Name: in vivo application of the remote-control system for the manipulation of endogenous gene expression
Uploaded: 2019-03-29T14:00:00
Duration: 8 min 54 s
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我々 は後半の Dr ハイジ Scrable ラッチ哺乳類遺伝子コンストラクト (メイヨー クリニック、ロチェスター、ミネソタ) の彼女の寛大な贈り物に感謝博士ダニエル Louvard (Institut キュリー、パリ、フランス) ビリン プロモーターを提供するため、Grusby-ジャクソン博士・ ローリー (こども病院、ボストン、MA) この技術開発の初期段階への彼女の貢献のため。トランスジェニック、ノックアウト マウスを生成に彼らの支援のため博士ナンシー呉と Dr ロバート Maxson 感謝しております。我々 は役に立つ議論のレアード研究室のメンバーに感謝し、サポートします。この作品は、国立衛生研究所 [R01 CA75090 R01 DA030325 R01 CA157918、P.W.L. に R01 CA212374 と N.A.V.S に 1F31CA213897 01A1] によって支えられました。

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重要なステップとリモート コントロール システムの潜在的な制限は、ターゲット遺伝子の発現に影響を与えずにリプレッサーおよび/または活性剤結合部位のカーソルに関連付けられている課題です。抑圧の元取り組みDnmt1遺伝子に適用されるプロモーターの転写活性クリティカル領域内にあるlacリプレッサー結合部位の挿入に関与しています。プロモーターの機能に影響を与えるとこのようにリスクを軽減するためにリモート制御システムの一般的な適用性を改善し、抑圧のイントロン ・ ベースのアプローチを開発しました。強化されたラックシステムの効力では、緊密に位置する演算子でテスト我々 すべての強力なプロモーターの転写を抑制することができました転写のいくつか kilobases 下流に数百サイト (図 3A から C) を開始10します。 重要なのは、抑圧のレベルはプロモーター (図 3A から C)10の転写の強みの独立していた。これはイントロンに基づく抑圧体制の抑圧能力がテストのプロモーターの転写強度を超えることを示唆しています。このイントロン ベースのアプローチの抑圧は 2 つのコンポーネント、転写伸長機械と lac リプレッサー57との物理干渉が媒介なりそうです。この単純な抑圧のメカニズムとイントロン手法の実証の堅牢性このアプローチの異なる遺伝子、組織、および有機体に一般的に適用されるレンダリング可能性があります。
リモート コントロール システムによって発現プロモーターの機能に影響を及ぼすリスクを伴いますターゲット遺伝子のプロモーターに近接するトランス結合塩基配列が必要です。しかし、我々 は、シーケンスを結合の位置が重要な発現調節領域の外することができますを発見します。Dnmt1とEF1αプロモーターは、テト演算子から誘導位置数百塩基上流転写開始サイト10の確実だった。この制約が緩和大幅プロモーターの転写活性化の不在でターゲット遺伝子の機能に影響を及ぼす可能性が減ります。シーケンス結合数の増加および/またはより強い transactivators の使用は、転写の開始部位から離してサイトからアップレギュレーションを有効にすることによってリスクを軽減を助けることができます。
リモート管理体制レベル、タイミング、および内因性遺伝子の発現、表現型の可逆性とによって容易に達成可能ではない異なった表現のレベルの結果のテストを可能にする場所のエレガントなコントロールを提供します。現在 in vivo 遺伝子発現制御技術。私たちを含めたほとんどの遺伝子発現解析に式の値がその中ではかなりの変動を見つけることができますセルの人口の平均を表すことに注意してくださいすることが重要です。この不均一性58分化やアポトーシスなどの細胞の意思決定プロセスに影響を与える可能性があります。付加的な遺伝的回路工学59の遺伝子発現制御の精度がさらに改善される見通し、現在のシステムの観察力できるようになります遺伝子機能の役に立つ調査多くの生物学的文脈で。さらに、ターゲットの特異性の高度は規制コンポーネント60元の種と哺乳類の大規模な進化距離と同様、演算子のシーケンスの複雑さのためになっています。さらに、トランスジェニック マウス リプレッサー活性剤の行数を開発し、任意の内因性遺伝子を採用できます。たとえば、既存テト転写活性化マウス モデルは目的のマウス体内の標的遺伝子の発現を達成するために合わせることができます。我々 は最近車Hipp11軌跡48 lacIGY遺伝子導入することにより既存の Cre 線と組み合わせれば複数の組織型で私たちの強化されたラックのリプレッサーの堅牢な組織特異的発現トランスジェニック ラインを開発(未発表) Lox 停止 Lox 要素の制御の下で。この行が大幅にリモート コントロール システムの組織固有のアプリケーションを容易にします。
リモート コントロール システムによって遺伝子の発現は、現在の誘引可能な遺伝子導入アプローチと比較していくつかの利点を提供します。これは内因性の軌跡を活用して、カーソルの位置の影響をテストする複数の遺伝子組換え行の生成は必要ありません。さらに、このアプローチは強い基準式と遺伝子の発現に適してそれは、すでに強固なプロモーターから発現を高めるためし最小限のウイルス プロモーターに頼る従来のトランスジェニック モデル。最後に、組織特異性、細胞周期制御、およびターゲット遺伝子のスプライシングバリアントは保有されますアップレギュレーションに我々 のアプローチとして生来cisなど自然な規制の要素が保持されます-規制要素。CRISPR/Cas を介した遺伝子ターゲティング技術の出現は大幅多様なモデル システムでこの技術の応用を促進します。

遺伝子ノックアウトまたは形質は、動物モデルでの遺伝子の機能を研究する効果的な手段をされています。しかし、これらの方法による発現制御 (オン/オフ) 二分、時間的、従って遺伝子の完全な機能的なスペクトルを明らかにすることができるではないです。条件付き Cre/LoxP技術は、時空間的不活性化や遺伝子機能の活性化を許可しているが、二分本来引き続き細胞致死性と不可逆性1,2などの制限を提起,3。 この隙間を埋めるために条件付きのノックダウン アプローチはテトを使用して開発されている-shRNA や miRNA4を規制。しかし、オフターゲット効果の RNAi5への関心のまま、体内.を制御するために挑戦されています。もっと最近、CRISPR/Cas を介した転写制御技術はアップと内因性遺伝子発現のダウンレギュレーションの両方を達成するためのより柔軟なアプローチを導入し、実証のユーティリティ6,7.しかし、CRISPR/Cas を介した転写制御の有効性は、まだ体内の明確な KRAB ベース抑圧の可逆性はまだ KRAB で見たように、強い抑圧との相互作用の蛋白質 KAP1 が誘導するために示されています。永久的な遺伝子8,9を黙らせます。
新規転写制御システムの条件付きでリバーシブルの内因性遺伝子の発現を制御することができるこれらの制限に対処するために開発した、マウスを使用して可変的設計原バイナリ転写規制システム10。規制配位子、 lacとテトなどを原核生物バイナリ転写規制システムはこのような可逆を有効にしているし、可変式制御11,12,13, 14. ただし、現在のバイナリ システムの不十分な抑制効力哺乳類における内因性遺伝子の発現を制御するため、普及の妨げとなった。内在性遺伝子の抑圧の十分に強力な強化されたラック抑圧システムを開発し、達成するために内因性遺伝子の同種のプロモーターに直接テト転写活性化因子をターゲットの新たな戦略を採用堅牢なアップレギュレーション (図 1)10。この技術により、ほぼ可変、誘導、かつ可逆的な10の内因性Dnmt1遺伝子の発現制御を 2 桁を実現しました。ここでは、他の遺伝子と生物モデル種としてマウスを用いた in vivo 応用のためのステップバイ ステップの手順を提供します。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59235/59235fig1.jpg"> 図 1: リモート コントロール システムの概要。内因性のターゲット遺伝子の転写は、設計されたラックのリプレッサーとテト活性化システムを使用して調整できます。ターゲット遺伝子プロモーターやイントロンはタイトバインディング LacIGY リプレッサーおよび/またはrtの演算子を含めるように設計されて TA M2 活性化。R では、Repron (担当者2977億 intr上)、部分的なウサギのベータ globin イントロン プラス 12 対称 lac オペレーター (S) が含まれていることを示します。T は、テトの演算子を示します。リプレッサーおよび/または活性化/組織固有のプロモーターから表現されます。ターゲット遺伝子の発現、可逆チューニングできる目的の式のレベルに IPTG (イソプロピル β-D-1-thiogalactopyranoside、LacIGY リプレッサーの拮抗薬) またはドキシサイクリン (Dox) の管理によって。この図は、李ら10から変更されている<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59235/59235fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
このプロトコルを開始する前に、表 1遺伝子発現の目的のコントロールの関連するステップを識別するを確認します。たとえば、"遺伝子 X"のリバーシブルのダウンレギュレーションを可能にするマウスを設計、セクション 1、3、および 4 を完了、プロトコルの下。表 1はまた、リモート コントロール システムの必要なコンポーネントをまとめたものです。
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>目的の式の変更</td>
			<td>弾圧のみ</td>
			<td>アクティブ化のみ</td>
			<td>抑圧と活性化</td>
		</tr>
<tr>
<td>プロトコルの関連セクション</td>
			<td>1, 3-4</td>
			<td>2-4</td>
			<td>1-4</td>
		</tr>
<tr>
<td>ターゲット遺伝子で必要なリモート制御シーケンス</td>
			<td>Repron (「抑圧イントロン"; 12 対称 lac オペレーター プラス部分的なウサギのベータ globin イントロン)</td>
			<td>テト オペレーター</td>
			<td>Repron とテトのオペレーター</td>
		</tr>
<tr>
<td>リモート制御シーケンスの場所</td>
			<td>イントロン</td>
			<td>プロモーター</td>
			<td>イントロン ・ プロモーター</td>
		</tr>
<tr>
<td>目的のコントロールに必要な活性化/抑制因子</td>
			<td>LacIGY リプレッサー</td>
			<td>情報を頼むこと M2 活性化</td>
			<td>LacIGY リプレッサーと情報を頼むこと M2 活性化</td>
		</tr>
<tr>
<td>規制配位子</td>
			<td>IPTG</td>
			<td>ドキシサイクリン</td>
			<td>IPTG および/またはドキシサイクリン</td>
		</tr>
</tbody></table>表 1:リモート コントロール コンポーネントの概要します。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:715px;" width="715">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">B6C3F1/J</td>
			<td style="width:149px;">The Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:183px;">100010</td>
			<td style="width:167px;">https://www.jax.org/strain/100010</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cas9 Protein</td>
			<td style="width:149px;">PNA Bio</td>
			<td style="width:183px;">CP04</td>
			<td>http://www.pnabio.com/products/CRISPR_Cas9.htm?gclid=EAIaIQobChMIsoG8pLL33QIVBr7ACh0naQ4dEAAYAiAAEgKyHvD_BwE</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CRISPOR</td>
			<td>Haeussler et al. 2016</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td>http://crispor.tefor.net/</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Doxycycline-Containing Mouse Diet</td>
			<td style="width:149px;">Envigo</td>
			<td style="width:183px;">Varies by concentration</td>
			<td>https://www.envigo.com/products-services/teklad/laboratory-animal-diets/custom-research/doxycycline-diets/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ENCODE Database</td>
			<td style="width:149px;">Stanford University</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td>https://www.encodeproject.org/</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">iCre mRNA synthesis plasmid (pBBI)</td>
			<td style="width:149px;">Addgene</td>
			<td>65795</td>
			<td>https://www.addgene.org/65795/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">IPTG</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td style="width:183px;">I2481C</td>
			<td>https://www.goldbio.com/search?isSearch=Y&#38;q=iptg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">pGL3-Basic</td>
			<td style="width:149px;">Promega</td>
			<td style="width:183px;">E1751</td>
			<td>https://www.promega.com/products/reporter-assays-and-transfection/reporter-vectors-and-cell-lines/pgl3-luciferase-reporter-vectors/?catNum=E1751</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">SVM-BPfinder</td>
			<td style="width:149px;">Regulatory Genomics, Pompeu Fabra University</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td>http://regulatorygenomics.upf.edu/Software/SVM_BP/</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">TiProD: Tissue specific promoter Database</td>
			<td style="width:149px;">Department of Bioinformatics, UMG,&#160;University of G&#246;ttingen&#160;</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td>http://tiprod.bioinf.med.uni-goettingen.de</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">UCSC Genome Browser</td>
			<td style="width:149px;">University of California Santa Cruz</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td>https://genome.ucsc.edu/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo application of the remote-control system for the manipulation of endogenous gene expression

ここでリモート コントロール システム (再反転可能Manipulation of Transcription Endogenous 座) のリバーシブルと可変式制御を実装するためのプロトコルを記述します。生活の興味の内因性遺伝子モデル システムです。リモート コントロール システムでは、ダウンまたは単一の生物学的システムで標的遺伝子の発現を達成するために強化されたラック抑圧とテト活性化システムを採用しています。結合部位が柔軟に位置するリプレッサーからタイトな抑圧を実現できます転写伸長を阻害することによって転写開始部位の下流まで。堅牢なアップレギュレーションがテト同種のプロモーターの転写活性化因子をターゲットに内因性遺伝子のトランスクリプションを高めることによって得られます。この可逆と可変式コントロールが適用され生物で繰り返し撤回できます。効力と内因性Dnmt1 、ここに示されているように、システムの汎用性より正確な体内機能解析により、さまざまな表現のレベルでの遺伝子機能の調査との可逆性をテストすることによって、表現型。

リモート コントロール システムの抑制機能は、2 つの異なるアプローチでこれまで実証されています。最初のアプローチでは、 lacリプレッサー結合部位は内因性Dnmt1遺伝子プロモーターで挿入されました。このプロトコルの推薦する 2 番目の方法でリプレッサー結合部位が挿入によるプロモーターの機能に影響を及ぼす潜在的なリスクを避けるために、それによりリモート制御の適用を簡素化する下流のイントロンに挿入されました。システム。両方のアプローチは、成功した抑圧 (図 2A、B 、図 3 a-c)10で起因しました。Dnmt1の式は、プロモーターを用いたアプローチ (図 2A) を使用して無秩序なレベルの 15% に鎮圧されました。この厳しい弾圧は、IPTG (図 2A) の変化量とマウスを扱うことにより用量依存的に逆転されました。観測Dnmt1の抑圧は、タンパク質レベルで免疫染色 (図 2B) によって認可されました。Dnmt1の間Dnmt1式で任意の顕著な違いは見られなかった+/+およびDnmt1LO/LOマウス、通常プロモーターが私たちlacオペレーター挿入が中断されることはありませんを確認します。関数10。達成イントロン ベースのアプローチよりも事業者から 90% 抑制、転写伸長 (図 3A, B)10を減衰させることによって転写開始部位の下流数 kilobases を位置しています。このイントロン ベースのアプローチは 7 追加堅牢なプロモーター (図 3C) でさらに検証されました。必ず厳しい弾圧は、すべてのテスト プロモーターから実現しました。残留式レベルとプロモーターの強度との相関は認められず, 我々 は (テスト イントロンに基づく抑圧体制の抑圧能力がすべて堅牢なプロモーターの転写の力を超えていることを示唆図 3C)。
リモート コントロール システムの体内アップレギュレーション機能Dnmt1遺伝子に明らかとなった。発現のダウンレギュレーションするエフェクターによって蛋白質が存在を許可するDnmt1プロモーターラックオペレータ シーケンスと共に、テト演算子の 2 つのコピーを導入しました。堅牢なアップレギュレーションと 2 桁 (10% 〜 650%) に近い、 Dnmt1式のダウンレギュレーションが変更された内因性Dnmt1遺伝子 (Dnmt1LGT) (図 4A) を含む Esc で達成された10.両方の規制が完全に元に戻せる、IPTG と Dox の治療によって誘引可能なそれぞれ (図 4A)。次に、リモート コントロール システムの生体内で発現する機能をテストするマウス生殖細胞にDnmt1LGT変更を導入しました。中心部に検出可能なアップレギュレーションは (図 4B)7を認めなかったに対し、 Dnmt1の強いアップレギュレーションが肝臓、脾臓、腎臓、観察されました。Dnmt1の細胞周期依存性発現パターンと中心部における増殖細胞の希少性がこの観測10,56の根底にあります。それは、活性化、またはその結合部位数の発現レベルを増やすことによって、この制限を克服できるかどうか見られることを残る。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59235/59235fig2.jpg"> 図 2: 生体内でLacIGY リプレッサーによってDnmt1の抑圧します。Dnmt1のプロモーター、 LacIGY発現の有無に挿入lacオペレーター (LO) と (A) マウスは IPTG の様々 な用量で扱われました。Dnmt1式の qRT PCR 解析は、IPTG 処理による生体内でDnmt1抑圧の用量依存性逆転を示しています。各バーは、別のマウスからのデータを表します。データを表す平均 ± SEM (n = 3)。(B) マウスの体液で Dnmt1 タンパク質の染色は、3 週間の 160 mM IPTG の有無に飲料水を提供しました。この図は、李ら10から変更されている<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59235/59235fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59235/59235fig3.jpg"> 図 3: 生体内でリモート コントロール システムによって様々 なプロモーターの in vitro における抑圧と。(A) Repron シーケンス (R *) の初期のバージョンが、イントロンは、ビリンビリン mKate2トランスジェニック マウス (VilmKate2) プロモーターの下流に挿入されました。LacIGYリプレッサーの有無とマウスの小腸でmKate2式の qRT PCR 解析が表示されます。各バーは、別のマウスからのデータを表します。LacIGY式と小腸の (B) 共焦点 mKate2 画像。(C) 六つの対称 lac オペレーター (S) は、様々 なプロモーターとルシフェラーゼ レポーター間に挿入されました。記者 (50 ng/96 ウェル プレートでも) とリプレッサー プラスミドを 1:1 のモル比で NIH/3T3 細胞に導入されました。ルシフェラーゼの値は、トランスフェクション後評価 24 h をしました。これらの in vitro のデータを表すLacIGYのルシフェラーゼ発現率-非機能的なラッチ(NFlacI) を表現するものを基準にして細胞を表現します。T テストは、統計的有意性を決定するために使用されました。データを表す平均 ± SEM (n = 3)。P ≦ 0.05 * *P ≤ 0.01。この図は、李ら10から変更されている<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59235/59235fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59235/59235fig4.jpg"> 図 4: ダウンおよびDnmt1発現の in vitro および in vivo。(A)培養 Esc で遺伝子をターゲットとエレクトロポレーションのアプローチによって設計され完全なリモート コントロール システム。Dnmt1式の最大の抑圧は、IPTG と Dox の両方の処理によって達成された最大活性化しながら無治療で達成されました。データを表す平均 ± SEM (n = 3)。P ≦ 0.05 * *P ≤ 0.01 (ウェルチのt-テスト)。(B)生体内での活性化Dnmt1リモコン マウスから様々 な組織における Dnmt1 蛋白の免疫染色で示されるようにリモート コントロール システムによって。LGT対立遺伝子は、プロモーター lacオペレーターとテト活性剤結合部位を含むDnmt1の変更を表します。マウスは 1 ヶ月間 (5000 mg/kg ドキシサイクリン Hyclate) は通常または Dox を含む食事療法と扱われました。この図は、李ら10から変更されている<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59235/59235fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Supplementary Figure 1" src="/files/ftp_upload/59235/59235supfig1.jpg"> 補足図 1: マウスDnmt1イントロン 1 にパッド挿入を着陸の例。(A) 着陸パッド挿入、クアドロスら (2015)31から適応のための DNA のテンプレートの模式図。JT15 と Lox2272、有性loxPサイト、短いスペーサー シーケンス (はsp) で区切られ、ターゲットのゲノム領域に相同な DNA の 60 bp が両側に並ぶ。次の sgRNA を使用してDnmt1イントロンにパッド挿入を着陸の DNA のサンプル (B) テンプレート: CTAGTACCACTCCTGTACCG (これは逆鎖を対象)。選択されているイントロン領域だった一歩 1.1 通知 bioinformatically と、sgRNA は、CRISPOR29を使用して識別されました。(C) 着陸パッドの挿入を評価するための PCR プライマー設計の例です。PCR のプライマーは、内因性Dnmt1の統合を確認するテンプレートの相同性腕外設計されていた。野生型 PCR 増幅は 213 bp;291 になれば、挿入時に跪く<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59235/59235supfig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

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In vivo Application of the REMOTE-control System for the Manipulation of Endogenous Gene Expression

体内の内因性遺伝子操作のリモート制御システムのアプリケーション

このプロトコルでは、生きた動物の細胞強化lacリプレッサーとテト活性化システムを使用して興味の内因性遺伝子のトランスクリプションを条件付きで制御できるモデル システムを生成するために必要な手順について説明します。

Here we describe a protocol for implementing the REMOTE-control system (Reversible Manipulation of Transcription at Endogenous loci), which allows for ...

私たちの方法の重要性は、その汎用性と効力です。これにより、研究者は既存の方法を使用して達成することが困難であった方法で内因性遺伝子発現を堅牢に制御することができます。これは、研究者が様々な発現レベルで、時空間的な方法で遺伝子の機能を調査することができます。したがって、疾患関連遺伝子を研究する際に有用である表現型の可逆性を試験することができます。抑制を達成するために、標的遺伝子イントロンは、12の対称Lacオペレータを含むレプロンRを含むように設計される。LacIGYリプレッサーが所望の組織特異的プロモーターから発現されると、標的遺伝子は抑制される。標的遺伝子の抑制は、LacIGYリプレッサーのアンタゴニストであるIPTGの投与により、所望の発現レベルに逆転または調整することができる。アップレギュレーションを達成するために、標的遺伝子プロモーターは、rtTA-M2活性化剤の結合部位として4つ以上のTatオペレータTを含むように設計される。活性化剤がドキシサイクリンの存在下で所望の組織特異的プロモーターから発現されると、標的遺伝子のアップレギュレーションが誘発される。標的遺伝子のアップレギュレーションは、ドキシサイクリンの濃度を引き出すかまたは変化させることによって、所望の発現レベルに逆転または調整することができる。抑制と活性化の両方を達成するために、Lacリプレッサーとタットアクチベーターシステムを組み合わせてもよい。抑制のために目的の遺伝子を改変するために、転写的に不活性なイントロンは、対象遺伝子の5つのプライムエンドに向かって、レプロン配列の挿入のために同定されるべきである。目的の遺伝子のゲノム配列を取得するには、UCSCゲノムブラウザに移動し、ゲノムタブの下でマウスゲノムの最新のドラフトを選択します。検索バーに対象遺伝子の名前またはシンボルを入力して、遺伝子のトランスクリプトを表示し、[移動] をクリックします。次に、目的の遺伝子に対して目的の転写変異体を選択し、対象の転写変異体の横にある遺伝子シンボルをクリックします。次に、シーケンスとツールとデータベースへのリンクのバナーの下で、ゲノムシーケンスリンクをクリックします。シーケンス検索領域のオプションでは、エキソン、イントロン、および遺伝子ごとにデフォルトのFASTAレコードを1つ選択します。シーケンス形式オプションの場合は、大文字でエキソンを選択し、それ以外はすべて小文字で、マスクは N. に繰り返し表示され、[送信] をクリックします。最後に、このシーケンスを保存し、説明を付けることができる文書またはプログラムの大文字と小文字の書式を保持します。CpG島の中断を避けるために、UCSCゲノムブラウザの発現と調節バナーの下にあるCpG諸島トラックのショーを選択し、リフレッシュをクリックします。5つの素数イントロンをズームインし、緑色で表示された各CpG島をクリックし、この機能のビューDNAを選択します。マスクを選択した後、Nに繰り返し、CpG島列を取得するDNAを取得をクリックします。最後に、これらのシーケンスを元のシーケンスファイルにオーバーレイし、これらを避けるべきイントロニック領域としてアポイントします。目的の組織にエンハンサー シグネチャを持つイントロニック領域を回避するには、ENCODE データベースに移動し、実験アイコンを選択します。アッセイタイプとして、ChiP-seqまたはDNase-seqを選択し、操作するセルに従って他のカテゴリを設定します。フィーチャの選択後、最も左側の絵文字を青色で選択し、結果をリストとして表示します。次に、h3k4モノメチル化、h3k27アセチル化、DNase1、およびCTCFの標的に対して、操作する細胞に最も近いデータセットを選択します。各関連データ セット内で、ファイル セクションまでスクロールし、mm10 と UCSC が選択されていることを確認して、[視覚化] ボタンをクリックします。UCSCゲノムブラウザで、5つのプライムイントロンを拡大し、コメント付きのピークトラックの各ピークをクリックします。各ピークの染色体座標をクリックして、各ピーク領域のDNA配列を取得します。ビュードロップダウンメニューで[DNA]を選択し、[マスクの繰り返し]をクリックし、最後に、これらのシーケンスを元のシーケンスファイルにオーバーレイし、これらを避けるイントロニック領域としてコメントします。高い特異性と予測効率スコアを持つ残りのイントロニック領域のsgRNAを同定するには、CRISPORなどのオンラインsgRNA設計ツールにナビゲートします。目的のイントロニック領域の配列を入力し、関連する参照ゲノムを指定し、目的のプロトスペーサー隣接モチーフを選択します。次に、[送信] をクリックします。次に、予測されたsgRNAを特異性スコアでソートし、高い予測効率スコアを有する1つ以上のsgRNAを選択する。最後に、sgRNA切断部位に対応する60塩基相同の腕で両側に横たわるPITT着陸パッド配列を含むDNAテンプレートを設計する。標的遺伝子抑制の逆転のために、投与日に所望量のIPTGを滅菌蒸留水に完全に溶解させることにより、目的の改変対立遺伝子を有するホモ接合性マウスの飲料水中にIPTGを投与する。ボトルをホイルで包み、IPTG水を軽く保護されたボトルに入れ、適切な遺伝子型のマウスに投与し、少なくとも1週間コントロールします。標的組織における目的の遺伝子の発現の解析に進む。遺伝子をアップレギュレーションに誘導するために、1週間の食事療法でドキシサイクリンを投与し、標的組織における目的の遺伝子の発現の解析に進む。qRT PCRアニリスは、プロモーターベースのアプローチを用いてDNMT1発現が非規制レベルの15%に抑圧されたことを示した。抑制は、様々な量のIPTGを有するマウスを治療することによって用量依存的に逆転した。観察されたDNMT1抑制とIPTG治療によるDNMT1抑制の逆転は、免疫染色によってタンパク質レベルで検証された。mKate2発現のqRT PCR解析は、イントロンベースのアプローチが転写伸長を減衰させることによって転写開始部位の数キロベース下にあるオペレータから90%以上の抑制を達成したことを示した。LacIGYリプレッサーの有無にかかわらずマウスの小さなインテンスチントにおけるmKate2発現の共焦点画像は、イントロンベースのアプローチを検証した。DNMT1発現の堅牢なアップレギュレーションおよびダウンレギュレーションは、TatおよびLacオペレータ配列を有する修飾内因性DNMT1アレスレを含む胚性幹細胞において達成された。両方の規制は完全に可逆的であり、IPTGおよびDox治療によって誘導可能であった。DNMT1の強力なアップレギュレーションは、肝臓、脾臓、および腎臓から観察された。しかし、心臓では検出可能なアップレギュレーションは見られず、DMNT1の細胞周期依存発現パターンと心臓の増殖細胞の希少性がこの観察の根源となり得る可能性が示唆された。その発現を操作することによって重要な遺伝子の生体内機能を研究することは、しばしば致死性のために困難であった。我々の方法は、我々の関心のある遺伝子の致死的表現型を克服することを可能にし、我々は生体内の腫瘍発生におけるその役割を研究することを可能にした。同様に、この技術は、研究が困難であった他の必須遺伝子の調査を可能にします。

Research

JoVE Journal

Genetics

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

in vitro転写アッセイおよび創薬への応用

In vitro transcription assays have been developed and widely used for many years to study the molecular mechanisms involved in transcription. This process ...

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

植物病原体の遺伝子操作<em&gt;ウスチラゴmaydis</em&gt;真菌生物と植物微生物相互作用を研究します

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the ...

Inducible T7 RNA Polymerase-mediated Multigene Expression System, pMGX

誘導性T7 RNAポリメラーゼ媒介マルチ遺伝子発現システム、pMGX

Co-expression of multiple proteins is increasingly essential for synthetic biology, studying protein-protein complexes, and characterizing and harnessing ...

Controllable Ion Channel Expression through Inducible Transient Transfection

誘導性一過性トランスフェクションを介して制御可能なイオンチャネルの発現

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be ...

Studying Cell Cycle-regulated Gene Expression by Two Complementary Cell Synchronization Protocols

2つの相補的細胞同期プロトコルによる細胞周期制御遺伝子発現の研究

The gene expression program of the cell cycle represents a critical step for understanding cell cycle-dependent processes and their role in diseases such ...

Production and Purification of Baculovirus for Gene Therapy Application

生産およびバキュロ ウイルスの遺伝子治療応用のための浄化

Baculovirus has traditionally been used for the production of recombinant protein and vaccine. However, more recently, baculovirus is emerging as a ...

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

カエノラブディティス ・ エレガンスにおける倍数性の操作

Mechanisms that involve whole genome polyploidy play important roles in development and evolution; also, an abnormal generation of tetraploid cells has ...

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

探索ルート マイクロバイ: 土、根、およびルート Endosphere から細菌群集のデータを抽出

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...

Manipulation of Gene Function in Mexican Cavefish

メキシコの血脈遺伝子機能の操作

Cave animals provide a compelling system for investigating the evolutionary mechanisms and genetic bases underlying changes in numerous complex traits, ...

Efficient Transcriptionally Controlled Plasmid Expression System for Investigation of the Stability of mRNA Transcripts in Primary Alveolar Epithelial Cells

原発性歯槽上皮細胞におけるmRNA転写物の安定性の研究のための効率的な転写制御プラスミド発現システム

Studying posttranscriptional regulation is fundamental to understanding the modulation of a given messenger RNA (mRNA) and its impact on cell homeostasis ...