प्रारंभिक दौर में उसके योगदान के लिए । हम डॉ नैंसी वू और डॉ रॉबर्ट Maxson के लिए आभारी है ट्रांसजेनिक और पीटकर चूहों पैदा करने में उनकी सहायता के लिए । हम उपयोगी विचार विमर्श और समर्थन के लिए Laird प्रयोगशाला के सदस्यों को धंयवाद । इस काम के स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों [R01 CA75090, R01 DA030325, R01 CA157918, और R01 CA212374 p.w.l. और 1F31CA213897-01A1 के लिए एन. ए. वी. एस] द्वारा समर्थित किया गया था ।

PWL AnchorDx और संतान, Inc के वैज्ञानिक सलाहकार बोर्डों पर कार्य करता है

एक महत्वपूर्ण कदम और दूरदराज के नियंत्रण प्रणाली की संभावित सीमा लक्ष्य जीन अभिव्यक्ति को प्रभावित किए बिना दमनकारी और/या उत्प्रेरक बाध्यकारी साइटों की प्रविष्टि के साथ जुड़े चुनौती है । हमारे मूल दमन दृष्टिकोण, के रूप में Dnmt1 जीन के लिए लागू है, एक प्रमोटर के transcritical tionally महत्वपूर्ण क्षेत्रों के भीतर lac दबानेवाला बंधन साइटों की प्रविष्टि शामिल है । आदेश में प्रमोटर समारोह को प्रभावित करने के जोखिम को कम करने के लिए और इस प्रकार रिमोट कंट्रोल सिस्टम के सामांय प्रयोज्यता में सुधार करने के लिए, हम एक intron आधारित दमन दृष्टिकोण विकसित की है । हमारे बढ़ाया lac प्रणाली की शक्ति हमें कसकर सभी मजबूत प्रमोटरों हम प्रतिलेखन शुरू साइटों की कई किलोबाइट डाउनस्ट्रीम करने के लिए सैकड़ों स्थित ऑपरेटरों पर परीक्षण के प्रतिलेखन दबाने के लिए अनुमति दी (चित्रा 3A-C) 10. महत्वपूर्ण बात, दमन के स्तर प्रवर्तकों की संक्रमणकारी ताकत से स्वतंत्र थे (चित्रा 3A-C)10. यह पता चलता है कि हमारे intron के दमन क्षमता आधारित दमन प्रणाली परीक्षण किया प्रमोटरों की अधिक से अधिक है । इस intron-आधारित दृष्टिकोण में, यह संभावना है कि दमन दो घटकों के बीच शारीरिक हस्तक्षेप के माध्यम से मध्यस्थता है, प्रतिलेखन बढ़ाव मशीनरी और लाख repressors५७. यह सरल दमन तंत्र और intron के प्रदर्शन मजबूती आधारित विधि यह दृष्टिकोण आम तौर पर विभिंन जीन, ऊतकों, और जीवों के लिए लागू कर सकते हैं ।
रिमोट कंट्रोल सिस्टम द्वारा upregulation के लिए transactivator बाध्यकारी अनुक्रम लक्ष्य जीन प्रमोटर, जो प्रमोटर समारोह को प्रभावित करने का खतरा जरूरत पर जोर देता है निकटता में होने की आवश्यकता है । हालांकि, हमने पाया है कि बाध्यकारी दृश्यों की स्थिति के बाहर हो सकता है transcriptionally महत्वपूर्ण क्षेत्र । Dnmt1 और EF1α दोनों प्रमोटरों को ट्रांसक्रिप्शन स्टार्ट साइट् स10के अपस्ट्रीम सौ ठिकानों के एक जोड़े में स्थित tet ऑपरेटरों से अलग किया गया था । यह आराम की बाधा बहुत transactivator के अभाव में एक लक्ष्य जीन के प्रमोटर समारोह को प्रभावित करने की संभावना को कम कर देता है । बाइंडिंग दृश्यों और/या मजबूत transactivators के उपयोग की संख्या में वृद्धि आगे transactivators शुरू साइट से दूर साइटों से upregulation को सक्षम करने से जोखिम को कम करने में मदद कर सकता है ।
हमारे रिमोट कंट्रोल सिस्टम के स्तर के सुरुचिपूर्ण नियंत्रण प्रदान करता है, समय, और अंतर्जात जीन अभिव्यक्ति के स्थान, एक phenotype की प्रतिवर्त्यता परीक्षण के लिए अनुमति देता है और विभिन्न अभिव्यक्ति के स्तर के परिणाम, जो आसानी से प्राप्त नहीं कर रहे हैं vivo जीन अभिव्यक्ति में वर्तमान-नियंत्रण प्रौद्योगिकियों । यह ध्यान दें कि सबसे जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण में हमारे सहित महत्वपूर्ण है, अभिव्यक्ति मूल्यों कोशिकाओं के बीच जो काफी भिंनता पाया जा सकता है की एक जनसंख्या के औसत का प्रतिनिधित्व करते हैं । इस विषमजनन सेलुलर निर्णय प्रक्रिया को प्रभावित कर सकते हैं, इस तरह के भेदभाव या apoptosis५८के रूप में । हालांकि जीन अभिव्यक्ति नियंत्रण की शुद्धता की संभावना आगे अतिरिक्त आनुवंशिक सर्किट इंजीनियरिंग५९द्वारा सुधार किया जा सकता है, हमारे वर्तमान प्रणाली के मनाया शक्ति कई जैविक संदर्भों में जीन समारोह की उपयोगी जांच की अनुमति होगी । इसके अलावा, लक्ष्य विशिष्टता का एक उच्च डिग्री क्योंकि ऑपरेटर दृश्यों की जटिलता के साथ ही स्तनधारियों और नियामक घटकों६०के उद्भव प्रजातियों के बीच बड़े विकासवादी दूरी की उंमीद है । इसके अलावा, ट्रांसजेनिक repressors और activators के माउस लाइनों और विकसित किया जा सकता है किसी भी अंतर्जात जीन के लिए कार्यरत हैं । उदाहरण के लिए, मौजूदा tet ट्रांसक्रिकेटर माउस मॉडल वांछित माउस ऊतकों में एक लक्ष्य जीन की upregulation को पूरा करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । हम हाल ही में एक ट्रांसजेनिक लाइन है कि मजबूत ऊतक ड्राइव कर सकते है कई ऊतक प्रकार में हमारे बढ़ाया लाख दमन के विशिष्ट अभिव्यक्ति जब मौजूदा cre लाइनों के साथ Hipp11 लोकस ४८ में lacigy जीन शुरू करने के साथ संयुक्त विकसित एक lox-स्टॉप-lox तत्व (अप्रकाशित) के नियंत्रण के अंतर्गत । यह लाइन काफी हद तक रिमोट कंट्रोल सिस्टम के टिशू-विशिष्ट एप्लीकेशन को सुगम बनाएगी ।
दूरस्थ नियंत्रण प्रणाली द्वारा जीन उपरेगुलेशन वर्तमान inducible ट्रांसजेनिक दृष्टिकोण की तुलना में कई लाभ प्रदान करता है । यह कई ट्रांसजेनिक लाइनों के उत्पादन के लिए प्रविष्टि की स्थिति प्रभाव के लिए परीक्षण की आवश्यकता नहीं है, के रूप में यह अंतर्जात लोकस का इस्तेमाल करता है । इसके अतिरिक्त, यह दृष्टिकोण मजबूत आधारभूत अभिव्यक्ति के साथ जीन के upregulation के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है क्योंकि यह एक पहले से ही मजबूत प्रमोटर से अभिव्यक्ति को बढ़ाता है, जबकि पारंपरिक ट्रांसजेनिक मॉडल ंयूनतम वायरल प्रमोटरों पर भरोसा करते हैं । अंत में, ऊतक विशिष्टता, कोशिका चक्र नियंत्रण, और एक लक्ष्य जीन के splicing वेरिएंट हमारे दृष्टिकोण से upregulation पर बरकरार रखा जा सकता है, के रूप में यह प्राकृतिक विनियमन के तत्वों जैसे जंमजात सीआईएस-विनियामक तत्वों को बरकरार रखता है । CRISPR/Cas-mediated जीन-लक्ष्यीकरण प्रौद्योगिकी के आगमन से विविध मॉडल प्रणालियों में इस प्रौद्योगिकी के अनुप्रयोग को काफी सुविधा मिलेगी ।

जेनेटिक नॉकआउट या ट्रांसजेनिक दृष्टिकोण प्रभावी तरीके से पशु मॉडलों में जीन समारोह का अध्ययन किया गया है । तथापि, इन दृष्टिकोणों द्वारा अभिव्यक्ति विनियम, गैर-लौकिक, और इस प्रकार एक जीन के पूर्ण कार्यात्मक स्पेक्ट्रम का खुलासा करने में सक्षम नहीं है । सशर्त Cre/LOxp प्रौद्योगिकियों spatio-लौकिक inactivation या जीन समारोह के सक्रियण की अनुमति दी है, लेकिन उनकी द्विभाजी प्रकृति के लिए सीमाओं की तरह जारी है, सेल lethality और अपरिवर्तिता1,2 , 3. इस शूंय को भरने के लिए, सशर्त पछाड़ना दृष्टिकोण tetका उपयोग कर विकसित किया गया है-विनियमित shrna या mirna4। हालांकि, बंद लक्ष्य प्रभाव RNAi5 के लिए एक चिंता का विषय बने रहते हैं और vivo में नियंत्रण करने के लिए चुनौतीपूर्ण है. हाल ही में, crispr/Cas-mediated transcriptional-नियंत्रण प्रौद्योगिकियों दोनों को प्राप्त करने और अंतर्जात जीन अभिव्यक्ति के downregulation के लिए एक अधिक बहुमुखी दृष्टिकोण शुरू की है और अपनी उपयोगिताओं का प्रदर्शन किया6,7 . हालांकि, crispr/Cas-mediated transcriptional नियंत्रण की प्रभावशीलता के रूप में अभी तक vivo में अस्पष्ट है, और krab के प्रतिवर्त्यता-दमन आधारित है देखा जा करने के लिए, krab और उसके बातचीत प्रोटीन KAP1 द्वारा मजबूत दमन के रूप में प्रेरित दिखाया गया है स्थायी जीन साइलेंसिंग८,९.
इन सीमाओं को संबोधित करने के लिए, हम एक उपंयास transcriptional नियामक प्रणाली विकसित किया है सशर्त नियंत्रित करने में सक्षम अंतर्जात जीन अभिव्यक्ति एक प्रतिवर्ती और स्वरित्र तरीके में चूहों में इंजीनियर प्रोकार्योटिक द्विआधारी transअपंग का उपयोग नियामक प्रणालियां10. प्रोक्योटिक द्विआधारी विनियामकीय नियामक प्रणाली, जैसे कि एलएसी और टीईटी, ने ऐसी प्रतिवर्ती और तुनीय अभिव्यक्ति को सक्षम किया है नियंत्रण11,12,13, 14. तथापि, वर्तमान द्विआधारी प्रणालियों के अपर्याप्त दमन शक्ति स्तनधारियों में अंतर्जात जीन अभिव्यक्ति को नियंत्रित करने के लिए अपने व्यापक अपनाने बाधित है । हम एक बढ़ाया लाख दमन प्रणाली अंतर्जात जीन के दमन के लिए पर्याप्त रूप से शक्तिशाली विकसित की है और एक अंतर्जात जीन के सजात प्रमोटर को प्राप्त करने के लिए tet transcriptional activators सीधे लक्ष्यीकरण की एक उपंयास रणनीति कार्यरत दमदार यूपरेग्लेशन (चित्रा 1)10. इस तकनीक के साथ, हम लगभग दो आदेश प्राप्त की है परिमाण अभिव्यक्ति नियंत्रण अंतर्जात Dnmt1 जीन के एक tunable में, inducible, और प्रतिवर्ती तरीके से10। यहाँ हम एक मॉडल प्रजाति के रूप में चूहों का उपयोग अन्य जीन और जीवों के लिए vivo आवेदन में इसके लिए कदम दर कदम निर्देश प्रदान करते हैं.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59235/59235fig1.jpg"> चित्रा 1 : दूरस्थ नियंत्रण सिस्टम का ओवरव्यू । अंतर्जात लक्ष्य जीन के प्रतिलेखन को इंजीनियर लाख रप्रेसर और tet उत्प्रेरक प्रणालियों का उपयोग करके विनियमित किया जा सकता है । लक्ष्य जीन प्रमोटर या intron तंग बाध्यकारी LacIGY दमित और/या आरटीटीए M2 उत्प्रेरक के लिए ऑपरेटरों को नियंत्रित करने के लिए इंजीनियर है । R इंगित करता है Repron (प्रतिनिधिression intrपर), जिसमें 12 सममित lac ऑपरेटर्स (S) प्लस एक आंशिक खरगोश बीटा-ग्लोबिन intron शामिल हैं । T tet ऑपरेटर इंगित करता है । प्रतिकारक और/या उत्प्रेरक एक ऊतक विशिष्ट प्रमोटर से व्यक्त किया जाता है । लक्ष्य जीन की अभिव्यक्ति तो reversibly IPTG के प्रशासन द्वारा वांछित अभिव्यक्ति स्तर को देखते किया जा सकता है (isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside, LacIGY दबानेवाला का एक विरोधी) या Doxycycline (Dox) । यह आंकड़ा ली एट अल.10से संशोधित किया गया है<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59235/59235fig1large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>
इस प्रोटोकॉल को प्रारंभ करने से पहले, जीन व्यंजक के वांछित नियंत्रण के लिए प्रासंगिक चरणों की पहचान करने के लिए तालिका 1 की समीक्षा करें. उदाहरण के लिए, एक माउस इंजीनियर है कि "जीन एक्स" के प्रतिवर्ती downregulation सक्षम बनाता है, पूरा अनुभाग 1, 3, और नीचे प्रोटोकॉल के 4 । तालिका 1 दूरस्थ नियंत्रण सिस्टम के आवश्यक घटकों को भी सारांशित करती है ।
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>वांछित अभिव्यक्ति परिवर्तन</td>
			<td>दमन ही</td>
			<td>केवल सक्रियण</td>
			<td>दमन और सक्रियण दोनों</td>
		</tr>
<tr>
<td>प्रोटोकॉल के प्रासंगिक अनुभागों</td>
			<td>1, 3-4</td>
			<td>2-4</td>
			<td>1-4</td>
		</tr>
<tr>
<td>लक्ष्य जीन में रिमोट कंट्रोल अनुक्रम की जरूरत</td>
			<td>Repron ("दमन intron"; 12 सममित लाख ऑपरेटरों प्लस एक आंशिक खरगोश बीटा-globin intron)</td>
			<td>Tet ऑपरेटर (s)</td>
			<td>Repron और Tet ऑपरेटर (s)</td>
		</tr>
<tr>
<td>रिमोट कंट्रोल अनुक्रम स्थान</td>
			<td>Intron</td>
			<td>प्रमोटर</td>
			<td>इंट्रॉन & प्रवर्तक</td>
		</tr>
<tr>
<td>वांछित नियंत्रण के लिए आवश्यक उत्प्रेरक/</td>
			<td>LacIGY रप्रेसर</td>
			<td>rtTA-M2 उत्प्रेरक</td>
			<td>LacIGY रप्रेसर और rtTA-M2 उत्प्रेरक</td>
		</tr>
<tr>
<td>रेग्युलेटरी लिगंड्स</td>
			<td>आईपीटीजी</td>
			<td>Doxycycline</td>
			<td>IPTG और/Doxycycline</td>
		</tr>
</tbody></table>तालिका 1: दूरस्थ नियंत्रण घटकों का ओवरव्यू ।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:715px;" width="715">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">B6C3F1/J</td>
			<td style="width:149px;">The Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:183px;">100010</td>
			<td style="width:167px;">https://www.jax.org/strain/100010</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cas9 Protein</td>
			<td style="width:149px;">PNA Bio</td>
			<td style="width:183px;">CP04</td>
			<td>http://www.pnabio.com/products/CRISPR_Cas9.htm?gclid=EAIaIQobChMIsoG8pLL33QIVBr7ACh0naQ4dEAAYAiAAEgKyHvD_BwE</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CRISPOR</td>
			<td>Haeussler et al. 2016</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td>http://crispor.tefor.net/</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Doxycycline-Containing Mouse Diet</td>
			<td style="width:149px;">Envigo</td>
			<td style="width:183px;">Varies by concentration</td>
			<td>https://www.envigo.com/products-services/teklad/laboratory-animal-diets/custom-research/doxycycline-diets/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ENCODE Database</td>
			<td style="width:149px;">Stanford University</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td>https://www.encodeproject.org/</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">iCre mRNA synthesis plasmid (pBBI)</td>
			<td style="width:149px;">Addgene</td>
			<td>65795</td>
			<td>https://www.addgene.org/65795/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">IPTG</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td style="width:183px;">I2481C</td>
			<td>https://www.goldbio.com/search?isSearch=Y&#38;q=iptg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">pGL3-Basic</td>
			<td style="width:149px;">Promega</td>
			<td style="width:183px;">E1751</td>
			<td>https://www.promega.com/products/reporter-assays-and-transfection/reporter-vectors-and-cell-lines/pgl3-luciferase-reporter-vectors/?catNum=E1751</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">SVM-BPfinder</td>
			<td style="width:149px;">Regulatory Genomics, Pompeu Fabra University</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td>http://regulatorygenomics.upf.edu/Software/SVM_BP/</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">TiProD: Tissue specific promoter Database</td>
			<td style="width:149px;">Department of Bioinformatics, UMG,&#160;University of G&#246;ttingen&#160;</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td>http://tiprod.bioinf.med.uni-goettingen.de</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">UCSC Genome Browser</td>
			<td style="width:149px;">University of California Santa Cruz</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td>https://genome.ucsc.edu/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo application of the remote-control system for the manipulation of endogenous gene expression

यहां हम दूरदराज के नियंत्रण प्रणाली को लागू करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन (रीversible एमanipulation ओएफ टीरैंसक्रिप्शन ईndogenous loci पर), जो एक के प्रतिवर्ती और स्वरित्र अभिव्यक्ति नियंत्रण के लिए अनुमति देता है रहने वाले मॉडल सिस्टम में ब्याज की अंतर्जात जीन । रिमोट कंट्रोल सिस्टम एक एकल जैविक प्रणाली के भीतर एक लक्ष्य जीन के नीचे-या upregulation प्राप्त करने के लिए बढ़ाया लाख दमन और टीईटी सक्रियण प्रणाली को रोजगार । तंग दमन दबानेवाला बंधन साइटों flexibly से दूर अनुप्रवाह एक ट्रांसक्रिप्शन शुरू करने के लिए प्रतिलेखन बढ़ाव के द्वारा साइट के डाउनस्ट्रीम स्थित से प्राप्त किया जा सकता है । मजबूत यूपरेग्लेशन को एक अंतर्जात जीन के प्रतिलेखन को बढ़ाने के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है जो कि संजात प्रवर्तक को टीईटी परिसंक्रियक उत्प्रेरक को लक्षित करता है । इस प्रतिवर्ती और तुनीय अभिव्यक्ति नियंत्रण को लागू किया जा सकता है और जीवों में बार वापस ले लिया । शक्ति और प्रणाली के बहुमुखी प्रतिभा, के रूप में अंतर्जात Dnmt1 यहां के लिए प्रदर्शन किया, और विभिंन अभिव्यक्ति के स्तर पर जीन समारोह की जांच को सक्षम करने से vivo कार्यात्मक विश्लेषण में और अधिक सटीक अनुमति देगा एक की प्रतिवर्त्यता परीक्षण द्वारा Phenotype.

रिमोट कंट्रोल सिस्टम की दमन क्षमता दो अलग दृष्टिकोण में इस प्रकार दूर प्रदर्शन किया गया है । पहले दृष्टिकोण में, lac दबानेवाला बंधन साइटों Dnmt1 जीन के अंतर्जात प्रमोटर में डाला गया । दूसरे दृष्टिकोण में, जो इस प्रोटोकॉल द्वारा सिफारिश की है, दबानेवाला बंधन साइटों को एक डाउनस्ट्रीम intron में सम्मिलित किया गया था और इस प्रकार रिमोट कंट्रोल के आवेदन को सरल बनाने के लिए प्रविष्टि द्वारा प्रमोटर समारोह को प्रभावित करने के संभावित जोखिम से बचने के लिए प्रणाली. दोनों दृष्टिकोण सफल दमन में हुई (चित्रा 2ए, बी और चित्रा 3a-C)10। Dnmt1 अभिव्यक्ति प्रमोटर आधारित दृष्टिकोण का उपयोग कर अनियमित स्तरों के 15% के लिए दमन किया गया था (चित्रा 2ए) । इस तंग दमन IPTG (चित्रा 2ए) के अलग मात्रा के साथ चूहों के इलाज के द्वारा एक खुराक पर निर्भर तरीके से उलट गया था । मनाया Dnmt1 दमन immunostaining द्वारा प्रोटीन स्तर पर मान्य किया गया था (चित्रा 2बी). हम Dnmt1के बीच Dnmt1 अभिव्यक्ति में कोई उल्लेखनीय अंतर का पालन नहीं किया+/+ और Dnmt1lo/लो चूहों, पुष्टि कि हमारे lac ऑपरेटर प्रविष्टि सामांय प्रमोटर बाधित नहीं था समारोह10. intron आधारित दृष्टिकोण कम प्रतिलेखन बढ़ाव (चित्रा 3ए, बी)10द्वारा प्रतिलेखन शुरू साइट के कई किलोबेसेस डाउनस्ट्रीम स्थित ऑपरेटरों से अधिक से अधिक ९०% दमन हासिल किया । इस इनट्रॉन आधारित एप्रोच को सात अतिरिक्त दमदार प्रमोटरों (चित्रा 3सी) पर आगे मान्य किया गया । परीक्षण किए गए सभी प्रवर्तकों से निरपवाद रूप से कडी दमन किया गया । अवशिष्ट अभिव्यक्ति के स्तर और प्रवर्तकों की ताकत के बीच कोई संबंध नहीं देखा गया था, सुझाव है कि हमारे intron के दमन की क्षमता आधारित दमन प्रणाली मजबूत प्रमोटरों हम परीक्षण के सभी के transcriptional शक्ति से अधिक है ( चित्रा 3 ग) ।
रिमोट कंट्रोल सिस्टम की वीवो यूपरेग्लेशन कैपेबिलिटी में Dnmt1 जीन पर भी प्रदर्शन किया गया । हम Dnmt1 प्रमोटर में tet ऑपरेटर की दो प्रतियां शुरू की, एक साथ लाख ऑपरेटर दृश्यों के साथ, या तो upregulation या downregulation के आधार पर जो effector प्रोटीन मौजूद है के लिए अनुमति देते हैं । Dnmt1 व्यंजक का दमदार अपरेग्लेशन और डाउनरेगुलेशन, परिमाण के दो आदेशों (10% से ६५०%) के करीब, ईएससीएस में प्राप्त किए गए थे जिसमें संशोधित अंतर्जात Dnmt1 एलील (Dnmt1LGT) (चित्र 4ए)10 . दोनों नियमों को पूरी तरह से पलटवाँ और IPTG और डॉक्स उपचार, क्रमशः (चित्रा 4ए) द्वारा inducible थे । हम अगले माउस जर्मलाइन में Dnmt1LGT संशोधन शुरू की दूरस्थ नियंत्रण प्रणाली के vivo upregulation क्षमता में परीक्षण । यकृत, प्लीहा, और गुर्दे से Dnmt1 का प्रबल अपगुलेशन देखा गया, जबकि हृदय में कोई detectable अपरूग्लेशन नहीं पाया गया (चित्र 4ख)7. Dnmt1 के सेल चक्र पर निर्भर अभिव्यक्ति पैटर्न और दिल में प्रफलन कोशिकाओं की कमी इस प्रेक्षण10,५६आबाद हो सकता है । यह देखना है कि क्या इस सीमा उत्प्रेरक या उसके बाध्यकारी साइटों की संख्या की अभिव्यक्ति स्तर में वृद्धि से दूर किया जा सकता है ।
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59235/59235fig2.jpg"> चित्रा 2 : Vivo में LacIGY दबानेवाला द्वारा Dnmt1 का दमन । (क) Dnmt1 प्रमोटर में सम्मिलित की गई एलएसी प्रचालक (एलओ) के साथ चूहों को, जिसमें अथवा बिना किसी LACIGYकी अभिव्यक्ति के, आईपीटीजी की विभिन्न खुराकों के साथ उपचार किया गया था । qRT- Dnmt1 अभिव्यक्ति का पीसीआर विश्लेषण IPTG उपचार द्वारा Vivo में Dnmt1 दमन की खुराक पर निर्भर उलटा पता चलता है । प्रत्येक बार किसी भिंन माउस से डेटा का प्रतिनिधित्व करता है । डेटा का प्रतिनिधित्व करते है मतलब ± SEM (n = 3) । (ख) चूहों के कोलोनिक भभक में Dnmt1 प्रोटीन की प्रतिरक्षा के लिए 3 सप्ताहों के लिए १६० मिमी आईपीटीजी के साथ या बिना पीने के पानी उपलब्ध कराया गया । यह आंकड़ा ली एट अल.10से संशोधित किया गया है<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59235/59235fig2large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59235/59235fig3.jpg"> चित्रा 3 : Vivo में और रिमोट कंट्रोल सिस्टम द्वारा विभिन्न प्रमोटरों के विट्रो दमन में । (ं) एक विलिण-mKate2 ट्रांसजेनिक माउस (VilmKate2) में विलिं प्रमोटर के इनट्रॉन अनुप्रवाह में रेपरोन अनुक्रम (आर *) का प्रारंभिक संस्करण डाला गया था । qRT-पीसीआर के साथ या बिना Lacigy दमित चूहों की छोटी आंत में mKate2 अभिव्यक्ति का विश्लेषण दिखाया गया है । प्रत्येक बार किसी भिंन माउस से डेटा का प्रतिनिधित्व करता है । (ख) छोटी आंत के साथ और बिना lacigy अभिव्यक्ति के confocal mKate2 छवियां । (ग) विभिन्न प्रमोटरों और एक ल्यूसीफ्रास रिपोर्टर के बीच छह सममित लाख प्रचालक सम्मिलित किए गए थे । रिपोर्टर्स (५० एनजी/well में ९६-well थाली) और दबानेवाला plasmids एक 1:1 दाढ़ अनुपात में nih/3t3 कोशिकाओं में transiently शुरू किए गए थे । ल्यूसिफेर्स वैल्यू ट्रांसफेक्शन के बाद 24 एच का आकलन किया गया । इन विट्रो डेटा में luciferase अभिव्यक्ति का प्रतिशत का प्रतिनिधित्व lacigyमें गैर कार्यात्मक laci (nflaci) व्यक्त उन लोगों के सापेक्ष कोशिकाओं को व्यक्त । टी परीक्षण सांख्यिकीय महत्व निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया गया । डेटा का प्रतिनिधित्व करते है मतलब ± SEM (n = 3) । *p ≤ ०.०५, * *p ≤ ०.०१. यह आंकड़ा ली एट अल.10से संशोधित किया गया है<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59235/59235fig3large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59235/59235fig4.jpg"> चित्रा 4 : नीचे और/या Dnmt1 अभिव्यक्ति में विट्रो और vivo में upregulation । (क) पूरा रिमोट कंट्रोल सिस्टम जीन लक्ष्यीकरण और इलैक्ट्रोपोरेशन दृष्टिकोणों द्वारा सुसंस्कृत ईसीएस में तैयार किया गया था । Dnmt1 अभिव्यक्ति का अधिकतम दमन कोई इलाज के साथ प्राप्त किया गया था, जबकि अधिकतम सक्रियण दोनों IPTG और डॉक्स उपचार द्वारा प्राप्त किया गया था । डेटा का प्रतिनिधित्व करते है मतलब ± SEM (n = 3) । *p ≤ ०.०५, * *p ≤ ०.०१ (वेल्च टी-टेस्ट) । (ख) विवो में दूरस्थ नियंत्रण प्रणाली द्वारा Dnmt1 के सक्रियकरण में, जैसा कि रिमोट कंट्रोल चूहों से विभिन्न ऊतकों में Dnmt1 प्रोटीन का प्रतिरोदन करके दर्शाया गया है । एलजीटी एले में lac ऑपरेटर और tet उत्प्रेरक बाइंडिंग साइटों को शामिल करने के लिए Dnmt1 के प्रमोटर संशोधन का प्रतिनिधित्व करता है । चूहों को एक महीने के लिए सामान्य या डोक्स युक्त आहार (५००० मिलीग्राम/किग्रा Doxycycline Hyclate) के साथ उपचार किया गया । यह आंकड़ा ली एट अल.10से संशोधित किया गया है<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59235/59235fig4large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>
<img alt="Supplementary Figure 1" src="/files/ftp_upload/59235/59235supfig1.jpg"> अनुपूरक आंकड़ा 1 : मुरीन Dnmt1 intron 1 में लैंडिंग पैड प्रविष्टि का उदाहरण । (क) क्वाड्रास एट अल (२०१५)31से रूपांतरित अवतरण पैड प्रविष्टि के लिए डीएनए टेम्पलेट की योजनाबद्ध । विषमप्ररूपी Loxp साइटों, JT15 और Lox2272, एक छोटी स्पेसर अनुक्रम (सपा) से अलग कर रहे है और ६०-डीएनए के बीपी द्वारा हर तरफ flanked कि लक्ष्य जीनोमिक क्षेत्र के लिए समजातीय है । (ख) निम्नलिखित sgRNA का उपयोग Dnmt1 intron में लैंडिंग पैड प्रविष्टि के लिए नमूना डीएनए टेम्पलेट: CTAGTACCACTCCTGTACCG (जो रिवर्स किनारा लक्ष्य) । चयनित intronic क्षेत्र bioinformatically १.१ कदम से सूचित किया गया था, और sgRNA CRISPOR29का उपयोग कर की पहचान की गई थी । (ग) लैंडिंग पैड के संमिलन का आकलन करने के लिए पीसीआर प्राइमर डिजाइन का उदाहरण । पीसीआर प्राइमरों को अंतर्जात Dnmt1में एकीकरण की पुष्टि करने के लिए टेम्पलेट के समजातता बाहों के बाहर डिजाइन किए गए थे । वाइल्डटाइप PCR amplicon है २१३ bp; लन होने पर यह २९१ बीपी हो जाता है । <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59235/59235supfig1large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें</a> ।

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In vivo Application of the REMOTE-control System for the Manipulation of Endogenous Gene Expression

अंतर्जात जीन अभिव्यक्ति के हेरफेर के लिए दूरस्थ नियंत्रण प्रणाली के vivo आवेदन में

इस प्रोटोकॉल में एक मॉडल प्रणाली है जिसमें ब्याज की एक अंतर्जात जीन के प्रतिलेखन जीवित जानवरों या कोशिकाओं में बढ़ाया लाख दमनकारी और/या tet उत्प्रेरक प्रणालियों का उपयोग कर सशर्त नियंत्रित किया जा सकता है उत्पंन करने के लिए आवश्यक कदम की रूपरेखा ।

Here we describe a protocol for implementing the REMOTE-control system (Reversible Manipulation of Transcription at Endogenous loci), which allows for ...

हमारी विधि का महत्व इसकी बहुमुखी प्रतिभा और शक्ति है। यह शोधकर्ताओं को उन तरीकों से अंतर्जात जीन अभिव्यक्ति पर मजबूत नियंत्रण रखने की अनुमति देता है जो मौजूदा तरीकों का उपयोग करके प्राप्त करने के लिए चुनौतीपूर्ण रहे हैं । यह शोधकर्ताओं को विभिन्न अभिव्यक्ति के स्तर पर और एक स्थानिक-लौकिक तरीके से एक जीन के समारोह की जांच करने की अनुमति देता है ।इस प्रकार यह फेनोटाइप की रिवर्सिबिलिटी का परीक्षण करने की अनुमति देता है, जो रोग से संबंधित जीन का अध्ययन करते समय उपयोगी होता है। दमन को पूरा करने के लिए, लक्ष्य जीन आईएनट्रॉन को रिप्रॉन आर को शामिल करने के लिए इंजीनियर किया जाता है, जिसमें 12 सममित लाख ऑपरेटर होते हैं । जब लैसी दमन वांछित ऊतक विशिष्ट प्रमोटर से व्यक्त किया जाता है, तो लक्ष्य जीन का दमन किया जाता है।लक्ष्य जीन के दमन को लैक्जी दमन के विरोधी आईपीटीजी के प्रशासन द्वारा वांछित अभिव्यक्ति स्तर को उलट या समायोजित किया जा सकता है। उपनियम को पूरा करने के लिए, लक्ष्य जीन प्रमोटर को आरटीटीए-एम 2 एक्टिवेटर के लिए बाध्यकारी साइटों के रूप में चार या अधिक Tat ऑपरेटरों, टी को शामिल करने के लिए इंजीनियर किया जाता है । जब एक्टिवेटर को डॉक्सीसाइक्लिन की उपस्थिति में वांछित ऊतक-विशिष्ट प्रमोटर से व्यक्त किया जाता है, तो लक्ष्य जीन का अपरेगुलेशन प्रेरित होता है।लक्ष्य जीन के उपनियम को डॉक्सीसाइक्लिन की एकाग्रता को वापस लेने या बदलने के द्वारा वांछित अभिव्यक्ति स्तर को उलट या समायोजित किया जा सकता है। दमन और सक्रियण दोनों को पूरा करने के लिए, लाख दमन और Tat सक्रियक प्रणालियों को संयुक्त किया जा सकता है। दमन के लिए ब्याज के जीन को संशोधित करने के लिए, ब्याज के जीन के पांच प्रमुख छोर की ओर एक ट्रांसक्रिप्शनल निष्क्रिय intron repron अनुक्रम के सम्मिलन के लिए पहचाना जाना चाहिए ।ब्याज के जीन के लिए जीनोमिक अनुक्रम प्राप्त करने के लिए, UCSC जीनोम ब्राउज़र के लिए नेविगेट और जीनोम टैब के तहत माउस जीनोम के नवीनतम मसौदे का चयन करें । जीन के लिए ट्रांसक्रिप्ट देखने के लिए खोज बार में ब्याज के जीन का नाम या प्रतीक दर्ज करें और फिर जाने पर क्लिक करें। फिर, ब्याज के जीन के लिए वांछित ट्रांसक्रिप्ट संस्करण का चयन करें और ब्याज के ट्रांसक्रिप्ट संस्करण के बगल में जीन प्रतीक पर क्लिक करें।इसके बाद, टूल और डेटाबेस बैनर के अनुक्रम और लिंक के तहत, जीनोमिक अनुक्रम लिंक पर क्लिक करें। अनुक्रम पुनः प्राप्ति क्षेत्र विकल्पों के लिए, केवल exons, introns और डिफ़ॉल्ट एक फास्टा रिकॉर्ड प्रति जीन का चयन करें । स्वरूपण विकल्प अनुक्रमण के लिए, ऊपरी मामले में exons का चयन करें, कम मामले में बाकी सब कुछ और मुखौटा N.तो दोहराता है, सबमिट पर क्लिक करें ।अंत में, इस अनुक्रम को सहेजें, किसी दस्तावेज़ या कार्यक्रम में ऊपरी और लोअरकेस स्वरूपण को संरक्षित करें जिसे एनोटेट किया जा सकता है। सीपीजी द्वीपों की रुकावट से बचने के लिए यूसीएससी जीनोम ब्राउजर के एक्सप्रेशन एंड रेगुलेशन बैनर के तहत सीपीजी आइलैंड्स ट्रैक के लिए शो का चयन करें और रिफ्रेश करें । पांच प्राइम इंट्रोन पर ज़ूम इन, हरे रंग में दिखाए गए प्रत्येक सीपीजी द्वीप पर क्लिक करें, और इस सुविधा के लिए देखें डीएनए का चयन करें।एन को मास्क दोहराता का चयन करने के बाद, क्लिक करें सीपीजी द्वीप अनुक्रम प्राप्त करने के लिए डीएनए प्राप्त करें। अंत में, मूल अनुक्रम फ़ाइल के साथ इन दृश्यों को ओवरले करें, और इन से बचने के लिए इन को इंट्रोनिक क्षेत्रों के रूप में एनोटेट करें। रुचि के ऊतकों में बढ़ाने वाले हस्ताक्षरों वाले इंट्रोनिक क्षेत्रों से बचने के लिए, एनकोड डेटा बेस पर नेविगेट करें और प्रयोग आइकन का चयन करें।परख प्रकार के लिए, चिप-सेक्यू या डीएनएसई-सेक्यू का चयन करें और इंजीनियर किए जाने वाले कोशिकाओं के अनुसार अन्य श्रेणियों को पॉप्युलेट करें। फीचर चयन के बाद, नीले रंग में बाएं सबसे पिक्टोग्राम का चयन करें, जिसके लिए सूची के रूप में परिणाम दिखाई देते हैं। फिर, एच 3k4 मोनोमेथिलेशन, एच 3k27 एसीटिलेशन, डीएनएसई 1 और सीटीसीएफ के लक्ष्यों के लिए डेटा सेट का चयन करें जो सबसे बारीकी से इंजीनियर होने वाली कोशिकाओं से मेल खाते हैं।प्रत्येक प्रासंगिक डेटा सेट के भीतर, फ़ाइल अनुभाग में स्क्रॉल करें, सत्यापित करें कि mm10 और UCSC का चयन किया गया है, और कल्पना बटन पर क्लिक करें। अब, यूसीएससी जीनोम ब्राउज़र में, पांच प्राइम इंट्रोन पर ज़ूम इन करें और एनोटेटेड पीक ट्रैक में प्रत्येक चोटी पर क्लिक करें। प्रत्येक चोटी के लिए गुणसूत्र निर्देशांक पर क्लिक करके प्रत्येक शिखर क्षेत्र के लिए डीएनए अनुक्रम प्राप्त करें।दृश्य ड्रॉप-डाउन मेनू में, डीएनए का चयन करें, और क्लिक करें मास्क एन अंत में दोहराता है, मूल अनुक्रम फ़ाइल के साथ इन दृश्यों को ओवरले करें और इन को इनोटेट करने से बचने के लिए इन को इनोटेट करें। उच्च विशिष्टता और भविष्यवाणी दक्षता स्कोर के साथ शेष इंट्रोनिक क्षेत्रों में एक sgRNA की पहचान करने के लिए, पसंद के एक ऑनलाइन sgRNA डिजाइन उपकरण, जैसे CRISPOR के लिए नेविगेट । ब्याज के इंट्रोनिक क्षेत्र के अनुक्रम दर्ज करें, प्रासंगिक संदर्भ जीनोम निर्दिष्ट करें, और वांछित प्रोटोस्पेसर आसन्न आकृति का चयन करें।इसके बाद सबमिट पर क्लिक करें। इसके बाद, भविष्यवाणी की है sgRNA विशिष्टता स्कोर से सॉर्ट और एक या एक से अधिक sgRNA है कि यह भी एक उच्च भविष्यवाणी की दक्षता स्कोर है का चयन करें । अंत में, एक डीएनए टेम्पलेट डिजाइन जिसमें एक पिट लैंडिंग पैड अनुक्रम होता है जो दोनों तरफ 60-बेस होमोलॉजी हथियारों से घिरा हुआ है जो एसजीआरएनए कट साइट के अनुरूप है।लक्ष्य जीन दमन के उलट के लिए, प्रशासन के दिन बाँझ आसुत पानी में आईपीटीजी की वांछित राशि को पूरी तरह से भंग करके ब्याज की संशोधित एलील के साथ होमोजिजियस नस्ल चूहों के पीने के पानी में आईपीटीजी प्रशासन । पन्नी के साथ बोतल लपेटें और उचित जीनोटाइप के चूहों के लिए एक प्रकाश संरक्षित बोतल में IPTG पानी प्रशासन और कम से कम एक सप्ताह के लिए नियंत्रण। लक्ष्य ऊतक में रुचि के जीन की अभिव्यक्ति का विश्लेषण करने के लिए आगे बढ़ें।जीन अपरेगुलेशन को प्रेरित करने के लिए, एक सप्ताह के लिए आहार में डॉक्सीसाइक्लिन का प्रशासन करें और लक्षित ऊतक में रुचि के जीन की अभिव्यक्ति का विश्लेषण करने के लिए आगे बढ़ें। क्यूआरटी पीसीआर एनेलिसिस से पता चला कि डीएनएमटी1 अभिव्यक्ति को प्रमोटर-आधारित दृष्टिकोण का उपयोग करके अनियमित स्तरों के 15% तक दबाया गया था। दमन IPTG की अलग मात्रा के साथ चूहों के इलाज के द्वारा एक खुराक पर निर्भर तरीके से उलट गया था ।मनाया DNMT1 दमन और आईपीटीजी उपचार द्वारा DNMT1 दमन के उलट इम्यूनोस्टेपिंग द्वारा प्रोटीन स्तर पर मान्य किया गया था । mKate2 अभिव्यक्ति के क्यूआरटी पीसीआर विश्लेषण से पता चला है कि इंट्रोन आधारित दृष्टिकोण ने ट्रांसक्रिप्शन विस्तार को कम करके ट्रांसक्रिप्शन स्टार्ट साइट के कई किलोबेस डाउनस्ट्रीम स्थित ऑपरेटरों से 90% से अधिक दमन हासिल किया। लैसिगी दमनकार के साथ या बिना चूहों के छोटे इंटेनस्टीन में mKate2 अभिव्यक्ति की कन्फोकल छवियों ने इंट्रॉन-आधारित दृष्टिकोण को मान्य किया।टाट और लाख ऑपरेटर दृश्यों के साथ संशोधित अंतर्जात DNMT1 एलील युक्त भ्रूणस्टेम कोशिकाओं में DNMT1 अभिव्यक्ति के मजबूत अपरेगुलेशन और डाउनरेगुलेशन हासिल किए गए थे। दोनों विनियम आईपीटीजी और डॉक्स उपचार द्वारा पूरी तरह से प्रतिवर्ती और अकांक्षित थे। लिवर, तिल्ली और किडनी से डीएनएमटी1 का मजबूत अपरेजेशन देखा गया।हालांकि, दिल में कोई पता लगाने योग्य उपनियम नहीं देखा गया था, सुझाव है कि कोशिका चक्र पर निर्भर DMNT1 के अभिव्यक्ति पैटर्न और दिल में प्रसारित कोशिकाओं की कमी इस अवलोकन आबाद हो सकता है । अपनी अभिव्यक्ति में हेरफेर करके एक महत्वपूर्ण जीन के वीवो समारोह में अध्ययन अक्सर घातकता के कारण चुनौतीपूर्ण रहा है । हमारी विधि ने हमें अपने हित के जीन के लिए घातक फेनोटाइप को दूर करने की अनुमति दी और हमें वीवो में ट्यूमरोजेनेसिस में अपनी भूमिका का अध्ययन करने में सक्षम बनाया।इसी तरह इस तकनीक से अन्य जरूरी जीन की जांच की जा सकेगी, जिनका अध्ययन करना मुश्किल हो गया है।

Research

JoVE Journal

Genetics

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

इन विट्रो प्रतिलेखन Assays और दवाओं की खोज में अपने आवेदन

In vitro transcription assays have been developed and widely used for many years to study the molecular mechanisms involved in transcription. This process ...

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

संयंत्र पैथोजन की आनुवंशिक हेरफेर<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; फफूंद जीवविज्ञान और संयंत्र सूक्ष्म जीव बातचीत का अध्ययन करने के लिए

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the ...

Inducible T7 RNA Polymerase-mediated Multigene Expression System, pMGX

Inducible T7 आरएनए पोलीमरेज़ मध्यस्थता बहुउद्देशीय अभिव्यक्ति प्रणाली, पीएमजीएक्स

Co-expression of multiple proteins is increasingly essential for synthetic biology, studying protein-protein complexes, and characterizing and harnessing ...

Controllable Ion Channel Expression through Inducible Transient Transfection

Inducible क्षणिक अभिकर्मक के माध्यम से चलाया आयन चैनल अभिव्यक्ति

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be ...

Studying Cell Cycle-regulated Gene Expression by Two Complementary Cell Synchronization Protocols

दो पूरक सेल तुल्यकालन प्रोटोकॉल द्वारा सेल चक्र-विनियमित जीन अभिव्यक्ति का अध्ययन करना

The gene expression program of the cell cycle represents a critical step for understanding cell cycle-dependent processes and their role in diseases such ...

Production and Purification of Baculovirus for Gene Therapy Application

जीन थेरेपी आवेदन के लिए Baculovirus का उत्पादन एवं शुद्धिकरण

Baculovirus has traditionally been used for the production of recombinant protein and vaccine. However, more recently, baculovirus is emerging as a ...

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis एलिगेंस में Ploidy का हेरफेर

Mechanisms that involve whole genome polyploidy play important roles in development and evolution; also, an abnormal generation of tetraploid cells has ...

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

जड़ Microbiome की खोज: मिट्टी, Rhizosphere से बैक्टीरियल समुदाय डेटा निकालने, और जड़ Endosphere

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...

Manipulation of Gene Function in Mexican Cavefish

मैक्सिकन Cavefish में जीन समारोह के हेरफेर

Cave animals provide a compelling system for investigating the evolutionary mechanisms and genetic bases underlying changes in numerous complex traits, ...

Efficient Transcriptionally Controlled Plasmid Expression System for Investigation of the Stability of mRNA Transcripts in Primary Alveolar Epithelial Cells

प्राथमिक अल्वेलर एपिथेलियल कोशिकाओं में एमआरएनए ट्रांसक्रिप्ट की स्थिरता की जांच के लिए कुशल ट्रांसक्रिप्शनी नियंत्रित प्लाज्मिड अभिव्यक्ति प्रणाली

Studying posttranscriptional regulation is fundamental to understanding the modulation of a given messenger RNA (mRNA) and its impact on cell homeostasis ...