Name: in vivo application of the remote-control system for the manipulation of endogenous gene expression
Uploaded: 2019-03-29T14:00:00
Duration: 8 min 54 s
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Ringraziamo il tardo Dr Heidi Scrable per suo generoso dono del costrutto gene lacI mammiferi (Mayo Clinic, Rochester, MN), Dr Daniel Louvard (Institut Curie, Parigi, Francia) per fornire il promotore di villina e Dr Laurie Jackson-Grusby (ospedale pediatrico, Boston, MA) per i suoi contributi alle prime fasi di questo sviluppo di tecnologia. Siamo grati per Dr Nancy Wu e Dr Robert Maxson per la loro assistenza nella generazione di topi transgenici e knockoui. Si ringraziano i membri del laboratorio Laird per utili discussioni e supporto. Questo lavoro è stato supportato dal National Institutes of Health [CA75090 R01, DA030325 R01, CA157918 R01 e R01 CA212374 a p.w.l. e 1F31CA213897-01A1 a N.A.V.S].

PWL serve sul Scientific Advisory Boards di AnchorDx e Progenity, Inc.

Un passaggio fondamentale e limitazione potenziale del sistema di controllo remoto è la sfida connessa con l'inserimento di repressore e/o siti di legame di attivatore senza alterare l'espressione genica. Il nostro approccio originale di repressione, come applicata al gene Dnmt1 , coinvolti inserimento di siti di legame di repressore lac all'interno di regioni trascrizionalmente critiche di un promotore. Al fine di ridurre il rischio di intaccare la funzione di promotore e quindi di migliorare l'applicabilità generale del sistema di controllo remoto, abbiamo sviluppato un approccio basato su introne repressione. La potenza del nostro sistema avanzata lac ci ha permesso di strettamente reprimere la trascrizione di tutti i promotori forti abbiamo testato presso operatori situati centinaia di parecchi kilobasi a valle della trascrizione avvia siti (Figura 3A – C) 10. d'importanza, i livelli di repressione erano indipendenti dei punti di forza trascrizionale dei promotori (Figura 3A – C)10. Ciò suggerisce che la capacità di repressione del nostro sistema basato su introne repressione supera la forza trascrizionale dei promotori testati. In questo approccio basato su introne, è probabile che la repressione è mediata attraverso interferenze fisiche tra due componenti, il macchinario di allungamento della trascrizione e il lac repressori57. Questo meccanismo semplice repressione e l'affidabilità dimostrata del metodo basato su introne possono rendere questo approccio generalmente applicabile ad organismi, tessuti e geni differenti.
Il upregulation del sistema di controllo remoto richiede le sequenze di associazione transactivator di essere in prossimità del promotore del gene di destinazione, che comporta un rischio di intaccare la funzione di promotore. Tuttavia, abbiamo trovato che la posizione di sequenze di associazione può essere di fuori della regione critica trascrizionalmente. Promotori sia Dnmt1 ed EF1α erano robustamente sovraregolati da tet operatori si trovano un paio di centinaia di basi a Monte della trascrizione inizio siti10. Questo vincolo rilassato riduce notevolmente la possibilità di pregiudicare la funzione di promotore di un gene bersaglio in assenza del transactivator. Aumentando il numero di associazione sequenze e/o uso di transactivators più forte potrebbe contribuire a ridurre ulteriormente il rischio attivando upregulation da siti più lontano il sito di inizio della trascrizione.
Il nostro sistema di controllo remoto fornisce elegante controllo dei livello, il tempismo e la posizione dell'espressione genica endogena, consentendo per testare la reversibilità di un fenotipo e le conseguenze dei livelli di espressione diversa, che non sono facilmente ottenibili da attuali tecnologie di controllo di espressione genica in vivo. È importante notare che nella maggior parte delle analisi di espressione genica, compreso il nostro, espressione valori rappresentano la media di una popolazione di cellule tra cui considerevole variazione può essere trovata. Questa eterogeneità può influenzare i processi decisionali cellulari, come differenziazione o apoptosi58. Anche se la precisione del controllo di espressione genica potrebbe probabilmente essere ulteriormente migliorata da ulteriori circuito genetico ingegneria59, la potenza osservata del nostro attuale sistema permetterà utile indagine della funzione genica in molti contesti biologici. Inoltre, un elevato grado di specificità di bersaglio è previsto a causa della complessità delle sequenze di operatore, nonché la grande distanza evolutiva tra mammiferi e le specie di origine dei componenti regolatori60. Inoltre, linee di topi transgenici di attivatori e repressori possono essere sviluppate e utilizzate per qualsiasi gene endogeno. Ad esempio, modelli di mouse transactivator tet esistenti possono essere adattati per compire il upregulation di un determinato gene nei tessuti del mouse desiderato. Abbiamo recentemente sviluppato una linea transgenica che può guidare robusta espressione tessuto-specifica del nostro repressore lac rafforzata in diversi tipi di tessuto quando combinato con linee di Cre esistenti introducendo il gene lacIGY nel locus Hipp11 48 sotto il controllo di un elemento di Lox-STOP-Lox (non pubblicato). Questa linea sarebbe sostanzialmente facilitare l'applicazione di tessuto-specifica del sistema di controllo remoto.
Upregulation di gene dal sistema di controllo remoto fornisce diversi vantaggi rispetto alle attuali approcci transgenici inducibili. Non richiede la generazione di più linee transgeniche per testare gli effetti di posizione dell'inserzione, poiché utilizza il locus endogeno. Inoltre, questo approccio è adatto upregulation dei geni con espressione basale forte perché migliora l'espressione da un promotore già robusto, considerando che modelli transgenici convenzionali si basano su minimi promotori virali. Infine, il tessuto specificità, controllo del ciclo cellulare e varianti di geni bersaglio di splicing possono essere conservati su upregulation dal nostro approccio, cui conserva elementi di regolazione naturale come innata cis-elementi regolatori. L'avvento della tecnologia di gene-targeting CRISPR/Cas-mediata agevolerà notevolmente l'applicazione di questa tecnologia in sistemi modello diversi.

Knockout genetica o approcci transgenici sono stati efficaci mezzi per studiare la funzione del gene in modelli animali. Tuttavia, la regolazione dell'espressione di questi approcci è dicotomica (acceso/spento), non-temporale e quindi non è in grado di rivelare lo spettro completo e funzionale di un gene. Condizionale Cre/LoxP tecnologie hanno permesso spazio-temporali inattivazione o l'attivazione della funzione del gene, ma la loro natura dicotomica continua a porre limitazioni, quali cella letalità e irreversibilità1,2 , 3. al fine di riempire questo vuoto, condizionali atterramento approcci sono stati sviluppati utilizzando tet-regolato shRNA o miRNA4. Tuttavia, fuori bersaglio effetti rimangono una preoccupazione per RNAi5 e sono stato impegnativo per controllare in vivo. Più recentemente, tecnologie di controllo trascrizionale mediata da CRISPR e Cas hanno introdotto un approccio più versatile per raggiungere up - e downregulation dell'espressione del gene endogeno e hanno dimostrato la loro utilità6,7 . Tuttavia, l'efficacia del controllo trascrizionale mediata da CRISPR e Cas è ancora chiaro in vivo e la reversibilità della repressione basata su KRAB rimane per essere visto, come forte repressione da KRAB e sua proteina interagente KAP1 è stato indicato per indurre 8,9il silenziamento genico permanente.
Per risolvere queste limitazioni, abbiamo sviluppato un nuovo sistema di regolamentazione trascrizionale in grado di controllare in modo condizionale espressione genica endogena in un reversibile e sintonizzabile modo nei topi utilizzando progettato procariotica binario trascrizionale sistemi di regolamentazione10. Prokaryotic binari sistemi normativi trascrizionale con ligandi di regolamentazione, come lac e tet, hanno permesso tali reversibile e sintonizzabile espressione controllo11,12,13, 14. Tuttavia, la potenza di repressione inadeguato il sistema binario corrente ha impedito loro l'adozione per controllo dell'espressione genica endogena nei mammiferi. Abbiamo sviluppato un sistema di repressione lac avanzata sufficientemente potente per la repressione di geni endogeni e impiegato una nuova strategia di targeting tet attivatori trascrizionali direttamente al cognate promotore di un gene endogeno per raggiungere upregulation robusto (Figura 1)10. Con questa tecnologia, abbiamo raggiunto quasi due ordini di grandezza controllo di espressione del gene endogeno Dnmt1 in un modo sintonizzabile, viscoelastico e reversibile10. Qui forniamo istruzioni dettagliate per la sua applicazione in vivo ad altri geni e organismi utilizzando topi come una specie di modello.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59235/59235fig1.jpg"> Figura 1 : Panoramica del sistema di controllo remoto. La trascrizione di un gene target endogeni può essere regolata utilizzando derivati dal lac repressore e sistemi di attivatore di tet . Il promotore del gene bersaglio o introne è progettato per contenere operatori per il repressore LacIGY tight binding e/o rtattivatore TA-M2. R indica Repron (Repression intrin), che contiene 12 operatori lac simmetrica (S) più un introne di beta-globina coniglio parziale. T indica l'operatore di tet . Il repressore e/o attivatore è/sono espressi da un promotore tessuto-specifica. L'espressione del gene dell'obiettivo può quindi essere sintonizzato reversibilmente al livello di espressione desiderata dall'amministrazione di IPTG (isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside, un antagonista del repressore di LacIGY) o doxiciclina (Dox). Questa figura è stata modificata da Lee et al.10<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59235/59235fig1large.jpg" target="_blank">fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Prima di iniziare questo protocollo, esaminare la tabella 1 per identificare le operazioni rilevanti per il controllo desiderato dell'espressione genica. Ad esempio, per progettare un mouse che consente reversibile downregulation di "Gene X", completare sezioni 1, 3 e 4 del sotto protocollo. La tabella 1 riassume anche i componenti necessari del sistema di controllo remoto.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Cambiamento di espressione desiderata</td>
			<td>Repressione solo</td>
			<td>Attivazione solo</td>
			<td>Sia di repressione e di attivazione</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sezioni pertinenti del protocollo</td>
			<td>1, 3-4</td>
			<td>2-4</td>
			<td>1-4</td>
		</tr>
<tr>
<td>Telecomando sequenza necessaria nel Gene Target</td>
			<td>Repron ("Introne repressione"; 12 operatori lac simmetrico più un introne di beta-globina coniglio parziale)</td>
			<td>Tet all'operatore</td>
			<td>All'operatore Repron e Tet</td>
		</tr>
<tr>
<td>Posizione di sequenza telecomando</td>
			<td>Introne</td>
			<td>Promotore</td>
			<td>Introne & Promoter</td>
		</tr>
<tr>
<td>Attivatore/repressore necessari per controllo desiderato</td>
			<td>LacIGY repressore</td>
			<td>Attivatore di rtTA-M2</td>
			<td>LacIGY repressore e attivatore rtTA-M2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ligandi normativi</td>
			<td>IPTG</td>
			<td>Doxiciclina</td>
			<td>IPTG e/o doxiciclina</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: Panoramica di componenti di controllo remoto.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:715px;" width="715">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">B6C3F1/J</td>
			<td style="width:149px;">The Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:183px;">100010</td>
			<td style="width:167px;">https://www.jax.org/strain/100010</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cas9 Protein</td>
			<td style="width:149px;">PNA Bio</td>
			<td style="width:183px;">CP04</td>
			<td>http://www.pnabio.com/products/CRISPR_Cas9.htm?gclid=EAIaIQobChMIsoG8pLL33QIVBr7ACh0naQ4dEAAYAiAAEgKyHvD_BwE</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CRISPOR</td>
			<td>Haeussler et al. 2016</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td>http://crispor.tefor.net/</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Doxycycline-Containing Mouse Diet</td>
			<td style="width:149px;">Envigo</td>
			<td style="width:183px;">Varies by concentration</td>
			<td>https://www.envigo.com/products-services/teklad/laboratory-animal-diets/custom-research/doxycycline-diets/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ENCODE Database</td>
			<td style="width:149px;">Stanford University</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td>https://www.encodeproject.org/</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">iCre mRNA synthesis plasmid (pBBI)</td>
			<td style="width:149px;">Addgene</td>
			<td>65795</td>
			<td>https://www.addgene.org/65795/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">IPTG</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td style="width:183px;">I2481C</td>
			<td>https://www.goldbio.com/search?isSearch=Y&#38;q=iptg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">pGL3-Basic</td>
			<td style="width:149px;">Promega</td>
			<td style="width:183px;">E1751</td>
			<td>https://www.promega.com/products/reporter-assays-and-transfection/reporter-vectors-and-cell-lines/pgl3-luciferase-reporter-vectors/?catNum=E1751</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">SVM-BPfinder</td>
			<td style="width:149px;">Regulatory Genomics, Pompeu Fabra University</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td>http://regulatorygenomics.upf.edu/Software/SVM_BP/</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">TiProD: Tissue specific promoter Database</td>
			<td style="width:149px;">Department of Bioinformatics, UMG,&#160;University of G&#246;ttingen&#160;</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td>http://tiprod.bioinf.med.uni-goettingen.de</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">UCSC Genome Browser</td>
			<td style="width:149px;">University of California Santa Cruz</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td>https://genome.ucsc.edu/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo application of the remote-control system for the manipulation of endogenous gene expression

Qui descriviamo un protocollo per l'implementazione del sistema di controllo remoto (Reversible Modifica of Transcription Endogenous loci), che consente un controllo reversibile e sintonizzabile l'espressione di un sistemi modello gene endogeno di interesse nella vita. Il sistema di controllo remoto utilizza avanzata lac repressione e tet attivazione sistemi per raggiungere giù - o upregulation di un determinato gene all'interno di un unico sistema biologico. Repressione stretto può essere raggiunto da repressore associazione siti flessibilmente situati lontano a valle di un sito di inizio trascrizione inibendo l'allungamento della trascrizione. Upregulation robusto può essere raggiunto aumentando la trascrizione di un gene endogeno prendendo di mira il attivatori trascrizionali tet al promotore cognato. Questo controllo di espressione reversibile e sintonizzabile può essere applicato e ritirato ripetutamente negli organismi. La potenza e la versatilità del sistema, come dimostrato per endogena Dnmt1 qui, vi permetterà più precisare analisi funzionale in vivo consentendo indagini di funzione del gene a vari livelli di espressione e verificando la reversibilità di un fenotipo.

La capacità di repressione del regime di controllo remoto è stata dimostrata in due diversi approcci finora. Nel primo approccio, siti di legame del repressore lac sono stati inseriti al promotore del gene di Dnmt1 endogeno. Nel secondo approccio, che è consigliato dal presente protocollo, i siti di legame del repressore sono stati inseriti in un introne a valle per evitare il rischio di intaccare la funzione di promotore tramite l'inserzione e, quindi, per semplificare l'applicazione del telecomando- sistema. Entrambi gli approcci hanno provocato successo repressione (Figura 2A, B e Figura 3A-C)10. DNMT1 espressione fu repressa al 15% dei livelli non regolamentati utilizzando l'approccio basato su promotore (Figura 2A). Questa repressione stretta è stata invertita in modo dose-dipendente trattando i topi con quantità variabili di IPTG (Figura 2A). La repressione di Dnmt1 osservata è stata convalidata a livello proteico immunostaining (Figura 2B). Non abbiamo osservato alcuna differenza nell'espressione Dnmt1 tra Dnmt1+ + e Dnmt1LO/LO topi, confermando che il nostro inserimento di operatore lac non aveva interrotto promotore normale funzione10. L'approccio basato su introne raggiunto più di 90% di repressione da parte degli operatori si trova parecchi kilobasi a valle del sito di inizio trascrizione attenuando trascrizione allungamento (Figura 3A, B)10. Questo approccio basato su introne è stato ulteriormente convalidato sui sette ulteriori robusti promotori (Figura 3C). Repressione invariabilmente stretto è stato raggiunto da tutti i promotori testati. È stata osservata alcuna correlazione tra i livelli di espressione residua e i punti di forza dei promotori, suggerendo che la capacità di repressione del nostro sistema basato su introne repressione supera la potenza trascrizionale di tutti i promotori robusta abbiamo testato ( Figura 3 C).
La capacità di in vivo upregulation del sistema telecomando inoltre è stata dimostrata sul gene Dnmt1 . Abbiamo introdotto due copie dell'operatore tet nel promotore Dnmt1 , insieme a sequenze di operatore lac , per consentire o upregulation o downregulation a seconda di quale effettrici proteina è presente. Upregulation robusto e downregulation dell'espressione Dnmt1 , vicino a due ordini di grandezza (10% al 650%), sono stati raggiunti in CES che contiene l'allele di Dnmt1 endogeno modificata (Dnmt1LGT) (Figura 4A)10 . Entrambi i regolamenti sono stati completamente reversibile e viscoelastico dai trattamenti IPTG e Dox, rispettivamente (Figura 4A). Successivamente abbiamo introdotto la modifica Dnmt1LGT nella linea germinale del mouse per testare la capacità di in vivo upregulation del sistema di controllo remoto. Forte upregulation di Dnmt1 è stata osservata da fegato, milza e rene, mentre nessun upregulation rilevabile nel cuore è stata osservata (Figura 4B)7. Il modello di espressione del ciclo cellulare-dipendente di Dnmt1 e la scarsità delle cellule proliferative nel cuore può essere alla base di questa osservazione10,56. Resta da vedere se questa limitazione può essere superata aumentando il livello di espressione di attivatore o il numero dei suoi siti di legame.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59235/59235fig2.jpg"> Figura 2 : In vivo repressione di Dnmt1 dal repressore LacIGY. Topi (A), con operatori di lac (LO), inseriti nel promotore Dnmt1 , con o senza espressione di LacIGY, sono stati trattati con varie dosi di IPTG. qRT-PCR analisi di espressione Dnmt1 dimostra l'inversione di dose-dipendente di Dnmt1 repressione in vivo dal trattamento di IPTG. Ogni barra rappresenta dati da un altro mouse. I dati rappresentano la media ± SEM (n = 3). (B) Immunostaining di Dnmt1 proteine nelle cripte coliche dei topi fornito acqua potabile con o senza 160 mM IPTG per 3 settimane. Questa figura è stata modificata da Lee et al.10<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59235/59235fig2large.jpg" target="_blank">fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59235/59235fig3.jpg"> Figura 3 : In vivo e repressione in vitro dei vari promotori dal sistema di controllo remoto. (A) una prima versione della sequenza Repron (R *) è stato inserito in un introne a valle del promotore villina in un topo transgenico villina-mKate2 (VilmKate2). viene visualizzata la finestra di analisi qRT-PCR dell'espressione di mKate2 nell'intestino tenue dei topi con o senza il repressore di LacIGY . Ogni barra rappresenta dati da un altro mouse. (B) mKate2 confocale immagini del piccolo intestino con e senza espressione di LacIGY . (C) sei operatori lac simmetrica (S) sono stati inseriti tra i vari promotori e un reporter di luciferase. Reporter (50 ng/pozzetto in piastra a 96 pozzetti) e repressore plasmidi transitoriamente sono stati introdotti nelle cellule di NIH/3T3 in un rapporto molare 1:1. Valori di luciferasi sono stati valutati 24 h dopo la trasfezione. Questi dati in vitro rappresentano la percentuale di espressione di luciferasi in LacIGY-che esprimono le cellule rispetto a quelli che esprimono non funzionali LacI (NFlacI). T-test sono stati utilizzati per determinare la significatività statistica. I dati rappresentano la media ± SEM (n = 3). P ≤ 0.05, * *P ≤ 0,01. Questa figura è stata modificata da Lee et al.10<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59235/59235fig3large.jpg" target="_blank">fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59235/59235fig4.jpg"> Figura 4 : Down - e/o upregulation dell'espressione Dnmt1 in vitro e in vivo. (A) il sistema di controllo remoto completo è stato progettato nel CES colta di gene targeting ed elettroporazione approcci. Massima repressione dell'espressione Dnmt1 è stata realizzata con nessun trattamento mentre attivazione massimale è stato raggiunto dal trattamento di Dox e IPTG. I dati rappresentano la media ± SEM (n = 3). P ≤ 0.05, * *P ≤ 0,01 (di Welch t-test). (B) attivazione In vivo di Dnmt1 dal sistema di controllo remoto, come dimostrato immunostaining di Dnmt1 proteina in vari tessuti dai topi di controllo remoto. L'allele LGT rappresenta modifica promotore di Dnmt1 per contenere i siti di legame di attivatore di operatore e tet di lac . Topi sono stati trattati con una dieta normale o contenenti Dox (5000 mg/kg Doxycycline Hyclate) per un mese. Questa figura è stata modificata da Lee et al.10<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59235/59235fig4large.jpg" target="_blank">fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Supplementary Figure 1" src="/files/ftp_upload/59235/59235supfig1.jpg"> Complementare figura 1 : Esempio di inserimento di rilievo di atterraggio in murino Dnmt1 introne 1. (A) schema del modello di DNA per atterraggio inserimento pad, adattato da Quadros et al (2015)31. Eterotipiche loxP siti, JT15 e Lox2272, sono separati da una sequenza di brevi distanziale (sp) e fiancheggiati da ogni lato da 60-bp di DNA che è omologo alla regione genomica di destinazione. (B) DNA campione modello per atterraggio pad inserimento in introne Dnmt1 utilizzando il seguente sgRNA: CTAGTACCACTCCTGTACCG (che è destinato a filo del inverso). La regione intronic selezionata era bioinformatically informato dal passo 1.1 e il sgRNA è stato identificato usando CRISPOR29. (C) esempio di disegno dell'iniettore di PCR per valutare l'inserimento alla piattaforma di atterraggio. Gli iniettori di PCR sono stati progettati di fuori le braccia di omologia del modello per confermare integrazione endogeno Dnmt1. L'amplicone PCR wildtype ' 213 bp; al momento dell'inserimento, diventa 291 BP. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59235/59235supfig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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In vivo Application of the REMOTE-control System for the Manipulation of Endogenous Gene Expression

Applicazione in vivo del sistema di controllo remoto per la manipolazione dell'espressione genica endogena

Questo protocollo illustra i passaggi necessari per generare un sistema di modello in cui la trascrizione di un gene endogeno di interesse può essere controllata in modo condizionale in animali vivi o celle utilizzando avanzata lac repressore e/o sistemi di attivatore di tet .

Here we describe a protocol for implementing the REMOTE-control system (Reversible Manipulation of Transcription at Endogenous loci), which allows for ...

Il significato del nostro metodo è la sua versatilità e potenza. Consente ai ricercatori di avere un robusto controllo sull'espressione genica endogena in modi che sono stati difficili da ottenere utilizzando i metodi esistenti. Permette ai ricercatori di indagare la funzione di un gene a vari livelli di espressione e in modo spazio-temporale.Quindi consente di testare la reversibilità di un fenotipo, che è utile quando si studiano i geni correlati alla malattia. Per compiere la repressione, l'introne genico bersaglio è progettato per contenere repron R, che contiene 12 operatori lac simmetrici. Quando il repressore LacIGY è espresso dal promotore specifico del tessuto desiderato, il gene bersaglio viene represso.La repressione del gene bersaglio può essere invertita o adattata al livello di espressione desiderato mediante somministrazione di IPTG, un antagonista del repressore LacIGY. Per realizzare l'upregolazione, il promotore genico target è progettato per contenere quattro o più operatori Tat, T, come siti di binding per gli attivatori rtTA-M2. Quando l'attivatore è espresso dal promotore desiderato specifico del tessuto in presenza di doxiciclina, viene indotta l'upregolazione del gene bersaglio.L'upregolazione del gene bersaglio può essere invertita o regolata al livello di espressione desiderato ritirando o alterando la concentrazione di doxiciclina. Per realizzare sia la repressione che l'attivazione, i sistemi di repressore Lac e attivatore Tat possono essere combinati. Per modificare il gene di interesse per la repressione, è necessario identificare un introne inerte trascrittamente verso l'estremità dei cinque primi del gene di interesse per l'inserimento della sequenza di repron.Per ottenere la sequenza genomica per il gene di interesse, passare al browser del genoma UCSC e selezionare l'ultima bozza del genoma del topo sotto la scheda genomi. Immettere il nome o il simbolo del gene di interesse nella barra di ricerca per visualizzare le trascrizioni per il gene e quindi fare clic su vai. Quindi, selezionare la variante di trascrizione desiderata per il gene di interesse e fare clic sul simbolo del gene accanto alla variante di trascrizione di interesse.Successivamente, sotto la sequenza e i collegamenti a strumenti e database banner, fare clic sul collegamento della sequenza genomica. Per le opzioni dell'area di recupero delle sequenze, selezionare solo esoni, introni e un record FASTA predefinito per gene. Per sequenziare le opzioni di formattazione, selezionare esoni in maiuscolo, tutto il resto in minuscolo e la maschera si ripete in N.Quindi, fare clic su Invia.Infine, salvare questa sequenza, mantenendo la formattazione maiuscola e minuscola in un documento o in un programma che può essere annotato. Per evitare l'interruzione delle isole CpG, selezionare mostra per la traccia delle isole CpG sotto il banner di espressione e regolazione del browser del genoma UCSC e fare clic su aggiorna. Ingrandindo i cinque introni primi, clicca su ogni isola CpG mostrata in verde e seleziona visualizza il DNA per questa funzione.Dopo aver selezionato le ripetizioni della maschera su N, fare clic su ottieni DNA per ottenere la sequenza delle isole CpG. Infine, sovrapponi queste sequenze con il file di sequenza originale e annotale come regioni introniche da evitare. Per evitare le regioni introniche con firme enhancer nei tessuti di interesse, passare alla base di dati ENCODE e selezionare l'icona degli esperimenti.Per il tipo di saggio, selezionare ChiP-seq o DNase-seq e popolare le altre categorie in base alle celle da progettare. Dopo la selezione delle feature, selezionare il pittogramma più a sinistra in blu, per il quale vengono visualizzato i risultati della visualizzazione come elenco. Quindi, selezionare i set di dati per le destinazioni di monometilazione h3k4, acetilazione h3k27, DNasi 1 e CTCF che corrispondevano maggiormente alle celle da progettare.All'interno di ogni set di dati pertinente scorrere fino alla sezione del file, verificare che mm10 e UCSC siano selezionati e fare clic sul pulsante visualizza. Ora, nel browser del genoma UCSC, ingrandite i cinque introni primi e fate clic su ogni picco nelle tracce di picco annotate. Ottenere la sequenza di DNA per ogni regione di picco cliccando sulle coordinate cromosomiche per ogni picco.Nel menu a discesa visualizza, selezionate DNA e fate clic su ripetizioni maschera (Mask Repeats) su N.Infine, sovrapporte queste sequenze con il file di sequenza originale e annotatele come regioni introniche da evitare. Per identificare uno sgRNA nelle restanti regioni introniche con alta specificità e punteggi di efficienza previsti, passare a uno strumento di progettazione di sgRNA online preferito, come CRISPOR. Immettere la sequenza della regione di interesse intronica, specificare il genoma di riferimento pertinente e selezionare il motivo adiacente del protospazior desiderato.Quindi, fare clic su Invia. Quindi, ordina gli sgRNA previsti in base al punteggio di specificità e seleziona uno o più sgRNA che hanno anche un punteggio di efficienza previsto elevato. Infine, progetta un modello di DNA contenente una sequenza di piattaforma di atterraggio PITT affiancata su entrambi i lati da bracci di omologia a 60 basi che corrispondono al sito di taglio dello sgRNA.Per l'inversione della repressione genica bersaglio, somministrare IPTG nell'acqua potabile dei topi allevati omozigoti con l'allele di interesse modificato sciogliendo completamente la quantità desiderata di IPTG in acqua distillata sterile il giorno della somministrazione. Avvolgere la bottiglia con un foglio e somministrare l'acqua IPTG in una bottiglia leggera protetta ai topi del genotipo appropriato e controlli per almeno una settimana. Procedere all'analisi dell'espressione del gene di interesse nel tessuto bersaglio.Per indurre l'upregolazione genica, somministrare doxiciclina nella dieta per una settimana e procedere all'analisi dell'espressione del gene di interesse nel tessuto bersaglio. l'anaylisis PCR qRT ha mostrato che l'espressione DNMT1 è stata repressa al 15% dei livelli non regolamentati utilizzando l'approccio basato sul promotore. La repressione è stata invertita in modo dose-dipendente trattando topi con quantità variabili di IPTG.La repressione del DNMT1 osservata e l'inversione della repressione DNMT1 da parte del trattamento IPTG sono state convalidate a livello proteico mediante immunosocienza. L'analisi PCR qRT dell'espressione mKate2 ha mostrato che l'approccio basato sull'introne ha raggiunto oltre il 90% di repressione da parte di operatori situati a diversi kilobase a valle del sito iniziale di trascrizione attenuando l'allungamento della trascrizione. Le immagini confocali dell'espressione mKate2 nella piccola intensificazione dei topi con o senza il repressore LacIGY hanno convalidato l'approccio basato sull'introne.Robusta upregulation e downregulation dell'espressione DNMT1 sono stati ottenuti in cellule staminali embrionali contenenti l'allele Endogeno DNMT1 modificato con sequenze di operatori Tat e Lac. Entrambe le normative erano completamente reversibili e inducibili dai trattamenti IPTG e Dox. Forte upregulation di DNMT1 è stato osservato dal fegato, milza e rene.Tuttavia, non è stata osservata alcuna upregulation rilevabile nel cuore, suggerendo che il modello di espressione dipendente dal ciclo cellulare di DMNT1 e la scarsità di cellule proliferatrici nel cuore possono essere alla base di questa osservazione. Studiare la funzione in vivo di un gene critico manipolandone l'espressione è stato spesso impegnativo a causa della letalità. Il nostro metodo ci ha permesso di superare il fenotipo letale per il nostro gene di interesse e ci ha permesso di studiare il suo ruolo nella tumorogenesi in vivo.Allo stesso modo, questa tecnologia consentirà lo studio di altri geni essenziali che sono stati difficili da studiare.

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