Name: in vivo application of the remote-control system for the manipulation of endogenous gene expression
Uploaded: 2019-03-29T14:00:00
Duration: 8 min 54 s
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Agradecemos a tarde Dr Heidi Scrable pelo seu generoso presente da construção de gene de mamífero Laureano (Mayo Clinic, Rochester, MN), Dr Daniel Louvard (Institut Curie, Paris, França) para fornecer o promotor Villin e Dr Laurie Jackson-Grusby (Hospital infantil, Boston, MA) por suas contribuições para as fases iniciais de desenvolvimento desta tecnologia. Estamos gratos por Dr Nancy Wu e Dr Robert Maxson por sua assistência na geração de ratos transgênicos e nocaute. Agradecemos os membros do laboratório Laird para discussões úteis e apoio. Este trabalho foi financiado pelos institutos nacionais de saúde [CA75090 R01 R01 DA030325, R01 CA157918 e R01 CA212374 para P.W.L. e 1F31CA213897-01A1 para N.A.V.S].

PWL serve nas placas consultivo científico de AnchorDx e Progenity, Inc.

Um passo crítico e limitação potencial do sistema de controle remoto é o desafio que está associado com a inserção do repressor e/ou locais obrigatórios de ativador sem afetar a expressão do gene alvo. Nossa abordagem original de repressão, como aplicado ao gene Dnmt1 , envolveu inserção dos sítios de ligação do repressor lac dentro regiões transcricionalmente críticas de um promotor. Para reduzir o risco de afetar a função de promotor e, portanto, para melhorar a aplicabilidade geral do sistema de controle remoto, desenvolvemos uma abordagem baseada em intrão repressão. A potência do nosso sistema de reforço ALC permitiu-nos firmemente a reprimir a transcrição de todos os promotores fortes que testamos em operadores localizados centenas de diversos kilobases a jusante da transcrição iniciar sites (Figura 3A – C) 10. importante, os níveis de repressão eram independentes das forças transcriptional dos promotores (Figura 3A – C)10. Isto sugere que a capacidade de repressão de nosso sistema de repressão baseado em intrão excede a força transcriptional dos promotores testados. Essa abordagem baseada em intrão, é provável que a repressão é mediada através de interferência física entre dois componentes, a máquina de alongamento de transcrição e a ALC repressores57. Este mecanismo simples repressão e a robustez demonstrada do método baseado em intrão podem tornar essa abordagem geralmente aplicáveis aos organismos, tecidos e genes diferentes.
O upregulation pelo sistema de controle remoto requer as sequências de ligação liberada para estar em proximidade com o promotor do gene alvo, que implica um risco de afetar a função de promotor. No entanto, encontramos que a posição de ligação a sequências pode ser fora da região transcricionalmente crítica. Promotores de tanto Dnmt1 e EF1α foram robustamente upregulated de tet operadores localizado um par de cem bases rio acima da transcrição iniciar sites10. Essa restrição relaxada reduz bastante a chance de afetar a função de promotor de um gene alvo na ausência da liberada. Aumentando o número de ligação a sequências e/ou uso de transactivators mais fortes pode ajudar a reduzir ainda mais o risco, permitindo a regulação alta de sites mais distante longe do local de início de transcrição.
Nosso sistema de controle remoto fornece controle elegante do nível, sincronismo e localização da expressão do gene endógeno, permitindo testar a reversibilidade de um fenótipo e as consequências dos níveis de expressão diferente, que não são facilmente alcançáveis por atual em tecnologias de controle de expressão de gene vivo. É importante notar que, na maioria das análises de expressão de gene, incluindo a nossa, expressão valores representam a média de uma população de células entre as quais uma variação considerável pode ser encontrada. Esta heterogeneidade pode influenciar processos de tomada de decisão celulares, tais como diferenciação ou apoptose58. Embora a precisão do controle de expressão de gene provavelmente poderia ser melhorada pelo circuito genéticos adicionais engenharia59, a potência observada do nosso atual sistema permitirá investigação útil da função dos genes em muitos contextos biológicos. Além disso, espera-se um elevado grau de especificidade do alvo por causa da complexidade de sequências de operador, bem como a grande distância evolutiva entre mamíferos e a espécie originário dos componentes regulatórios60. Além disso, linhas de rato transgénico dos repressores e ativadores podem ser desenvolvidas e empregadas para qualquer gene endógeno. Por exemplo, modelos de rato liberada tet existentes podem ser adaptados para realizar a regulação alta de um gene alvo nos tecidos do mouse desejado. Recentemente desenvolvemos uma linha de transgênica que poderá conduzir a robusta expressão tecido-específica de nosso repressor lac reforçada em vários tipos de tecido quando combinado com linhas existentes do Cre introduzindo o gene lacIGY para o locus Hipp11 48 sob o controle de um elemento de Lox-STOP-Lox (não publicado). Esta linha substancialmente facilitaria a aplicação de tecido-específica do sistema de controle remoto.
Gene upregulation pelo sistema de controle remoto oferece várias vantagens em comparação com as abordagens atuais de transgénicas inducible. Não requer geração de múltiplas linhas transgénicas para testar os efeitos da posição da inserção, como ele utiliza o locus endógeno. Além disso, essa abordagem é well-suited para upregulation de genes com expressão de base forte porque aumenta a expressão de um promotor já robusto, Considerando que modelos transgénicos convencionais dependem mínimos promotores virais. Por último, o tecido especificidade, controle do ciclo celular e variantes de um gene alvo de emenda podem ser mantidos com upregulation pela nossa abordagem, que conserva elementos de regulação natural como inata cis-elementos reguladores. O advento da tecnologia de gene-alvo CRISPR/Cas-mediada facilitará grandemente a aplicação desta tecnologia em sistemas de diversos modelo.

Nocaute genético ou abordagens transgênicas foram meios eficazes para estudar a função do gene em modelos animais. No entanto, regulação da expressão por essas abordagens é dicotômica (ligar/desligar), não-temporal e, portanto, não é capaz de revelar o espectro completo e funcional de um gene. Tecnologias deimg Cre/L condicionais permitiram inactivação espácio-temporais ou ativação da função do gene, mas sua natureza dicotômica continua a representar limitações, tais como célula letalidade e irreversibilidade1,2 , 3. a fim de preencher esse vazio, abordagens knockdown condicionais têm sido desenvolvidos usando tet-regulada shRNA ou miRNA4. No entanto, o alvo efeitos permanecem uma preocupação para RNAi5 e tem sido um desafio para controlar in vivo. Mais recentemente, CRISPR/Cas-mediada por tecnologias de controle transcricional introduziram uma abordagem mais versátil para alcançar tanto a montante e downregulation da expressão do gene endógeno e demonstrou seus utilitários6,7 . No entanto, a eficácia do controle transcricional mediada CRISPR/Cas desconhece-se ainda na vivo e a reversibilidade da repressão com base em CASCUDO continua a ser visto, tão forte repressão por CASCUDO e sua proteína de interação KAP1 foi mostrada para induzir silenciamento de8,9do gene permanente.
Para lidar com essas limitações, nós desenvolvemos um sistema regulador transcricional romance capaz de Controlar condicionalmente a expressão do gene endógeno em um reversível e forma sintonizável em ratos usando engenharia transcricional procariótico binário sistemas de regulação10. Sistemas reguladores transcricionais binários procarióticos com ligantes reguladoras, tais como lac e tet, permitiram tal reversível e expressão sintonizável controlar11,12,13, 14. no entanto, a potência de repressão inadequada dos sistemas binário atuais tem impedido sua ampla adoção para controlar a expressão do gene endógeno nos mamíferos. Desenvolvemos um sistema de repressão ALC reforçada suficientemente potente para a repressão de genes endógenos e empregou uma estratégia romance de direcionamento tet ativadores transcricionais diretamente para o cognato promotor de um gene endógeno para alcançar upregulation robusto (Figura 1)10. Com esta tecnologia, conseguimos fazer quase duas ordens de magnitude controle de expressão do gene endógeno Dnmt1 numa forma sintonizável, inducible e reversível10. Aqui nós fornecemos instruções passo a passo para a sua aplicação in vivo de outros genes e organismos usando ratos como uma espécie de modelo.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59235/59235fig1.jpg"> Figura 1 : Visão geral do sistema de controle remoto. A transcrição de um gene endógeno do alvo pode ser regulada usando repressor lac de engenharia e sistemas de ativador de tet . O promotor do gene alvo ou intrão é projetado para conter operadores para o repressor de LacIGY apertado-vinculação e/ou o rtativador TA-M2. R indica Repron (RepCV intrno), que contém 12 operadores simétrica ALC (S) e mais um intrão de beta-globina coelho parcial. T indica o operador tet . O repressor activator é e/ou exprimem-se de um promotor de tecido-específica. A expressão do gene do alvo pode então ser reversível sintonizada para o nível de expressão desejada pela administração de IPTG (isopropil β-D-1-thiogalactopyranoside, um antagonista do repressor LacIGY) ou doxiciclina (Dox). Esta figura foi modificada de Lee et al.10<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59235/59235fig1large.jpg" target="_blank">, por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Antes de iniciar este protocolo, rever tabela 1 para identificar as etapas relevantes para o controle desejado da expressão do gene. Por exemplo, provocar um mouse que permite reversível downregulation de "Gene X", completar as seções 1, 3 e 4 da abaixo de protocolo. Tabela 1 também resume os componentes necessários do sistema de controle remoto.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Mudança de expressão desejada</td>
			<td>Repressão apenas</td>
			<td>Ativação somente</td>
			<td>Tanto a repressão e a ativação</td>
		</tr>
<tr>
<td>Seções relevantes do protocolo</td>
			<td>1, 3-4</td>
			<td>2-4</td>
			<td>1-4</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sequência de controle remoto necessária no Gene alvo</td>
			<td>Repron ("Intrão repressão"; 12 operadores de ALC simétrica mais um intrão de beta-globina coelho parcial)</td>
			<td>Operadores de Tet</td>
			<td>Operadores Repron e Tet</td>
		</tr>
<tr>
<td>Localização de sequência de controle remoto</td>
			<td>Intrão</td>
			<td>Promotor</td>
			<td>Intrão & promotor</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ativador/Repressor necessário para o controle desejado</td>
			<td>LacIGY Repressor</td>
			<td>Ativador de rtTA-M2</td>
			<td>LacIGY Repressor e ativador rtTA-M2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ligantes regulamentares</td>
			<td>IPTG</td>
			<td>Doxiciclina</td>
			<td>IPTG e/ou doxiciclina</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: Visão geral dos componentes de controle remoto.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:715px;" width="715">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">B6C3F1/J</td>
			<td style="width:149px;">The Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:183px;">100010</td>
			<td style="width:167px;">https://www.jax.org/strain/100010</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cas9 Protein</td>
			<td style="width:149px;">PNA Bio</td>
			<td style="width:183px;">CP04</td>
			<td>http://www.pnabio.com/products/CRISPR_Cas9.htm?gclid=EAIaIQobChMIsoG8pLL33QIVBr7ACh0naQ4dEAAYAiAAEgKyHvD_BwE</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CRISPOR</td>
			<td>Haeussler et al. 2016</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td>http://crispor.tefor.net/</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Doxycycline-Containing Mouse Diet</td>
			<td style="width:149px;">Envigo</td>
			<td style="width:183px;">Varies by concentration</td>
			<td>https://www.envigo.com/products-services/teklad/laboratory-animal-diets/custom-research/doxycycline-diets/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ENCODE Database</td>
			<td style="width:149px;">Stanford University</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td>https://www.encodeproject.org/</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">iCre mRNA synthesis plasmid (pBBI)</td>
			<td style="width:149px;">Addgene</td>
			<td>65795</td>
			<td>https://www.addgene.org/65795/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">IPTG</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td style="width:183px;">I2481C</td>
			<td>https://www.goldbio.com/search?isSearch=Y&#38;q=iptg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">pGL3-Basic</td>
			<td style="width:149px;">Promega</td>
			<td style="width:183px;">E1751</td>
			<td>https://www.promega.com/products/reporter-assays-and-transfection/reporter-vectors-and-cell-lines/pgl3-luciferase-reporter-vectors/?catNum=E1751</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">SVM-BPfinder</td>
			<td style="width:149px;">Regulatory Genomics, Pompeu Fabra University</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td>http://regulatorygenomics.upf.edu/Software/SVM_BP/</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">TiProD: Tissue specific promoter Database</td>
			<td style="width:149px;">Department of Bioinformatics, UMG,&#160;University of G&#246;ttingen&#160;</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td>http://tiprod.bioinf.med.uni-goettingen.de</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">UCSC Genome Browser</td>
			<td style="width:149px;">University of California Santa Cruz</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td>https://genome.ucsc.edu/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo application of the remote-control system for the manipulation of endogenous gene expression

Aqui descrevemos um protocolo para a implementação do sistema de controle remoto (Reversible Manipulation of Transcription em Endogenous loci), que permite o controle de expressão reversíveis e ajustáveis de uma endógena do gene de interesse na vida modelar sistemas. O sistema de controle remoto emprega sistemas de ativação repressão e tet reforçada ALC para alcançar para baixo - ou upregulation de um gene alvo dentro de um sistema biológico. Repressão apertado pode ser alcançado de repressor vinculação sites flexìvel localizados mais a jusante de um site de início de transcrição por inibição da elongação da transcrição. Upregulation robusto pode ser alcançado por reforçar a transcrição de um gene endógeno pela segmentação ativadores transcricionais de tet à promotora cognata. Este controle de expressão reversível e ajustável pode ser aplicada e retirada repetidamente em organismos. A potência e a versatilidade do sistema, como demonstrado por endógena Dnmt1 aqui, permitirá mais precisas análises funcionais in vivo, permitindo a investigação da função dos genes em vários níveis de expressão e de testes a reversibilidade de uma fenótipo.

A capacidade de repressão do sistema de controle remoto tem sido demonstrada em duas abordagens diferentes, até agora. Na primeira abordagem, sítios de ligação de repressor lac foram inseridos no promotor do gene da Dnmt1 endógeno. A segunda abordagem, que é recomendada pelo presente protocolo, os sítios de ligação do repressor foram inseridos em um intrão a jusante para evitar o risco potencial de afetar a função de promotor pela inserção e, desse modo, para simplificar a aplicação do controle-remoto sistema. Ambas as abordagens resultaram na bem sucedida repressão (Figura 2A, B e Figura 3A-C)10. DNMT1 expressão foi reprimida a 15% dos níveis não regulamentados usando a abordagem baseada em promotor(Figura 2). Essa repressão apertado foi revertida de forma dose-dependente por tratamento de ratos com quantidades variadas de IPTG(Figura 2). A repressão Dnmt1 observada foi validada a nível de proteína por imunocoloração (Figura 2B). Não observamos qualquer diferença perceptível na expressão de Dnmt1 entre Dnmt1+ + e Dnmt1LO/LO ratos, confirmando que nossa inserção de operador do lac não tinha interrompido promotor normal função10. A abordagem baseada em intrão alcançado mais de repressão de 90% dos operadores localizado diversos kilobases a jusante do local de início da transcrição se atenuar a transcrição do alongamento (Figura 3A, B)10. Essa abordagem baseada em intrão mais foi validada em sete promotores de robustos adicionais (Figura 3C). Repressão invariavelmente apertado foi alcançado de todos os promotores testados. Nenhuma correlação entre os níveis de expressão residual e os pontos fortes dos promotores foi observada, sugerindo que a capacidade de repressão de nosso sistema de repressão baseado em intrão excede a potência transcriptional de todos os promotores robustos testamos ( Figura 3 C).
A capacidade de regulação alta in vivo do sistema de controle remoto também foi demonstrada no gene Dnmt1 . Duas cópias do operador tet introduzido o promotor Dnmt1 , juntamente com sequências de operador do lac , para permitir a regulação alta ou downregulation dependendo qual effector proteína está presente. Upregulation robusto e downregulation de expressão de Dnmt1 , perto de duas ordens de magnitude (10% a 650%), foram alcançados na CES contendo o alelo modificado de Dnmt1 endógeno (Dnmt1LGT)(Figura 4)10 . Ambos os regulamentos foram totalmente reversíveis e inducible por tratamentos de IPTG e Dox, respectivamente(Figura 4). Em seguida apresentamos a modificação de Dnmt1LGT para testar a capacidade de regulação alta in vivo do sistema de controle remoto da linha germinal rato. Observou-se uma forte regulação alta de Dnmt1 desde o fígado, baço e rins, Considerando que nenhum upregulation detectável no coração foi observada (Figura 4B)7. O padrão de expressão de ciclo celular dependente de Dnmt1 e a escassez de células proliferativas no coração podem subjacentes a esta observação10,56. Remanesce ser visto se essa limitação pode ser superada pelo aumento do nível de expressão do ativador ou o número de seus sítios de ligação.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59235/59235fig2.jpg"> Figura 2 : Na vivo repressão de Dnmt1 pelo repressor LacIGY. (A) ratos com operadores de ALC (LO) inseridos o promotor Dnmt1 , com ou sem expressão de LacIGY, foram tratados com diferentes doses de IPTG. análise de qRT-PCR de Dnmt1 expressão mostra a inversão de dose-dependente da repressão Dnmt1 in vivo por tratamento de IPTG. Cada barra representa dados de um mouse diferente. Dados representam média ± SEM (n = 3). (B) imunocoloração de Dnmt1 proteína nas criptas do cólon de ratos fornecida água potável, com ou sem 160 mM IPTG por 3 semanas. Esta figura foi modificada de Lee et al.10<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59235/59235fig2large.jpg" target="_blank">, por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59235/59235fig3.jpg"> Figura 3 : Na vivo e repressão in-vitro de vários promotores pelo sistema de controle remoto. (A), uma versão inicial da sequência de Repron (R *) foi inserido um intrão a jusante do promotor Villin em um rato transgénico Villin-mKate2 (VilmKate2). análise de qRT-PCR de expressão mKate2 no intestino delgado de ratos com ou sem o repressor de LacIGY é mostrado. Cada barra representa dados de um mouse diferente. (B) mKate2 Confocal imagens do intestino delgado com e sem expressão de LacIGY . (C) os seis operadores simétrica ALC (S) foram inseridos entre vários promotores e um repórter do luciferase. Repórteres (50 ng/bem em placa de 96 poços) e repressor plasmídeos transitoriamente foram introduzidos em células NIH/3T3 na proporção molar de 1:1. Luciferase valores foram avaliado 24 h depois do transfection. Estas dados in vitro representam a porcentagem de expressão do luciferase em LacIGY-expressando células em relação aqueles expressando não funcionais Laureano (NFlacI). T-testes foram usados para determinar a significância estatística. Dados representam média ± SEM (n = 3). P ≤ 0,05, * *P ≤ 0.01. Esta figura foi modificada de Lee et al.10<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59235/59235fig3large.jpg" target="_blank">, por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59235/59235fig4.jpg"> Figura 4 : Para baixo e / ou upregulation de expressão Dnmt1 in vitro e in vivo. (A) o sistema completo de controle remoto foi projetado em CES cultivadas por abordagens de segmentação e eletroporação de gene. Máxima repressão da expressão de Dnmt1 foi alcançado sem tratamento enquanto máxima ativação foi alcançada pelo tratamento tanto IPTG e Dox. Dados representam média ± SEM (n = 3). P ≤ 0,05, * *P ≤ 0.01 (Welch t-testes). (B) ativação In vivo de Dnmt1 pelo sistema de controle remoto, como demonstrado por imunocoloração de Dnmt1 proteína em vários tecidos de ratos controle remoto. O alelo LGT representa modificação promotor de Dnmt1 para conter os locais de ligação ativador de operador e tet ALC . Os ratos foram tratados com uma dieta normal ou contendo Dox (Doxycycline Hyclate 5000 mg/kg) por um mês. Esta figura foi modificada de Lee et al.10<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59235/59235fig4large.jpg" target="_blank">, por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Supplementary Figure 1" src="/files/ftp_upload/59235/59235supfig1.jpg"> Complementar Figura 1 : Exemplo de inserção de almofada de aterragem em murino intrão Dnmt1 1. (A) esquema do modelo de DNA para aterrar a inserção de almofada, adaptada de Quadros et al (2015)31. Sites heterotypic loxP , JT15 e Lox2272, são separados por uma sequência curta do espaçador (sp) e flanqueados de cada lado por 60-bp de DNA que é homóloga à região genômica de alvo. (B) amostra de DNA modelo para desembarque inserção de almofada para o intrão Dnmt1 usando o seguinte sgRNA: CTAGTACCACTCCTGTACCG (que tem como alvo a vertente inversa). A região selecionada intrônicas foi bioinformatically informado pela etapa 1.1, e o sgRNA foi identificado usando o CRISPOR29. (C) exemplo de projeto da primeira demão PCR para avaliar a inserção da área de pouso. Iniciadores de PCR foram concebidos fora os braços de homologia do modelo para confirmar a integração no endógeno Dnmt1. A sua PCR amplicons é 213 bp; após a inserção, torna-se 291 dom <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59235/59235supfig1large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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In vivo Application of the REMOTE-control System for the Manipulation of Endogenous Gene Expression

Na aplicação do sistema de controle remoto para a manipulação da expressão do Gene endógeno de vivo

Este protocolo descreve as etapas necessárias para gerar um modelo de sistema em que a transcrição de um gene endógeno de interesse pode ser condicionalmente controlada em animais vivos ou células usando reforçada ALC repressor e/ou sistemas de ativador de tet .

Here we describe a protocol for implementing the REMOTE-control system (Reversible Manipulation of Transcription at Endogenous loci), which allows for ...

O significado do nosso método é sua versatilidade e potência. Permite que os pesquisadores tenham um controle robusto sobre a expressão genética endógena de maneiras que têm sido desafiadoras para alcançar usando métodos existentes. Permite que os pesquisadores investiguem a função de um gene em vários níveis de expressão e de forma espesso-temporal.Assim, permite testar a reversibilidade de um fenótipo, o que é útil no estudo de genes relacionados à doença. Para alcançar a repressão, o gene alvo intron é projetado para conter o repron R, que contém 12 operadores de Lac simétricos. Quando o repressor LacIGY é expresso do promotor específico do tecido desejado, o gene alvo é reprimido.A repressão do gene alvo pode ser revertida ou ajustada ao nível de expressão desejado pela administração do IPTG, um antagonista do repressor LacIGY. Para alcançar a regulação, o promotor de genes alvo é projetado para conter quatro ou mais operadores de Tat, T, como locais de vinculação para os ativadores rtTA-M2. Quando o ativador é expresso do promotor específico do tecido desejado na presença de doxiciclina, a regulação do gene alvo é induzida.A regulação do gene alvo pode ser revertida ou ajustada ao nível de expressão desejado, retirando ou alterando a concentração de doxiciclina. Para realizar tanto a repressão quanto a ativação, os sistemas de repressor Lac e Tat podem ser combinados. Para modificar o gene de interesse para a repressão, um introna transcrição inerte para a extremidade cinco prime do gene de interesse deve ser identificado para a inserção da sequência de repron.Para obter a sequência genômica para o gene de interesse, navegue até o navegador de genomas UCSC e selecione o último rascunho do genoma do mouse sob a guia genomas. Digite o nome ou símbolo do gene de interesse na barra de pesquisa para visualizar as transcrições do gene e, em seguida, clique em ir. Em seguida, selecione a variante de transcrição desejada para o gene de interesse e clique no símbolo genético ao lado da variante de transcrição de interesse.Em seguida, sob a sequência e links para o banner de ferramentas e bancos de dados, clique no link de sequência genômica. Para opções de região de recuperação de sequência, selecione apenas exons, introns e o registro FASTA padrão por gene. Para sequenciar opções de formatação, selecione exons em maiústos em maiústos, tudo o mais em minúsculas e máscaras se repete para N.Then, clique em enviar.Finalmente, salve esta sequência, preservando a formatação maiúsdia e minúscula em um documento ou programa que pode ser anotado. Para evitar a interrupção das ilhas CpG, selecione mostrar para as ilhas CpG acompanhar sob a bandeira de expressão e regulação do navegador de genoma UCSC e clicar em atualizar. Ampliando os cinco introns primos, clique em cada ilha do CpG mostrada em verde e selecione exibir DNA para este recurso.Depois de selecionar a máscara se repete para N, clique em obter DNA para obter a sequência das ilhas CpG. Finalmente, sobreponha essas sequências com o arquivo de sequência original e anotar-nas como regiões intrônicas para evitar. Para evitar regiões intrônicas com assinaturas de aprimoramento nos tecidos de interesse, navegue até a base de dados ENCODE e selecione o ícone de experimentos.Para o tipo de ensaio, selecione ChiP-seq ou DNase-seq e preencha as outras categorias de acordo com as células a serem projetadas. Após a seleção do recurso, selecione o pictograma mais à esquerda em azul, para o qual os resultados de visualização à medida que a lista aparece. Em seguida, selecione os conjuntos de dados para os alvos da monometilação h3k4, acetilação h3k27, DNase 1 e CTCF que mais combinavam com as células a serem projetadas.Dentro de cada conjunto de dados relevante, role até a seção de arquivos, verifique se o mm10 e o UCSC estão selecionados e clique no botão visualizar. Agora, no navegador de genomas UCSC, amplie os cinco introns primos e clique em cada pico nas faixas de pico anotadas. Obtenha a sequência de DNA para cada região de pico clicando nas coordenadas cromossômicas para cada pico.No menu suspenso de exibição, selecione DNA e a máscara de clique se repita para N.Finalmente, sobreponha essas sequências com o arquivo de sequência original e anote-as como regiões intrônicas para evitar. Para identificar um sgRNA nas regiões intrônicas remanescentes com alta especificidade e pontuações de eficiência previstas, navegue até uma ferramenta de design sgRNA on-line de escolha, como o CRISPOR. Digite a sequência da região de interesse intronic, especifique o genoma de referência relevante e selecione o motivo adjacente protoespaço desejado.Em seguida, clique em enviar. Em seguida, classifique o sgRNA previsto por pontuação de especificidade e selecione um ou mais sgRNA's que também têm uma pontuação de eficiência prevista. Finalmente, projete um modelo de DNA contendo uma sequência de plataforma de pouso PITT ladeada em ambos os lados por braços de lialogia de 60 bases que correspondem ao local de corte de sgRNA.Para a reversão da repressão genética alvo, administre o IPTG na água potável dos camundongos criados homozigos com o alelo modificado de interesse, dissolvendo totalmente a quantidade desejada de IPTG em água destilada estéril no dia da administração. Enrole a garrafa com papel alumínio e administre a água IPTG em uma garrafa leve protegida aos ratos do genótipo e controles apropriados por pelo menos uma semana. Prossiga para analisar a expressão do gene de interesse no tecido alvo.Para induzir a regulação genética, administre a doxiciclina na dieta por uma semana e prossiga para analisar a expressão do gene de interesse no tecido alvo. qRT PCR anaylisis mostrou que a expressão DNMT1 foi reprimida a 15% dos níveis não regulamentados usando a abordagem baseada em promotores. A repressão foi revertida de forma dependente de dose, tratando camundongos com quantidades variadas de IPTG.A repressão observada de DNMT1 e a reversão da repressão do DNMT1 pelo tratamento do IPTG foram validadas ao nível da proteína por imunossuagem. qRT PCR análise da expressão mKate2 mostrou que a abordagem baseada em intron alcançou mais de 90% de repressão dos operadores localizados várias quilobases a jusante do local de início da transcrição, atenuando o alongamento da transcrição. Imagens confocal da expressão mKate2 na pequena intenstina dos ratos com ou sem o repressor LacIGY validaram a abordagem baseada em intron.A regulação robusta e a baixa regulação da expressão DNMT1 foram alcançadas em células-tronco embrionárias contendo o alelo Endogeno DNMT1 modificado com sequências de operadores Tat e Lac. Ambos os regulamentos foram totalmente reversíveis e induíveis pelos tratamentos IPTG e Dox. Forte regulação do DNMT1 foi observada a partir do fígado, baço e rim.No entanto, não foi observada uma regulação detectável no coração, sugerindo que o padrão de expressão dependente do ciclo celular do DMNT1 e a escassez de células proliferativas no coração podem estar por trás dessa observação. Estudar a função in vivo de um gene crítico manipulando sua expressão tem sido muitas vezes desafiador devido à letalidade. Nosso método nos permitiu superar o fenótipo letal para nosso gene de interesse e nos permitiu estudar seu papel na tumorogênese in vivo.Da mesma forma, essa tecnologia permitirá a investigação de outros genes essenciais que têm sido difíceis de estudar.

Research

JoVE Journal

Genetics

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

Transcrição in vitro Ensaios e sua aplicação em Drug Discovery

In vitro transcription assays have been developed and widely used for many years to study the molecular mechanisms involved in transcription. This process ...

Genética

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Manipulação genética do patógeno de planta<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; Estudar Biologia fúngicos e vegetais Microbe Interactions

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the ...

Inducible T7 RNA Polymerase-mediated Multigene Expression System, pMGX

Sistema Induzível de Expressão Multigênica mediada por polimerização T7 de T7, pMGX

Co-expression of multiple proteins is increasingly essential for synthetic biology, studying protein-protein complexes, and characterizing and harnessing ...

Controllable Ion Channel Expression through Inducible Transient Transfection

Controlável Expressão Ion Canal através de transfecção transiente Induzível

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be ...

Studying Cell Cycle-regulated Gene Expression by Two Complementary Cell Synchronization Protocols

Estudo da Expressão de Genes Reguladores do Ciclo Celular por dois Protocolos Complementares de Sincronização Celular

The gene expression program of the cell cycle represents a critical step for understanding cell cycle-dependent processes and their role in diseases such ...

Production and Purification of Baculovirus for Gene Therapy Application

Produção e purificação de Baculovirus para aplicação de terapia gênica

Baculovirus has traditionally been used for the production of recombinant protein and vaccine. However, more recently, baculovirus is emerging as a ...

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

Manipulação de ploidia em Caenorhabditis elegans

Mechanisms that involve whole genome polyploidy play important roles in development and evolution; also, an abnormal generation of tetraploid cells has ...

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

Explorando o microbioma da raiz: extraindo dados da comunidade bacteriana do solo

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...

Manipulation of Gene Function in Mexican Cavefish

Manipulação de função do Gene em Cavefish mexicano

Cave animals provide a compelling system for investigating the evolutionary mechanisms and genetic bases underlying changes in numerous complex traits, ...

Efficient Transcriptionally Controlled Plasmid Expression System for Investigation of the Stability of mRNA Transcripts in Primary Alveolar Epithelial Cells

Sistema de expressão plasmídeamente controlado transcricionalmente para investigação da estabilidade das transcrições de mRNA em células epiteliais alveolares primárias

Studying posttranscriptional regulation is fundamental to understanding the modulation of a given messenger RNA (mRNA) and its impact on cell homeostasis ...