Name: in vivo application of the remote-control system for the manipulation of endogenous gene expression
Uploaded: 2019-03-29T14:00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In vivo Application of the REMOTE-control System for the Manipulation of Endogenous Gene Expression at JoVE.com

Vi takker den avdøde Dr Heidi Scrable for hennes sjenerøse gaven av pattedyr lacI gene Konstruer (Mayo Clinic, Rochester, MN) Dr. Daniel Louvard (Institut Curie, Paris, Frankrike) for å gi Villin selskapet og Dr. Laurie Jackson-Grusby (barnesykehus, Boston, MA) for hennes bidrag til de tidlige stadiene av denne teknologiutvikling. Vi er takknemlige for Dr. Nancy Wu og Dr Robert Maxson for deres hjelp i å generere transgene og knockout musene. Vi takker medlemmene av Laird laboratorium for nyttig diskusjoner og støtte. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health [R01 CA75090, R01 DA030325, R01 CA157918 og R01 CA212374 til P.W.L. og 1F31CA213897-01A1 å N.A.V.S].

PWL serverer på vitenskapelige Advisory Boards av AnchorDx og Progenity, Inc.

En kritisk trinn og potensielle ANSVARSBEGRENSNING fjernkontroll systemet er utfordringen forbundet med innsetting av repressor eller aktivator bindende områder uten å påvirke mål genuttrykk. Vår opprinnelige undertrykkelse tilnærming, involvert som brukes til Dnmt1 genet, innsetting av lac repressor bindende områder innen transcriptionally kritiske områder av en promoter. For å redusere risikoen for påvirker promoter funksjon og dermed å forbedre den generelle anvendelighet av fjernkontroll systemet, vi utviklet intron-baserte undertrykkelse tilnærming. Styrken på forbedret lac systemet tillot oss å undertrykke tett transkripsjon av alle de sterke arrangørene vi testet mot ligger hundrevis til flere kilobases nedstrøms av transkripsjon starte områder (Figur 3-Vekselstrøm) 10. viktigst, nivåer av undertrykkelse er uavhengige av transcriptional styrkene til arrangører (Figur 3-Vekselstrøm)10. Dette tyder på at undertrykkelse kapasitet intron-baserte undertrykkelse systemet overskrider transcriptional styrke de testede arrangørene. I denne intron tilnærming er det sannsynlig at undertrykkelse er formidlet gjennom fysisk interferens mellom to komponenter, transkripsjon forlengelse maskiner og lac repressors57. Denne enkle undertrykkelsen mekanisme og vist robust metoden intron-baserte kan gjøre denne generelt gjelder for ulike gener, vev og organismer.
Oppregulering av fjernkontroll systemet krever transactivator binding sekvenser i nærhet til målet genet selskapet, som innebærer en risiko for påvirker promoter funksjon. Vi fant imidlertid at plasseringen av bindende sekvenser kan være utenfor regionen transcriptionally kritisk. Både Dnmt1 og EF1α arrangører var robust upregulated fra tet operatører ligger et par hundre baser oppstrøms av transkripsjon start nettsteder10. Denne avslappende betingelsen reduserer sjansen for påvirker promoter funksjon med et mål i fravær av transactivator. Øke antall bindende sekvenser og/eller bruk av sterkere transactivators kunne hjelpe ytterligere redusere risikoen ved å aktivere oppregulering fra områder lenger bort fra startwebstedet transkripsjon.
Fjernkontroll systemet gir elegante kontroll av nivå, timing og plasseringen av endogene genuttrykk, slik at Reversibilitet av en fenotypen og konsekvensene av ulike uttrykk nivåer, som ikke er lett oppnåelig ved gjeldende i vivo gene expression-kontroll teknologi. Det er viktig å merke seg at i de fleste gene expression analyser, inkludert vår, uttrykk verdiene representerer gjennomsnittet for en populasjon av celler som store variasjoner kan bli funnet. Denne heterogene kan påvirke mobilnettet beslutningsprosesser, som differensiering eller apoptose58. Men presisjonen for gene expression kontroll kan trolig ytterligere forbedret av flere genetiske krets engineering59, kan observerte styrken på vårt nåværende system nyttig undersøkelse av gen funksjon i mange biologiske sammenhenger. I tillegg forventes en høy grad av målet spesifisitet fordi operatøren sekvensene samt stor evolusjonære avstanden mellom pattedyr og opprinnelige arter i de regulatoriske komponenter60. Videre kan transgene musen linjer med repressors og aktivator utvikles og ansatt for noen endogene genet. For eksempel kan eksisterende tet transactivator musen modeller tilpasses for å oppnå oppregulering med et mål i ønsket musen vev. Vi har nylig utviklet en transgene linje som kan kjøre robuste vev-spesifikke uttrykk for vår forbedrede lac repressor i flere vev typer kombinert med eksisterende grobunn linjer ved å innføre lacIGY genet til Hipp11 locus48 under kontroll av et Lox-stopp-Lox element (upublisert). Denne linjen vil vesentlig lette vev-spesifikke anvendelsen av fjernkontrollen systemet.
Gene oppregulering av fjernkontroll systemet gir flere fordeler i forhold til gjeldende induserbart transgene tilnærminger. Det krever ikke generasjon av flere transgene linjer til å teste posisjon virkningene av innsetting, som det utnytter endogene locus. I tillegg denne tilnærmingen er velegnet for oppregulering av gener med sterk planlagte uttrykket fordi det forbedrer uttrykk fra en allerede robust promoter, mens konvensjonelle transgene modeller stole på minimal viral arrangører. Til slutt, vevet spesifisitet, celle-syklus kontroll og skjøting varianter med et mål kan beholdes på oppregulering av vår tilnærming, som det bevarer elementer av naturlige forskrift som medfødt cis-regulatoriske elementer. Bruk av CRISPR/Cas-mediert genet målretting teknologi vil forenkle anvendelse av denne teknologien i ulike modellsystemer.

Genetisk knockout eller transgene tilnærminger har vært effektivt middel for å studere gen funksjon i dyremodeller. Men uttrykket regulering av disse er dikotom (på/av), ikke-temporal, og dermed er ikke i stand til å avsløre hele funksjonelle spekteret av et gen. Betinget grobunn/LoxP teknologi har tillatt spatio-temporale inaktivering eller aktivering av gen funksjon, men deres dikotom natur fortsetter å posere begrensningene for eksempel celle dødelighet og irreversibilitet1,2 , 3. for å fylle dette tomrommet, betinget knockdown tilnærminger har blitt utviklet ved hjelp av tet-regulert shRNA eller miRNA4. Men off-målet effekter fortsatt en bekymring for RNAi5 og har vært vanskelig for å kontrollere i vivo. Nylig har CRISPR/Cas-mediert transcriptional-kontroll teknologi innført en mer allsidig tilnærming for å oppnå både opp- og downregulation av endogene genuttrykk og demonstrerte sine verktøy6,7 . Imidlertid effektiviteten av CRISPR/Cas-mediert transcriptional kontroll er ennå uklart i vivo, og Reversibilitet KRAB-baserte undertrykkelse gjenstår for å bli sett, så sterk undertrykkelse av KRAB og dens samspill protein KAP1 har vist seg å indusere permanent genet stanse8,9.
For å håndtere disse begrensningene, har vi utviklet en roman transcriptional regulatoriske system kan betinget styre endogene byggkorn under en reversibel og tunable måte i mus med konstruert prokaryote binære transcriptional regelverk10. Prokaryote binære transcriptional regulatoriske systemer med regulatoriske ligander, som lac og tet, har aktivert slik reversibel og tunable uttrykk kontrollere11,12,13, 14. men utilstrekkelig undertrykkelse styrken av gjeldende binære systemer har hindret deres omfattende bruk for å kontrollere endogene genuttrykk i pattedyr. Vi utviklet en forbedret lac undertrykkelse system tilstrekkelig muligheter for undertrykkelse av endogene gener og ansatt en ny strategi for målretting tet transcriptional aktivator direkte til beslektet arrangøren av en endogen genet å oppnå solid upregulation (figur 1)10. Med denne teknologien, har vi oppnådd nesten to størrelsesordener uttrykk kontroll av endogene Dnmt1 genet i en tunable induserbart og reversibel måte10. Her gir vi trinnvise instruksjoner for anvendelsen i vivo til andre gener og organismer bruker mus som modell art.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59235/59235fig1.jpg"> Figur 1 : Oversikt over fjernkontrollen systemet. Transkripsjon av en endogen målet genet kan reguleres utviklet lac repressor og tet aktivator systemer. Med målet genet arrangør eller intron er konstruert for å inneholde operatorer for stramt-bindende LacIGY repressor og/eller rtTA-M2 aktivator. R angir Repron (Repinntrykk Innlpå), som inneholder 12 symmetrisk lac operatører (S) pluss en delvis kanin beta-globin intron. T angir tet operatør. Repressor og/eller aktivator/uttrykkes fra en vev-spesifikke promoter. Uttrykk for målet genet kan deretter reversibel stilles til ønsket uttrykk nivå av administrasjonen av IPTG (isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside, en antagonist av LacIGY-repressor) eller Doxycycline (Dox). Dette tallet er endret fra Lee et al.10<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59235/59235fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
Før du starter denne protokollen, se tabell 1 for å identifisere de relevante trinnene for ønsket kontroll av genuttrykk. For eksempel for å ingeniør en mus som lar reversibel downregulation av "Gene X", fullføre delene 1, 3 og 4 av de nedenfor protokollen. Tabell 1 oppsummerer også de nødvendige komponentene av fjernkontroll.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Ønsket uttrykk endring</td>
			<td>Undertrykkelse bare</td>
			<td>Aktivisering bare</td>
			<td>Både undertrykkelse og aktivisering</td>
		</tr>
<tr>
<td>Relevante delene av protokollen</td>
			<td>1, 3-4</td>
			<td>2-4</td>
			<td>1-4</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fjernkontroll sekvens trengs i målet genet</td>
			<td>Repron ("Undertrykkelse intron", 12 symmetrisk lac operatører pluss en delvis kanin beta-globin intron)</td>
			<td>Tet operator(s)</td>
			<td>Repron og Tet operator(s)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fjernkontroll sekvens plassering</td>
			<td>Intron</td>
			<td>Arrangøren</td>
			<td>Intron & arrangøren</td>
		</tr>
<tr>
<td>Aktivator/Repressor nødvendig for ønsket kontroll</td>
			<td>LacIGY Repressor</td>
			<td>rtTA-M2 aktivator</td>
			<td>LacIGY Repressor og rtTA-M2 aktivator</td>
		</tr>
<tr>
<td>Regulatoriske ligander</td>
			<td>IPTG</td>
			<td>Doxycycline</td>
			<td>IPTG og/eller Doxycycline</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1: Oversikt over fjernkontrollen komponenter.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:715px;" width="715">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">B6C3F1/J</td>
			<td style="width:149px;">The Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:183px;">100010</td>
			<td style="width:167px;">https://www.jax.org/strain/100010</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cas9 Protein</td>
			<td style="width:149px;">PNA Bio</td>
			<td style="width:183px;">CP04</td>
			<td>http://www.pnabio.com/products/CRISPR_Cas9.htm?gclid=EAIaIQobChMIsoG8pLL33QIVBr7ACh0naQ4dEAAYAiAAEgKyHvD_BwE</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CRISPOR</td>
			<td>Haeussler et al. 2016</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td>http://crispor.tefor.net/</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Doxycycline-Containing Mouse Diet</td>
			<td style="width:149px;">Envigo</td>
			<td style="width:183px;">Varies by concentration</td>
			<td>https://www.envigo.com/products-services/teklad/laboratory-animal-diets/custom-research/doxycycline-diets/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ENCODE Database</td>
			<td style="width:149px;">Stanford University</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td>https://www.encodeproject.org/</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">iCre mRNA synthesis plasmid (pBBI)</td>
			<td style="width:149px;">Addgene</td>
			<td>65795</td>
			<td>https://www.addgene.org/65795/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">IPTG</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td style="width:183px;">I2481C</td>
			<td>https://www.goldbio.com/search?isSearch=Y&#38;q=iptg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">pGL3-Basic</td>
			<td style="width:149px;">Promega</td>
			<td style="width:183px;">E1751</td>
			<td>https://www.promega.com/products/reporter-assays-and-transfection/reporter-vectors-and-cell-lines/pgl3-luciferase-reporter-vectors/?catNum=E1751</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">SVM-BPfinder</td>
			<td style="width:149px;">Regulatory Genomics, Pompeu Fabra University</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td>http://regulatorygenomics.upf.edu/Software/SVM_BP/</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">TiProD: Tissue specific promoter Database</td>
			<td style="width:149px;">Department of Bioinformatics, UMG,&#160;University of G&#246;ttingen&#160;</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td>http://tiprod.bioinf.med.uni-goettingen.de</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">UCSC Genome Browser</td>
			<td style="width:149px;">University of California Santa Cruz</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td>https://genome.ucsc.edu/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo application of the remote-control system for the manipulation of endogenous gene expression

Her beskriver vi en protokoll for å implementere fjernkontroll systemet (Reversible Manipulation of Transcription på Endogenous loci), som tillater reversibel og tunable kontroll over en endogene genet av interesse i levende modell systemer. Fjernkontroll systemet benytter forbedret lac undertrykkelse og tet aktivisering systemer å oppnå ned- eller oppregulering med et mål i en enkelt biologiske system. Tett undertrykkelse kan oppnås fra repressor bindende fleksibelt ligger langt nedstrøms en transkripsjon startwebstedet begrenser transkripsjon forlengelse. Solid upregulation kan oppnås ved å styrke transkripsjon av en endogen genet av målretting tet transcriptional aktivator beslektet selskapet. Denne reversibel og tunable kontrollen kan anvendt og trukket tilbake flere ganger i organismer. Styrken og allsidighet av systemet, som demonstrert for endogene Dnmt1 her, vil tillate mer presis i vivo funksjonelle analyser ved at etterforskningen av gen funksjon på ulike uttrykk nivåer og testet Reversibilitet av en fenotypen.

Undertrykkelse evnen til fjernkontrollen systemet har blitt demonstrert i to ulike tilnærminger hittil. I den første tilnærmingen, lac repressor bindende områder ble satt inn på endogene arrangøren av Dnmt1 genet. I den andre tilnærmingen, som er anbefalt av denne protokollen, repressor bindende områder ble satt inn i en nedstrøms intron å unngå potensielle påvirke promoter funksjonen ved innsetting og dermed forenkle bruk av fjernkontrollen- system. Begge tilnærminger resulterte i vellykket undertrykkelse (figur 2A, B og figur 3A-C)10. Dnmt1 uttrykk ble repressed 15% av uregulert nivåene med den formidler tilnærmingen (figur 2A). Denne stramt undertrykkelse ble reversert i en doseavhengig måte ved å behandle mus med varierende mengder IPTG (figur 2A). Observerte Dnmt1 undertrykkelse ble godkjent på protein nivå av immunostaining (figur 2B). Vi ikke observerer en merkbar forskjell i Dnmt1 uttrykk mellom Dnmt1+/ + og Dnmt1LO/LO mus, bekrefter at våre lac operatør innsetting ikke hadde forstyrret normal arrangøren funksjonen10. Intron tilnærming oppnådd mer enn 90% undertrykkelse fra operatører ligger flere kilobases nedstrøms av startwebstedet transkripsjon av demping transkripsjon forlengelse (Figur 3A, B)10. Denne intron tilnærming ble ytterligere validert på 7 ekstra robust arrangører (Figur 3C). Alltid stramt undertrykkelse ble oppnådd fra alle arrangører testet. Ingen sammenheng mellom de gjenværende uttrykk nivåene og styrkene til arrangørene ble observert, tyder på at undertrykkelse kapasitet intron-baserte undertrykkelse systemet overskrider transcriptional styrken av alle de robuste arrangørene vi testet () Figur 3 C).
I vivo oppregulering evnen til fjernkontroll systemet ble også demonstrert på Dnmt1 genet. Vi introdusert to kopier av operatoren tet i Dnmt1 selskapet, sammen med lac operatør sekvenser, å tillate oppregulering eller downregulation avhengig av hvilken effektor protein er tilstede. Solid upregulation og downregulation av Dnmt1 uttrykk, nær to størrelsesordener (10% til 650%), ble oppnådd i ESCs som inneholder det endrede endogene Dnmt1 allelet (Dnmt1LGT) (Figur 4A)10 . Begge regelverket var fullt reversibel og induserbart av IPTG og Dox behandlinger, henholdsvis (Figur 4A). Vi introdusert neste Dnmt1LGT endring i musen germline å teste i vivo oppregulering evnen av fjernkontroll. Sterk oppregulering av Dnmt1 ble observert fra leveren, milt og nyre, mens ingen synlig oppregulering i hjertet ble observert (Figur 4B)7. Cellen syklus-avhengige uttrykksmønster av Dnmt1 og knapphet på proliferativ celler i hjertet kan ligger denne observasjon10,56. Det gjenstår for å se om denne begrensningen kan overvinnes ved å øke hvilket uttrykk Aktivator eller antall sin bindende områder.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59235/59235fig2.jpg"> Figur 2 : I vivo undertrykkelse av Dnmt1 av LacIGY-repressor. (A) mus med lac operatører (LO) settes inn i Dnmt1 selskapet, med eller uten uttrykk for LacIGY, ble behandlet med ulike doser av IPTG. qRT PCR analyse av Dnmt1 uttrykk viser doseavhengig reversering av Dnmt1 undertrykkelse i vivo av IPTG behandling. Hver stolpe representerer data fra en annen mus. Dataene representerer gjennomsnittlig ± SEM (n = 3). (B) Immunostaining Dnmt1 protein i colonic crypts mus gitt drikkevann med eller uten 160 mM IPTG for 3 uker. Dette tallet er endret fra Lee et al.10<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59235/59235fig2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59235/59235fig3.jpg"> Figur 3 : I vivo og i vitro undertrykkelse av ulike arrangører av fjernkontroll systemet. (A) en tidlig versjon av Repron sekvensen (R *) ble satt inn i en intron nedstrøms til Villin promoter i en Villin-mKate2 transgene mus (VilmKate2). qRT PCR analyse av mKate2 uttrykk i tynntarmen mus med eller uten LacIGY repressor vises. Hver stolpe representerer data fra en annen mus. (B) AC Confocal mKate2 bilder av tynntarmen med og uten LacIGY uttrykk. (C) seks symmetrisk lac operatører (S) ble satt inn mellom ulike arrangører og luciferase reporter. Journalister (50 ng/vel i 96-brønnen plate) og repressor plasmider ble transiently innført i NIH/3T3 celler i en 1:1 molar ratio. Luciferase verdier ble vurdert 24 timer etter hva. Disse i vitro dataene representerer prosent av luciferase uttrykk i LacIGY-uttrykke celler i forhold til de uttrykker fungerer ikke LacI (NFlacI). T-tester ble brukt til å finne statistiske betydning. Dataene representerer gjennomsnittlig ± SEM (n = 3). P ≤ 0,05, **P ≤ 0,01. Dette tallet er endret fra Lee et al.10<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59235/59235fig3large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59235/59235fig4.jpg"> Figur 4 : Ned - og/eller oppregulering av Dnmt1 uttrykk i vitro og in vivo. (A) komplett fjernkontroll systemet ble utviklet i kulturperler ESCs av genet målrette og electroporation tilnærminger. Maksimal undertrykkelse av Dnmt1 uttrykk ble oppnådd med ingen behandling mens maksimal aktivisering ble oppnådd av både IPTG og Dox behandling. Dataene representerer gjennomsnittlig ± SEM (n = 3). P ≤ 0,05, **P ≤ 0,01 (Welch's t-tester). (B) In vivo aktivering av Dnmt1 av fjernkontroll systemet, som demonstrert av immunostaining Dnmt1 protein i ulike vev fra fjernkontroll mus. LGT allelet representerer selskapet modifikasjon av Dnmt1 inneholder lac operatør og tet aktivator bindende områder. Mus ble behandlet med en normal eller Dox inneholder diett (5000 mg/kg Doxycycline Hyclate) i en måned. Dette tallet er endret fra Lee et al.10<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59235/59235fig4large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Supplementary Figure 1" src="/files/ftp_upload/59235/59235supfig1.jpg"> Supplerende figur 1 : Eksempel på destinasjonssiden pad innsetting i murine Dnmt1 intron 1. (A) skjematisk av DNA mal for landing pad innsetting, tilpasset fra Quadros et al. (2015)31. Heterotypic loxP områder, JT15 og Lox2272, er atskilt med en kort avstand sekvens (sp) og flanked på hver side av 60-bp av DNA som homologe genomisk målregion. (B) prøve DNA mal for landing pad innsetting i Dnmt1 intron med følgende sgRNA: CTAGTACCACTCCTGTACCG (som mål den omvendte stranden). Den valgte intronic regionen var bioinformatically informert steg 1.1, og sgRNA ble identifisert med CRISPOR29. (C) eksempel på PCR primer design for å vurdere innsetting av landing puten. PCR primere ble utformet utenfor homologi armene av malen for å bekrefte integrering i endogene Dnmt1. Wildtype PCR amplicon er 213 bp; ved innsetting, blir 291 bp. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59235/59235supfig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>

Watch this Scientific Journal Video about In vivo Application of the REMOTE-control System for the Manipulation of Endogenous Gene Expression at JoVE.com

In vivo Application of the REMOTE-control System for the Manipulation of Endogenous Gene Expression

In vivo anvendelsen av fjernkontroll systemet for manipulering av endogene genuttrykk

Denne protokollen beskriver trinnene for å generere et modellsystem som transkripsjon av en endogen genet av interesse kan være betinget kontrollert i levende dyr og celler ved hjelp av forbedret lac repressor og/eller tet aktivator systemer.

Here we describe a protocol for implementing the REMOTE-control system (Reversible Manipulation of Transcription at Endogenous loci), which allows for ...

Betydningen av vår metode er dens allsidighet og styrke. Det gjør det mulig for forskere å ha robust kontroll over endogene genuttrykk på måter som har vært utfordrende å oppnå ved hjelp av eksisterende metoder. Det gjør det mulig for forskere å undersøke et gens funksjon på ulike uttrykksnivåer og på en spatio-temporal måte.Dermed gjør det det mulig å teste reversibilitet av en fenotype, noe som er nyttig når du studerer sykdomsrelaterte gener. For å oppnå undertrykkelse er målgenintron konstruert for å inneholde repron R, som inneholder 12 symmetriske Lac-operatører. Når LacIGY-undertrykkeren uttrykkes fra ønsket vevsspesifikk promotor, undertrykkes målgenet.Undertrykkelse av målgenet kan reverseres eller justeres til ønsket uttrykksnivå ved administrering av IPTG, en antagonist av LacIGY-undertrykkeren. For å oppnå oppregulering er målgenarrangøren konstruert for å inneholde fire eller flere Tat-operatorer, T, som bindende steder for rtTA-M2-aktivatorene. Når aktivatoren uttrykkes fra ønsket vevsspesifikk promotor i nærvær av doxycyklin, induseres oppregulering av målgenet.Oppregulering av målgenet kan reverseres eller justeres til ønsket uttrykksnivå ved å trekke tilbake eller endre konsentrasjonen av doxycyklin. For å oppnå både undertrykkelse og aktivering kan Lac-undertrykker- og Tat-aktivatorsystemene kombineres. For å endre genet av interesse for undertrykkelse, bør en transkripsjonelt inert intron mot den fem viktigste enden av genet av interesse identifiseres for innsetting av repronsekvensen.For å få den genomiske sekvensen for genet av interesse, naviger til UCSC genomleseren og velg det nyeste utkastet til musegenomet under genomer-fanen. Skriv inn navnet eller symbolet på interessegenet i søkefeltet for å vise transkripsjonene for genet, og klikk deretter gå. Deretter velger du ønsket transkripsjonsvariant for interessekonfliktgenet og klikker på gensymbolet ved siden av transkripsjonsvarianten av interesse.Deretter klikker du på den genomiske sekvenskoblingen under sekvensen og koblinger til verktøy og databasebanner. For alternativer for sekvenshentingsområde velger du bare eksoner, introner og standard én FASTA-post per gen. Hvis du vil sekvensere formateringsalternativer, velger du exons i store bokstaver, alt annet i små bokstaver og maske gjentas til N.Klikk deretter send.Til slutt lagrer du denne sekvensen, og bevarer den store og små formateringen i et dokument eller program som kan kommenteres. For å unngå avbrudd av CpG-øyene, velg show for CpG-øyene spor under uttrykket og regulering banner av UCSC genom nettleser og klikk oppdater. Zoome inn på de fem førsteklasses intronene, klikk på hver CpG-øy vist i grønt, og velg se DNA for denne funksjonen.Etter å ha valgt maske gjentar til N, klikk få DNA for å få CpG øyene sekvens. Til slutt legger du over disse sekvensene med den opprinnelige sekvensfilen, og kommenterer disse som intronic-områder du vil unngå. Hvis du vil unngå intronic-områder med forbedrede signaturer i interessevevet, navigerer du til ENCODE-database og velger eksperimentikonet.For analysetypen velger du ChiP-seq eller DNase-seq og fyller ut de andre kategoriene i henhold til cellene som skal konstrueres. Etter funksjonsvalg velger du det mest piktogrammet til venstre i blått, som viser resultater som listen vises for. Deretter velger du datasettene for målene for h3k4 monometylering, h3k27 acetylering, DNase 1 og CTCF som best matchet cellene som skal konstrueres.I hvert relevante datasett blar du til fildelen, kontrollerer at mm10 og UCSC er valgt, og klikker visualiseringsknappen. Nå, i UCSC genom nettleser, zoome inn på de fem prime introns og klikk på hver topp i de kommenterte toppsporene. Få DNA-sekvensen for hvert toppområde ved å klikke på kromosomale koordinater for hver topp.Velg DNA på rullegardinmenyen for visning, og klikk masken gjentas til N.Endelig overlegg disse sekvensene med den opprinnelige sekvensfilen og kommenterer disse som intronic-områder du vil unngå. Hvis du vil identifisere en sgRNA i de gjenværende intronic-områdene med høy spesifisitet og forventet effektivitetspoeng, navigerer du til et nettbasert sgRNA-designverktøy, for eksempel CRISPOR. Angi sekvensen av det introniske interesseområdet, angi det relevante referansegenomet, og velg ønsket protospacer tilstøtende motiv.Klikk deretter på Send inn. Deretter sorterer du de forventede sgRNA-ene etter spesifisitetspoeng og velger en eller flere sgRNA-er som også har en høy spådd effektivitetsscore. Til slutt, designe en DNA-mal som inneholder en PITT landing pad sekvens flankert på begge sider av 60-base homologi armer som tilsvarer sgRNA kuttet området.For reversering av målgenrepressing, administrer IPTG i drikkevannet til homozygous avlet mus med modifisert allele av interesse ved å fullstendig oppløse ønsket mengde IPTG i sterilt destillert vann på administrasjonsdagen. Pakk flasken med folie og administrer IPTG-vannet i en lett beskyttet flaske til musene i riktig genotype og kontroller i minst en uke. Fortsett å analysere uttrykket av genet av interesse for målvevet.For å indusere genoppreguleringen, administrer doxycyklin i dietten i en uke og fortsett å analysere uttrykket av genet av interesse for målvevet. qRT PCR anaylisis viste at DNMT1-uttrykket ble undertrykt til 15% av de uregulerte nivåene ved hjelp av den promoterbaserte tilnærmingen. Undertrykkelsen ble reversert på en doseavhengig måte ved å behandle mus med varierende mengder IPTG.Den observerte DNMT1-undertrykkelsen og reverseringen av DNMT1-undertrykkelse ved IPTG-behandling ble validert på proteinnivå ved immunoppnåelse. qRT PCR-analyse av mKate2-uttrykk viste at den intronbaserte tilnærmingen oppnådde mer enn 90 % undertrykkelse fra operatører som ligger flere kilobaser nedstrøms av transkripsjonsstartstedet ved å dempe transkripsjonsutnelsen. Konfokale bilder av mKate2-uttrykket i musenes lille intenstin med eller uten LacIGY-undertrykkeren validerte den intronbaserte tilnærmingen.Robust oppregulering og nedregulering av DNMT1-uttrykk ble oppnådd i embryonale stamceller som inneholder det modifiserte endogene DNMT1 allelet med Tat- og Lac-operatørsekvensene. Begge forskriftene var fullt reversible og indukelige ved behandling av IPTG og Dox. Sterk oppregulering av DNMT1 ble observert fra leveren, milten og nyre.Det ble imidlertid ikke observert noen påviselig oppregulering i hjertet, noe som tyder på at cellesyklusavhengig uttrykksmønster av DMNT1 og knappheten på proliferative celler i hjertet kan være til grunn for denne observasjonen. Å studere in vivo-funksjonen til et kritisk gen ved å manipulere uttrykket har ofte vært utfordrende på grunn av dødelighet. Vår metode tillot oss å overvinne den dødelige fenotypen for vårt gen av interesse og gjorde oss i stand til å studere sin rolle i tumorogenese in vivo.På samme måte vil denne teknologien muliggjøre undersøkelse av andre viktige gener som har vært vanskelige å studere.

Research

JoVE Journal

Genetics

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

In vitro transkripsjon Analyser og deres program i Drug Discovery

In vitro transcription assays have been developed and widely used for many years to study the molecular mechanisms involved in transcription. This process ...

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Genetisk manipulering av Plant Patogen<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; Å studere Fungal Biology and Plant mikrobe interaksjoner

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the ...

Inducible T7 RNA Polymerase-mediated Multigene Expression System, pMGX

Inducerbart T7 RNA Polymerase-mediert Multigen Expressions System, pMGX

Co-expression of multiple proteins is increasingly essential for synthetic biology, studying protein-protein complexes, and characterizing and harnessing ...

Controllable Ion Channel Expression through Inducible Transient Transfection

Kontrollerbar Ion Channel Expression gjennom induserbar Transient Transfeksjon

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be ...

Studying Cell Cycle-regulated Gene Expression by Two Complementary Cell Synchronization Protocols

Studier av celle-regulert genuttrykk av to komplementære cellesynkroniseringsprotokoller

The gene expression program of the cell cycle represents a critical step for understanding cell cycle-dependent processes and their role in diseases such ...

Production and Purification of Baculovirus for Gene Therapy Application

Produksjon og rensing av Baculovirus for genterapi program

Baculovirus has traditionally been used for the production of recombinant protein and vaccine. However, more recently, baculovirus is emerging as a ...

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

Manipulering av Ploidy i Caenorhabditis elegans

Mechanisms that involve whole genome polyploidy play important roles in development and evolution; also, an abnormal generation of tetraploid cells has ...

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

Utforske rot Microbiome: utpakking bakterielle samfunnet Data fra jord, Rhizosphere og rot Endosphere

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...

Manipulation of Gene Function in Mexican Cavefish

Manipulering av gen funksjon i meksikansk Cavefish

Cave animals provide a compelling system for investigating the evolutionary mechanisms and genetic bases underlying changes in numerous complex traits, ...

Efficient Transcriptionally Controlled Plasmid Expression System for Investigation of the Stability of mRNA Transcripts in Primary Alveolar Epithelial Cells

Effektivt transkripsjonskontrollert plasmid uttrykkssystem for undersøkelse av stabiliteten av mRNA transkripsjoner i primær alveorisk epitelceller

Studying posttranscriptional regulation is fundamental to understanding the modulation of a given messenger RNA (mRNA) and its impact on cell homeostasis ...