Name: in vivo application of the remote-control system for the manipulation of endogenous gene expression
Uploaded: 2019-03-29T14:00:00
Duration: 8 min 54 s
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우리는 늦은 박사 하 이디 Scrable (메이 요 클리닉, 로체스터, 미네소타), 포유류 lacI 유전자 구성의 그녀의 관대 한 선물에 대 한 감사 Villin 발기인을 제공 하기 위한 박사 다니엘 Louvard (인 퀴리, 파리, 프랑스) 및 박사로 리 잭슨-Grusby (어린이 병원, 보스턴, MA)이 기술 개발의 초기 단계에 그녀의 기여 금을 위해. 우리는 그들의 지원을 생성 하는 유전자 변형 및 녹아웃 쥐에 대 한 박사 낸시 우와 박사 로버트 Maxson 감사입니다. 우리 유용한 토론 레어 실험실의 구성원 감사 하 고 지원 합니다. 이 작품은 건강의 국가 학회 [R01 CA75090, R01 DA030325, R01 CA157918, 및 P.W.L. R01 CA212374와 N.A.V.S에 1F31CA213897-01A1]에 의해 지원 되었다.

PWL 과학 자문 보드의 AnchorDx 및 Progenity, i n c.에서 제공

중요 한 단계 및 원격 제어 시스템의 잠재적인 제한 대상 유전자 발현에 영향을 주지 않고 진압 활성 바인딩 사이트의 삽입과 관련 된 도전 이다. 우리의 원래 억압 접근 Dnmt1 유전자에 적용 한 대로 삽입 발기인의 transcriptionally 중요 한 지역 내의 락 진압 바인딩 사이트의 참여. 발기인 기능에 영향을 미치는 이렇게 위험을 줄이기 위해 원격 제어 시스템의 일반적인 적용 개선, 우리는 억압 intron 기반 접근 방식을 개발. 우리의 향상 된 락 시스템의 힘 단단히 우리 연산자 위치에서 테스트 하는 모든 강한 발기인의 녹음을 억 누르다 수 수백 전사의 여러 kilobases 하류 시작 사이트 (그림 3A-C) 10. 중요 한 것은, 억압의 레벨 발기인 (그림 3A-C)10의 transcriptional 강점의 독립 했다. 이 우리의 억압 intron 기반 시스템의 억압 용량 초과 테스트 발기인의 transcriptional 강도 나왔다. 이 intron 기반 접근에 그것 억압은 두 가지 구성 요소, 녹음 방송 신장 기계와 락 repressors57사이 물리적 간섭을 통해 중재 높습니다. 이 간단한 억압 메커니즘 및 intron 기반 방법의 검증 된 견고성 렌더링 수 있습니다이 이렇게 다른 유전자, 조직, 및 유기 체에 일반적으로 적용 가능한.
원격 제어 시스템에 의해 upregulation 발기인 기능에 영향을 미치는의 위험을 수 반하는 대상 유전자 발기인에 근접에 있을 transactivator 바인딩 시퀀스를 필요 합니다. 그러나, 우리는 바인딩 시퀀스 위치 transcriptionally 중요 영역 바깥에 있을 수 있습니다 발견. Dnmt1 및 EF1α 발기인 튼튼하게 upregulated tet 연산자에서 몇 백 기초 상류 녹음 방송 시작 사이트10의 위치 했다. 이 편안한 제약은 크게는 transactivator의 부재에서 대상 유전자의 발기인 기능에 영향을 미치는의 위험을 줄여줍니다. 시퀀스의 바인딩 수를 증가 하거나 강한 transactivators의 사용 더 멀리 녹음 시작 사이트 사이트에서 upregulation 함으로써 위험을 줄일 수 합니다.
우리의 원격 제어 시스템은 우아한 제어 수준, 타이밍, 및 내 생 유전자 발현, 테스트는 표현 형의 반전 기능 및 다른 식 수준에 의해 쉽게 달성 되지 않은 결과 대 한 수의 위치 현재 생체 조건 유전자 식 제어 기술입니다. 우리를 포함 한 대부분 유전자 표정 분석 식 값 중 상당한 변이가 있습니다 셀의 모집단의 평균을 나타내는 중요 하다. 이 분화 또는 apoptosis58등 세포 의사 결정 프로세스에 영향을 미칠 수 있습니다. 진 식 제어의 정밀도 가능성이 향상 될 수 더 추가 유전자 회로 엔지니어링59, 비록 우리의 현재 시스템의 관찰된 힘 많은 생물학 문맥에서 유전자 기능의 유용한 조사를 허용할 것 이다. 또한, 대상 특이성의 고차 연산자 시퀀스 뿐만 아니라 포유류와 규제 구성 요소60의 원래 종 사이의 큰 진화 거리의 복잡성 때문에 예상 된다. 또한, repressors의 활성 유전자 변형 마우스 라인 개발 하 고 어떤 내 생 유전자에 대 한 고용 될 수 있습니다. 예를 들어 기존 tet transactivator 마우스 모델에서 원하는 마우스 조직 대상 유전자의 upregulation를 달성 하기 위해 적응 될 수 있다. 우리는 최근 여러 조직 유형 Hipp11 소재 시48에 lacIGY 유전자를 도입 하 여 기존 Cre 라인와 결합 될 때에 우리의 향상 된 락 진압의 강력한 조직 관련 표현 구동할 수 유전자 변형 라인 개발 Lox-정지-Lox 요소 (미 출판)의 통제. 이 라인 것 실질적으로 원격 제어 시스템의 조직-특정 응용 프로그램을 촉진 한다.
원격 제어 시스템에 의해 유전자 upregulation 현재 유도할 수 있는 유전자 변형 방법에 비해 몇 가지 이점이 있습니다. 그것은 그것은 활용 내 생 로커 스 선의 여러 유전자 변형, 삽입의 위치 효과 대 한 테스트 생성이 필요 하지 않습니다. 또한,이 방식은 강한 초기 식으로 유전자의 upregulation 적합 이미 강력한 발기인에서 향상 하기 때문에 기존의 유전자 변형 모델 최소한의 바이러스 성 발기인에 의존 하는 반면. 마지막으로, 조직 특이성, 세포 주기 제어 및 대상 유전자의 이체를 접합 수 있습니다 유지 upregulation에 우리의 접근 방식에 의해 타고 난 cis등 자연의 요소를 유지로-규제 요소. CRISPR/Ca-중재 하는 유전자를 대상으로 기술의 출현 크게 다양 한 모델 시스템에서이 기술의 응용 프로그램을 촉진 한다.

유전자 녹아웃 또는 유전자 변형 접근 동물 모델에서 유전자 기능을 연구 하는 효과적인 수단 되었습니다. 그러나, 이러한 방법에의 한 식 규제 dichotomous (온/오프), 비 시간적, 이며 따라서 유전자의 완전 한 기능 스펙트럼을 드러내는 능력입니다. Spatio 시간적 비활성화 또는 활성화 유전자 함수, 조건부 Cre/LoxP 기술 허용 하지만 그들의 둘로 나눠진 본성 포즈 셀 치 및 경험 irreversibility1,2 등 한계를 계속 , 3.이 공 허를 채우기 위해 조건부 최저의 방법을 개발 되었으며 tet를 사용 하 여-shRNA 또는 미르4규제. 그러나, 오프 대상 효과 RNAi5 에 대 한 관심사를 유지 하 고 도전 vivo에서. 을 제어 하 더 최근에, CRISPR/Ca 중재 transcriptional 통제는 업 및 내 인 성 유전자 발현의 downregulation를 달성 하는 더 다양 한 접근법을 도입 기술과 그들의 유틸리티6,7 시연 . 그러나, transcriptional 제어 CRISPR/Ca 중재의 효과 아직 vivo에서 명확 하지 않다 고 리아 기반 억압의 가역 리아에 의해 본, 강한 억압 하 남아 있고 그것의 상호 작용 단백질 KAP1 유도 표시 되었습니다. 영구적인 유전자 침묵8,9.
이러한 한계를 해결 하기 위해 우리 소설 transcriptional 규제 시스템은 조건부로 제어는 가역에 내 인 성 유전자 발현의 수를 개발 하 고 마우스를 사용 하 여 조정할 수 있는 방식으로 간결한 이진 transcriptional 설계 규제 시스템10. 락 등 tet, 규제 ligands와 간결한 이진 transcriptional 규제 시스템 같은 가역 활성화 및 가변 식 제어11,12,13, 그러나 14., 현재 이진 시스템의 부적당 한 진압 힘 포유류에 내 인 성 유전자 발현을 제어 하기 위한 그들의 광범위 한 채택에 장애가 있다. 우리는 충분히 내 생 유전자의 진압에 대 한 강력한 향상 된 락 억압 시스템 개발 하 고 달성 하기 위해 내 생 유전자의 동족 발기인에 직접 tet transcriptional 활성 제를 대상으로의 새로운 전략을 채택 강력한 upregulation (그림 1)10. 이 기술로, 우리 가락, 유도할 수 있는, 그리고 가역 방식으로10내 생 Dnmt1 유전자의 거의 두 배나 식 제어를 달성 했다. 여기 우리는 다른 유전자와 마우스를 사용 하 여 모델 종으로 생물을 vivo에서 응용 프로그램에 대 한 단계별 지침을 제공 합니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59235/59235fig1.jpg"> 그림 1 : 원격 제어 시스템의 개요. 내 생 대상 유전자의 전사는 설계 lac 진압 tet 활성 시스템을 사용 하 여 조정할 수 있습니다. 대상 유전자 발기인 또는 intron 꽉 바인딩 LacIGY 진압 및 rt에 대 한 연산자를 포함 하는 설계 조교 M2 활성 제. R Repron (담당자ression 하루에에), 부분 토끼 beta globin intron 플러스 12 대칭 락 연산자 (S)를 포함 된 나타냅니다. T는 tet 연산자를 나타냅니다. 진압 또는 활성 제/조직 관련 발기인에서 표현 됩니다. 대상 유전자의 표현 수 있습니다 다음 역 조정 된 원하는 식 수준으로 IPTG (이소프로필 β-D-1-thiogalactopyranoside, LacIGY 진압의 길 항 제) 또는 Doxycycline (Dox)의 관리에 의해. 이 그림 리 외.10에서 수정 된<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59235/59235fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
이 프로토콜을 시작 하기 전에 표 1 유전자 발현의 원하는 컨트롤 관련 단계를 식별 하는 검토. 예를 들어 "X 유전자"의 가역 downregulation를 가능 하 게 마우스를, 섹션 1, 3, 및 4의 완료는 프로토콜 아래. 표 1 은 또한 원격 제어 시스템의 필요한 구성 요소를 요약합니다.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>원하는 식 변화</td>
			<td>억압만</td>
			<td>활성화만</td>
			<td>억제 및 활성화</td>
		</tr>
<tr>
<td>프로토콜의 관련 섹션</td>
			<td>1, 3-4</td>
			<td>2-4</td>
			<td>1-4</td>
		</tr>
<tr>
<td>대상 유전자에 필요한 원격 제어 시퀀스</td>
			<td>Repron ("억압 intron"; 12 대칭 락 연산자와 부분 토끼 beta globin intron)</td>
			<td>Tet operator(s)</td>
			<td>Repron와 Tet operator(s)</td>
		</tr>
<tr>
<td>원격 제어 시퀀스 위치</td>
			<td>Intron</td>
			<td>발기인</td>
			<td>Intron 및 발기인</td>
		</tr>
<tr>
<td>활성 제/진압 원하는 제어에 필요한</td>
			<td>LacIGY 진압</td>
			<td>rtTA M2 활성 제</td>
			<td>LacIGY 진압 및 rtTA M2 활성 제</td>
		</tr>
<tr>
<td>규제 Ligands</td>
			<td>IPTG</td>
			<td>Doxycycline</td>
			<td>IPTG 또는 Doxycycline</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 원격 제어 구성 요소 개요.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:715px;" width="715">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">B6C3F1/J</td>
			<td style="width:149px;">The Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:183px;">100010</td>
			<td style="width:167px;">https://www.jax.org/strain/100010</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cas9 Protein</td>
			<td style="width:149px;">PNA Bio</td>
			<td style="width:183px;">CP04</td>
			<td>http://www.pnabio.com/products/CRISPR_Cas9.htm?gclid=EAIaIQobChMIsoG8pLL33QIVBr7ACh0naQ4dEAAYAiAAEgKyHvD_BwE</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CRISPOR</td>
			<td>Haeussler et al. 2016</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td>http://crispor.tefor.net/</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Doxycycline-Containing Mouse Diet</td>
			<td style="width:149px;">Envigo</td>
			<td style="width:183px;">Varies by concentration</td>
			<td>https://www.envigo.com/products-services/teklad/laboratory-animal-diets/custom-research/doxycycline-diets/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ENCODE Database</td>
			<td style="width:149px;">Stanford University</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td>https://www.encodeproject.org/</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">iCre mRNA synthesis plasmid (pBBI)</td>
			<td style="width:149px;">Addgene</td>
			<td>65795</td>
			<td>https://www.addgene.org/65795/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">IPTG</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td style="width:183px;">I2481C</td>
			<td>https://www.goldbio.com/search?isSearch=Y&#38;q=iptg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">pGL3-Basic</td>
			<td style="width:149px;">Promega</td>
			<td style="width:183px;">E1751</td>
			<td>https://www.promega.com/products/reporter-assays-and-transfection/reporter-vectors-and-cell-lines/pgl3-luciferase-reporter-vectors/?catNum=E1751</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">SVM-BPfinder</td>
			<td style="width:149px;">Regulatory Genomics, Pompeu Fabra University</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td>http://regulatorygenomics.upf.edu/Software/SVM_BP/</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">TiProD: Tissue specific promoter Database</td>
			<td style="width:149px;">Department of Bioinformatics, UMG,&#160;University of G&#246;ttingen&#160;</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td>http://tiprod.bioinf.med.uni-goettingen.de</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">UCSC Genome Browser</td>
			<td style="width:149px;">University of California Santa Cruz</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td>https://genome.ucsc.edu/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo application of the remote-control system for the manipulation of endogenous gene expression

우리가 되돌릴 수 및 가변 식 제어할 수 있는 원격 제어 시스템 (다시versible Manipulation of Transcription Endogenous loci에서), 구현에 대 한 프로토콜을 설명 하는 여기는 생활의 내 생 유전자 시스템 모델. 원격 제어 시스템 다운-또는 단일 생물 학적 시스템 내에서 대상 유전자의 upregulation를 달성 하기 위해 향상 된 락 억제와 tet 활성화 시스템을 사용 합니다. 꽉 억압 유연 하 게 위치한 사이트 바인딩 진압에서 달성 될 수 있다 녹음 방송 신장 억제 함으로써 녹음 방송 시작 위치의 하류까지. 강력한 upregulation 동족 발기인에 tet transcriptional 활성 제를 대상으로 내 생 유전자의 전사를 강화 하 여 달성 될 수 있다. 이 가역 및 가변 식 컨트롤 적용 하 고 유기 체에서 반복적으로 철수 수 있습니다. 힘과 같이 내 인 성 Dnmt1 , 여기에 대 한 시스템의 다양성을 허용할 것 이다 더 정확한 생체 조건 기능적인 분석 다양 한 식 수준에서 유전자 기능의 조사 함으로써 고의 반전 기능을 테스트 하 여는 표현 형입니다.

원격 제어 시스템의 억제 기능까지 두 가지 다른 방법에서 입증 되었습니다. 첫 번째 접근 방법에서 락 진압 바인딩 사이트 Dnmt1 유전자의 내 생 발기인에 삽입 되었다. 이 프로토콜에 의해 추천 되는 두 번째 방법에서는 진압 바인딩 사이트 다운스트림 intron 삽입 하 여 발기인 기능에 영향을 미치는 잠재적인 위험을 피하기 위해 그리고 그로 인하여 원격 제어의 응용 프로그램을 단순화 하기 위해 삽입 된 시스템입니다. 두 방법 모두 결과 성공적인 억압 (그림 2A, B 및 그림 3A-C)10. Dnmt1 표현 했다 발기인 기반 방식 (그림 2A)를 사용 하 여 관계가 없는 레벨의 15%를 억 누른 다. 이 꽉 억압 복용량 의존 방식으로 생쥐 IPTG (그림 2A) 다양 한 양의 치료 하 여 반전 했다. 관찰 된 Dnmt1 억압 immunostaining (그림 2B) 의해 단백질 수준에서 유효 했다. 우리는 Dnmt1사이 Dnmt1 식의 어떤 눈에 띄는 차이 관찰 하지 않았다+ + 및 Dnmt1LO/LO 쥐, lac 연산자 삽입 우리의 정상적인 발기인을 방해 하지 했다 확인 기능10. 연산자에서 90% 억제 보다는 intron 기반 접근 달성 전사 신장 (그림 3A, B)10을 약하게 하 여 녹음 방송 시작 위치의 여러 kilobases를 하류에 위치 해 있습니다. Intron 기반 이렇게 했다 7 추가 강력한 발기인 (그림 3C)에 추가 검증 됩니다. 변함없이 꽉 억압 모든 테스트 발기인에서 달성 되었다. 잔여 식 수준 및 발기인의 강점 사이의 상관 관계가 관찰 되었다 (테스트 우리의 억압 intron 기반 시스템의 억압 용량 모든 강력한 발기인의 transcriptional 힘 초과 제안 그림 3 C)입니다.
원격 제어 시스템의 기능을 vivo에서 upregulation Dnmt1 유전자에도 시연 했다. 우리 Dnmt1 발기인, 락 연산자 시퀀스, 함께 upregulation 또는 단백질은 어떤 이펙터에 따라 downregulation 있도록에 tet 연산자의 두 복사본을 소개 했다. 강력한 upregulation 및 2 개의 크기 순서 (10 ~ 650%), 가까운 Dnmt1 식의 downregulation ESCs 포함 하는 수정 된 생 Dnmt1 대립 유전자 (Dnmt1LGT)(그림 4)에 달성 했다10 . 두 규정 되었고 완전히 가역 IPTG Dox 치료로 유도할 수 있는 각각(그림 4). 우리는 다음 원격 제어 시스템의 생체 조건 upregulation 기능을 테스트 하려면 마우스 생식에 Dnmt1LGT 수정 도입. 반면 마음에 없는 감지 upregulation (그림 4B)7관찰 되었다 Dnmt1 의 강한 upregulation 간, 비장, 신장에서 관찰 되었다. Dnmt1 의 세포 주기 의존적인 식 패턴 및 심장에 증식 세포의 부족이 관찰10,56기반이 될 수 있습니다 됩니다. 그것은 바인딩 사이트의 수 또는 활성 제 식 수준을 증가 하 여이 한계를 극복할 수 있는 여부를 볼 수 있다.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59235/59235fig2.jpg"> 그림 2 : Vivo에서 LacIGY 진압에 의해 Dnmt1 의 억압. Dnmt1 발기인, 또는 LacIGY의 표현 없이 삽입 락 사업자 (LO)와 (A) 마우스 IPTG의 다양 한 복용량으로 대우 했다. qRT-PCR 분석 Dnmt1 식의 IPTG 치료에 의해 vivo에서 Dnmt1 억압의 복용량 의존 반전을 보여 줍니다. 각 막대는 다른 마우스에서 데이터를 나타냅니다. 데이터 대표 평균 ± SEM (n = 3). 쥐의 저 승 지하실에 Dnmt1 단백질의 (B) Immunostaining 3 주 동안 또는 160mm IPTG 없이 식 수를 제공합니다. 이 그림 리 외.10에서 수정 된<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59235/59235fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59235/59235fig3.jpg"> 그림 3 : Vivo에서 및 원격 제어 시스템에 의해 다양 한 발기인의 생체 외에서 억압. (A) Repron 시퀀스 (R *)의 초기 버전 Villin mKate2 유전자 변형 마우스 (VilmKate2)에 Villin 발기인의 하류는 intron에 삽입 했다. qRT-PCR 분석 또는 LacIGY 진압 없이 쥐의 소장에 mKate2 식의 표시 됩니다. 각 막대는 다른 마우스에서 데이터를 나타냅니다. (B) 공초점 mKate2 이미지 LacIGY 식 없이 소장. (C) 6 대칭 락 연산자 (S) 다양 한 발기인 및 luciferase 기자 사이 삽입 했다. 기자 (50 ng/96 잘 접시에 잘)와 진압 플라스 미드 정도 1:1 어 금 니 비율에서 NIH/3T3 세포로 소개 되었다. Luciferase 값 transfection 후 평가 24 h를 했다. 이러한 생체 외에서 데이터 LacIGY에 luciferase 식의 %를 나타내는-비 기능 LacI (NFlacI) 표현 들을 기준으로 셀을 표현. T-테스트 는 통계적 의미를 확인 하기 위해 사용 되었다. 데이터 대표 평균 ± SEM (n = 3). P ≤ 0.05, * *P ≤ 0.01. 이 그림 리 외.10에서 수정 된<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59235/59235fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59235/59235fig4.jpg"> 그림 4 : 다운-또는 생체 외에서 그리고 vivo에서 Dnmt1 식의 upregulation. (A) 완벽 한 원격 제어 시스템 electroporation 유전자를 대상으로 접근 하 여 교양된 ESCs에 설계 되었습니다. 최대한 활성화 IPTG와 Dox 처리에 의해 달성 하는 동안 최대한 억압 Dnmt1 식의 치료와 함께 달성 했다. 데이터 대표 평균 ± SEM (n = 3). P ≤ 0.05, * *P ≤ 0.01 (웰 치의 t-테스트). (B) 원격 제어 시스템, 원격 제어 마우스에서 다양 한 조직에서 Dnmt1 단백질의 immunostaining에 의해 증명으로 Dnmt1 의 vivo에서 활성화 LGT 대립 유전자 발기인 수정을 락 연산자와 tet 활성 바인딩 사이트를 포함 하도록 Dnmt1 를 나타냅니다. 마우스는 한 달 동안 정상 또는 포함 하는 Dox 다이어트 (5000 mg/kg Doxycycline Hyclate)로 치료 했다. 이 그림 리 외.10에서 수정 된<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59235/59235fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Supplementary Figure 1" src="/files/ftp_upload/59235/59235supfig1.jpg"> 보충 그림 1 : Murine Dnmt1 intron 1에 패드 삽입 방문의 예. 패드 삽입, Quadros 외. (2015)31에서 적응을 착륙을 위한 DNA 템플렛의 (A) 회로도 Heterotypic loxP 사이트, JT15 및 Lox2272, 짧은 공백 시퀀스 (sp)으로 구분 되며 60-bp 대상 게놈 지역에 동종은 DNA의 각 측면에 어귀. 대 한 다음 sgRNA를 사용 하 여 Dnmt1 intron에 패드 삽입 (B) DNA 샘플 템플릿: CTAGTACCACTCCTGTACCG (이 역 가닥을 대상). 선택한 intronic 지역 bioinformatically 단계 1.1, 정보 그리고는 sgRNA CRISPOR29를 사용 하 여 확인 되었다. (C) 상륙 패드의 삽입을 평가 하기 위한 PCR 뇌관 디자인의 예입니다. PCR 뇌관 생 Dnmt1통합 확인 하 상 동 팔 서식 파일의 외부 설계 되었습니다. Wildtype PCR amplicon는 213 혈압; 삽입 시 291 된다 bp. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59235/59235supfig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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In vivo Application of the REMOTE-control System for the Manipulation of Endogenous Gene Expression

Vivo 내 인 성 유전자 발현의 조작에 대 한 원격 제어 시스템의 응용 프로그램에서

이 프로토콜은 살아있는 동물 또는 향상 된 락 진압 및 tet 활성 시스템을 사용 하 여 셀에 있는 관심사의 내 생 유전자의 녹음 방송을 통제 될 수 있다 조건에 따라 모델 시스템을 생성 하는 데 필요한 단계를 설명 합니다.

Here we describe a protocol for implementing the REMOTE-control system (Reversible Manipulation of Transcription at Endogenous loci), which allows for ...

우리의 방법의 중요성은 다재다능함과 힘입니다. 그것은 연구원이 기존 방법을 사용하여 달성하기 어려운 방법으로 내인성 유전자 발현에 대한 강력한 제어를 할 수 있습니다. 그것은 연구원이 각종 발현 수준 및 spatio-측두성 방식으로 유전자의 기능을 조사하는 것을 허용합니다.따라서 질병 관련 유전자를 연구할 때 유용한 표현형의 가역성을 테스트할 수 있습니다. 억압을 달성하기 위해, 표적 유전자 intron는 12 대칭 Lac 연산자를 포함하는 repron R을 포함하도록 설계되었습니다. LacIGY 억압자가 원하는 조직 특정 프로모터로부터 발현되면 표적 유전자가 억압된다.표적 유전자의 억압은 LacIGY 억압자의 길항제인 IPTG의 투여에 의해 원하는 발현 수준으로 반전되거나 조절될 수 있다. 상향 조절을 달성하기 위해, 표적 유전자 프로모터는 rtTA-M2 활성제에 대한 결합 부위로서 4개 이상의 Tat 연산자 T를 포함하도록 설계되었습니다. 활성제는 독시사이클린의 존재에서 원하는 조직-특정 프로모터로부터 발현될 때, 표적 유전자의 상향 조절이 유도된다.대상 유전자의 상향 조절은 독시사이클린의 농도를 철회하거나 변경함으로써 원하는 발현 수준으로 반전되거나 조절될 수 있다. 억압과 활성화를 모두 달성하기 위해 락 억제기 및 Tat 활성제 시스템을 결합할 수 있습니다. 억압에 대한 관심 유전자를 수정하려면, 관심 있는 유전자의 5개의 주요 끝을 향한 전사적으로 불활성 인트론이 레프레론 서열의 삽입을 위해 확인되어야 한다.관심 있는 유전자에 대한 게놈 서열을 얻으려면 UCSC 게놈 브라우저로 이동하여 게놈 탭 하에서 마우스 게놈의 최신 초안을 선택한다. 관심 있는 유전자의 이름이나 기호를 검색 모음에 입력하여 유전자에 대한 성적증명서를 본 다음 이동을 클릭합니다. 그런 다음, 관심 있는 유전자에 대한 원하는 성적증명서 이체를 선택하고 관심 있는 성적증명서 변이체 옆의 유전자 심볼을 클릭한다.다음으로 도구 및 데이터베이스 배너에 대한 시퀀스 및 링크에서 게놈 시퀀스 링크를 클릭합니다. 서열 검색 영역 옵션의 경우 유전자당 엑손, 인트론 및 기본 하나의 FASTA 레코드만 선택합니다. 서열 서식 옵션을 보려면 대문자로 엑슨을 선택하고 소문자의 다른 모든 것을 선택하고 마스크가 N.Then로 반복되면 제출을 클릭합니다.마지막으로 이 시퀀스를 저장하여 이 시퀀스를 저장하여 인음칠할 수 있는 문서 또는 프로그램에서 상문자 및 소문자 서식을 유지합니다. CpG 제도의 중단을 방지하려면 UCSC 게놈 브라우저의 발현 및 조절 배너 아래에 CpG 제도 트랙에 대한 표시를 선택하고 새로 고침을 클릭합니다. 다섯 개의 주요 인트론을 확대하고 녹색으로 표시된 각 CpG 섬을 클릭하고 이 기능에 대한 DNA 보기를 선택합니다.N으로 반복되는 마스크 반복을 선택한 후 DNA를 클릭하여 CpG 제도 서열을 얻습니다. 마지막으로 이러한 시퀀스를 원래 시퀀스 파일과 오버레이하고 이러한 시퀀스 에 대한 정보를 피해야 하는 내향 영역으로 음신합니다. 관심 있는 조직에 증강 서명이 있는 내향 영역을 피하려면 ENCODE 데이터 베이스로 이동하여 실험 아이콘을 선택합니다.분석 유형의 경우, ChiP-seq 또는 DNase-seq를 선택하고 엔지니어링할 셀에 따라 다른 범주를 채웁니다. 피처 선택 후 왼쪽 대부분의 그림그림을 파란색으로 선택하여 결과를 목록으로 봅니다. 그런 다음, 가장 밀접하게 엔지니어링 할 세포와 일치하는 h3k4 단조량, h3k27 아세틸화, DNase 1 및 CTCF의 대상에 대한 데이터 세트를 선택합니다.각 관련 데이터 집합 내에서 파일 섹션으로 스크롤하고 mm10 및 UCSC가 선택되었는지 확인하고 시각화 단추를 클릭합니다. 이제 UCSC 게놈 브라우저에서 5개의 주요 인트론을 확대하고 인트윗된 피크 트랙의 각 피크를 클릭합니다. 각 피크에 대한 염색체 좌표를 클릭하여 각 피크 영역에 대한 DNA 서열을 가져옵니다.뷰 드롭다운 메뉴에서 DNA를 선택하고 마스크 반복을 N.Finally로 선택하고 이러한 시퀀스를 원래 시퀀스 파일로 오버레이하고 이를 내성 영역으로 부음하여 피하십시오. 높은 특이성과 예상 효율 점수를 가진 나머지 내성 지역에서 sgRNA를 식별하려면 CRISPOR와 같은 선택의 온라인 sgRNA 설계 도구로 이동합니다. 관심 있는 내성 영역의 서열을 입력하고, 관련 기준 게놈을 지정하고, 원하는 프로토스페이스어 인접 모티프를 선택한다.그런 다음 제출을 클릭합니다. 다음으로, 예측된 sgRNA의 특이성 점수를 정렬하고 또한 높은 예측 효율 점수를 갖는 하나 이상의 sgRNA를 선택합니다. 마지막으로, SgRNA 절단 부위에 해당하는 60기 상동성 팔에 의해 양쪽에 측면에 있는 PITT 랜딩 패드 서열을 포함하는 DNA 템플릿을 설계한다.표적 유전자 억압의 반전을 위해, 투여 당일 멸균 증류수에서 원하는 양의 IPTG를 완전히 용해시킴으로써 이해의 수정된 송계로 호마시구스 사육 마우스의 식수에서 IPTG를 투여한다. 병을 호일로 감싸고 IPTG 물을 가벼운 보호 병으로 투여하여 적절한 유전자형의 마우스에 투여하고 적어도 일주일 동안 제어한다. 표적 조직에 대한 관심 유전자의 발현을 분석하여 진행한다.유전자 상향 조절을 유도하기 위해, 1주일 동안 식단에서 독시사이클린을 투여하고 표적 조직에 대한 관심 유전자의 발현을 분석하는 진행한다. qRT PCR anaylisis는 DNMT1 발현이 프로모터 기반 접근법을 사용하여 규제되지 않은 수준의 15%로 억압된 것으로 나타났습니다. 억압은 다양한 양의 IPTG를 가진 마우스를 취급해서 복용량 의존적인 방식으로 반전되었습니다.IPTG 치료에 의한 DNMT1 억압 및 DNMT1 억압의 반전은 면역스테인링에 의한 단백질 수준에서 검증되었다. mKate2 발현의 qRT PCR 분석은 인트론 기반 접근법이 전사 연신을 감쇠하여 전사 시작 부위의 여러 킬로베이스 하류에 위치한 사업자로부터 90% 이상의 억압을 달성한 것으로 나타났다. LacIGY 억압자 유무에 관계없이 마우스의 작은 텐스틴에서 mKate2 발현의 공초점 이미지는 인트론 기반 접근법을 검증하였다.DNMT1 발현의 강력한 강화 조절 및 다운규제는 Tat 및 Lac 연산체서와 함께 변형된 내인성 DNMT1 을 포함하는 배아 줄기 세포에서 달성되었다. 두 규정 모두 IPTG및 Dox 치료에 의해 완전히 뒤집을 수 있고 유도할 수 있었습니다. DNMT1의 강력한 강화 조절은 간, 비장 및 신장에서 관찰되었다.그러나, 심장에서 검출 가능한 업규제가 관찰되지 않았으며, DMNT1의 세포 주기 의존식 패턴과 심장내 증식 세포의 희소성이 이러한 관찰의 근간을 겪을 수 있음을 시사한다. 그것의 표현을 조작하여 중요한 유전자의 생체 내 기능을 공부하는 것은 수시로 치사 때문에 도전이었습니다. 우리의 방법은 우리가 관심의 유전자에 대한 치명적인 표현형을 극복 할 수 있게하고 우리가 생체 내 종양 발생에 미치는 역할을 연구 할 수있었습니다.마찬가지로, 이 기술은 공부하기 어려웠던 그밖 필수 유전자의 조사를 가능하게 할 것입니다.

Research

JoVE Journal

Genetics

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

시험 관내 전사 분석 실험 및 약물 발견에의 응용

In vitro transcription assays have been developed and widely used for many years to study the molecular mechanisms involved in transcription. This process ...

연구

유전학

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

플랜트 병원체의 유전자 조작<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; 곰팡이 생물과 식물 미생물 상호 작용을 연구하는

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the ...

Inducible T7 RNA Polymerase-mediated Multigene Expression System, pMGX

유도 성 T7 RNA 중합 효소 매개 멀티젠 발현 시스템, pMGX

Co-expression of multiple proteins is increasingly essential for synthetic biology, studying protein-protein complexes, and characterizing and harnessing ...

Controllable Ion Channel Expression through Inducible Transient Transfection

유도 성 과도 형질을 통해 제어 이온 채널 식

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be ...

Studying Cell Cycle-regulated Gene Expression by Two Complementary Cell Synchronization Protocols

두 개의 상보적인 세포 동기화 프로토콜에 의한 세포주기 조절 유전자 발굴 연구

The gene expression program of the cell cycle represents a critical step for understanding cell cycle-dependent processes and their role in diseases such ...

Production and Purification of Baculovirus for Gene Therapy Application

생산 및 유전자 치료 응용 프로그램에 대 한 잠재의 정화

Baculovirus has traditionally been used for the production of recombinant protein and vaccine. However, more recently, baculovirus is emerging as a ...

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

꼬마 선 충 에 Ploidy의 조작

Mechanisms that involve whole genome polyploidy play important roles in development and evolution; also, an abnormal generation of tetraploid cells has ...

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

루트 미생물 탐색: 토양, Rhizosphere, 및 루트 Endosphere에서 세균성 지역 사회 데이터 추출

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...

Manipulation of Gene Function in Mexican Cavefish

멕시코 Cavefish에서 유전자 기능 조작

Cave animals provide a compelling system for investigating the evolutionary mechanisms and genetic bases underlying changes in numerous complex traits, ...

Efficient Transcriptionally Controlled Plasmid Expression System for Investigation of the Stability of mRNA Transcripts in Primary Alveolar Epithelial Cells

1 차적인 폐포 상피 세포에 있는 mRNA 전사체의 안정성의 조사를 위한 능률적으로 통제된 플라스미드 발현 시스템

Studying posttranscriptional regulation is fundamental to understanding the modulation of a given messenger RNA (mRNA) and its impact on cell homeostasis ...