Name: in vivo application of the remote-control system for the manipulation of endogenous gene expression
Uploaded: 2019-03-29T14:00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In vivo Application of the REMOTE-control System for the Manipulation of Endogenous Gene Expression at JoVE.com

Мы благодарим конце Доктор Хайди Scrable за ее щедрый подарок млекопитающих ЗСБН гена конструкции клиники Майо (Рочестер, Миннесота), д-р Даниэль Louvard (Institut Curie, Париж, Франция) для предоставления Виллин промоутер и д -р Лори Джексон-Grusby (Детская больница, Бостон, MA) за ее вклад в ранних стадиях развития этой технологии. Мы благодарны за Ву Нэнси д-р и д-р Роберт Maxson за их помощь в создании нокаут и трансгенных мышей. Мы благодарим членов Лэрд лаборатории полезные обсуждения и поддержки. Эта работа была поддержана национальных институтов здравоохранения [R01 CA75090, R01 DA030325, R01 CA157918 и R01 CA212374 для P.W.L. и 1F31CA213897-01A1 на N.A.V.S].

PWL служит на научных консультативных советов AnchorDx и Progenity, Inc.

Важным шагом и потенциальные ограничения системы дистанционного управления является проблемой, связанные с включением репрессор или активатор сайтов связывания не затрагивая экспрессии генов целевой. Наш оригинальный подход репрессий, применительно к Dnmt1 гена, участие вставки лак репрессор привязки сайтов в пределах транскрипционно критических регионах промоутер. Чтобы уменьшить риск затрагивающих функции организатора и таким образом улучшить общую применимость системы дистанционного управления, мы разработали подход на основе Интрон репрессий. Сила нашей расширенной лак системы позволили нам жестко подавлять транскрипцию всех сильными промоутерами, мы протестировали на операторы расположен сотни до нескольких kilobases вниз по течению транскрипции начать сайтов (рис. 3A-C) 10. Важно отметить, что уровень репрессий были независимы от транскрипционный анализ сильных сторон промоутеров (рис. 3A-C)10. Это свидетельствует о том, что репрессии против нашей системы на основе Интрон репрессий превышает транскрипционный анализ прочности протестированных промоутеров. В этот подход на основе Интрон вполне вероятно, что репрессии опосредовано через физические помехи между двумя компонентами, удлинение машины транскрипции и лак подавляющего57. Этот механизм простой репрессий и продемонстрировали надежность метода на основе Интрон может сделать этот подход общеприменимых различных генов, тканей и организмов.
Upregulation системой дистанционного управления требует привязки последовательности transactivator в близости от целевого гена промоутер, который влечет за собой риска промоутер функции. Однако мы обнаружили, что позиция привязки последовательности может быть за пределами транскрипционно критической области. Dnmt1 и EF1α промоутеров были надежно upregulated от операторов тет расположенный пару сотен баз вверх по течению транскрипции начала сайты10. Это расслабленной ограничение значительно уменьшает вероятность затрагивающих промоутер функции целевого гена в отсутствие transactivator. Увеличение числа привязки последовательностей и/или использование более transactivators может помочь дальнейшему сокращению риска, позволяя upregulation от сайтов дальше от места начала транскрипции.
Наша система дистанционного управления обеспечивает элегантный контроль уровня, сроков и местоположения экспрессии генов эндогенные, позволяя для тестирования обратимости фенотип и последствия различных выражений уровней, которые не являются легко достижимыми современные технологии управления выражения в vivo гена. Важно отметить, что в большинстве анализа выражения гена, включая ours, выражение значения представляют средний популяции клеток, среди которых можно найти значительные различия. Эта разнородность может повлиять клеточных процессах, например дифференциация или apoptosis58. Хотя вероятно точность управления выражения гена можно добиться дальнейшего улучшения дополнительной генетической цепи инженерных59, наблюдаемых потенции нашей нынешней системы позволит полезные исследования функции гена во многих биологических контекстах. Кроме того высокая степень специфичности целевой ожидается ввиду сложности оператор последовательности, а также большой эволюционный расстояние между млекопитающих и происхождения видов нормативных компонентов60. Кроме того можно развивать и работает для любого внутреннего гена трансгенные мыши линий подавляющего и активаторов. Например существующие тет transactivator мыши модели могут быть адаптированы для выполнения upregulation целевого гена в тканях желаемого мыши. Мы недавно разработали трансгенные линии, которая может управлять надежные ткани конкретным выражением нашей расширенной лак репрессор в нескольких типов тканей в сочетании с существующими линиями Cre путем введения гена lacIGY в Hipp11 Локус48 под контролем Lox-стоп-Lox элемента (не опубликован). Эта линия существенно облегчит применение тканей специфические системы дистанционного управления.
Джин upregulation системой дистанционного управления обеспечивает ряд преимуществ по сравнению с текущей индуцибельной трансгенных подходы. Она не требует поколение нескольких трансгенных линий для проверки эффектов позиция вставки, как он использует эндогенный Локус. Кроме того этот подход хорошо подходит для upregulation генов с сильным Базовые выражения потому, что он усиливает выражение из уже надежные промоутер, тогда как обычные трансгенные модели полагаются на минимальной вирусных промоутеров. И наконец, ткани специфичности, контроль клеточного цикла и сплайсинга варианты целевого гена могут сохраняться после upregulation наш подход, как он сохраняет элементы естественного регулирования, такие, как врожденное СНГ-регуляторных элементов. Появлением ТРИФОСФАТЫ/Cas опосредованной ген ориентация технологии значительно облегчит применение этой технологии в различных модельных системах.

Эффективным средством для изучения функции гена в животных моделях были генетический нокаут или трансгенных подходы. Однако выражение регулирование этих подходов дихотомических (вкл. / выкл.), не временных и таким образом не способен показывать полный функциональный спектр гена. Условное Cre/ЛОХП технологии позволили пространственно временных инактивации или активации функции гена, но их дихотомического характера по-прежнему представляют собой ограничения, например клетки летальности и необратимости1,2 , 3. для того чтобы заполнить этот пробел, условная нокдаун подходы были разработаны с использованием тет-индуцируемый или Мирна4регулируется. Однако пробить эффекты остаются предметом озабоченности для RNAi5 и сложно управлять в vivo. Совсем недавно представил более универсальный подход к достижению как вверх, так и Даунрегуляция экспрессии генов эндогенного и продемонстрировали их утилиты6,7 ТРИФОСФАТЫ/Cas опосредованной транскрипционный анализ управления технологии . Однако эффективность ТРИФОСФАТЫ/Cas опосредованной транскрипционный анализ управления пока остается неясным в естественных условиях и обратимости на основе краб репрессий остается быть видели, как сильный репрессии Краб и его взаимодействия протеина KAP1 было показано, чтобы побудить Постоянный ген глушителей8,9.
Для того, чтобы устранить эти ограничения, мы разработали Роман транскрипционный анализ нормативной системы, способной условно контроля экспрессии генов эндогенного в обратимое и перестраиваемые манере в мышах с помощью спроектирован прокариот двоичных транскрипционный анализ 10систем регулирования. Прокариот двоичные транскрипционный анализ систем регулирования с нормативной лигандами, таких как лак и тет, позволили такие обратимые и перестраиваемые выражение управления11,12,13, 14. Однако, неадекватной репрессий потенции текущего бинарных систем препятствует их широкое применение для контроля экспрессии генов эндогенного млекопитающих. Мы разработали систему репрессий расширенной лак достаточно мощным для репрессий эндогенного генов и занятых Роман стратегия ориентации на тет transcriptional активаторы непосредственно организатору родственных эндогенного гена для достижения надежные upregulation (рис. 1)10. С помощью этой технологии мы достигли почти на два порядка выражение управления эндогенного Dnmt1 гена в перестраиваемых, индуцибельной и обратимым образом10. Здесь мы предоставляем пошаговые инструкции для его в естественных условиях применения других генов и с помощью мыши как модель вида организмов.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59235/59235fig1.jpg"> Рисунок 1 : Обзор системы дистанционного управления. Транскрипции гена эндогенного целевой может регулироваться с помощью инженерных лак репрессор и тет активатор систем. Целевого гена промоутер или Интрон спроектирован, чтобы содержать операторы для жесткой привязки LacIGY репрессор или rtактиватор TA-м2. R означает Repron (Repэскадрон intrна), которая содержит 12 симметричных лак операторы (S) плюс Интрон бета globin частичного кролика. T обозначает оператор тет . Репрессор или активатор/выражаются из ткани конкретной промоутера. Экспрессия гена целевой затем быть обратимо настроены до уровня желаемой выражение администрацией IPTG (изопропиловый β-D-1-тиогалактопиранозид, антагонист LacIGY репрессор) или доксициклин (Dox). Эта цифра была изменена от Lee et al.10<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59235/59235fig1large.jpg" target="_blank">пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
Перед началом этого протокола, обзор Таблица 1 определить соответствующие шаги для желаемого контроля экспрессии генов. Например, инженер мыши, что позволяет реверсивные Даунрегуляция «Ген X», заполнить разделы 1, 3 и 4 ниже протокол. Также в таблице 1 приведены необходимые компоненты системы дистанционного управления.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Желаемый выражения изменения</td>
			<td>Репрессии только</td>
			<td>Активация только</td>
			<td>Репрессии и активации</td>
		</tr>
<tr>
<td>Соответствующие разделы протокола</td>
			<td>1, 3-4</td>
			<td>2-4</td>
			<td>1-4</td>
		</tr>
<tr>
<td>Пульт дистанционного управления последовательность в целевых генов</td>
			<td>Repron («Репрессии Интрон»; 12 симметричных лак операторы плюс Интрон бета globin частичное кролик)</td>
			<td>Тет грузовое</td>
			<td>Repron и тет грузовое</td>
		</tr>
<tr>
<td>Пульт дистанционного управления последовательность расположения</td>
			<td>Интрон</td>
			<td>Промоутер</td>
			<td>Интрон и промоутер</td>
		</tr>
<tr>
<td>Активатор/репрессор необходимые для требуемого элемента управления</td>
			<td>LacIGY репрессор</td>
			<td>Активатор rtTA м2</td>
			<td>LacIGY репрессор и активатор rtTA м2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Регулирования лигандами</td>
			<td>IPTG</td>
			<td>Доксициклин</td>
			<td>IPTG или доксициклин</td>
		</tr>
</tbody></table>Таблица 1: Обзор компонентов удаленного управления.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:715px;" width="715">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">B6C3F1/J</td>
			<td style="width:149px;">The Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:183px;">100010</td>
			<td style="width:167px;">https://www.jax.org/strain/100010</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cas9 Protein</td>
			<td style="width:149px;">PNA Bio</td>
			<td style="width:183px;">CP04</td>
			<td>http://www.pnabio.com/products/CRISPR_Cas9.htm?gclid=EAIaIQobChMIsoG8pLL33QIVBr7ACh0naQ4dEAAYAiAAEgKyHvD_BwE</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CRISPOR</td>
			<td>Haeussler et al. 2016</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td>http://crispor.tefor.net/</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Doxycycline-Containing Mouse Diet</td>
			<td style="width:149px;">Envigo</td>
			<td style="width:183px;">Varies by concentration</td>
			<td>https://www.envigo.com/products-services/teklad/laboratory-animal-diets/custom-research/doxycycline-diets/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ENCODE Database</td>
			<td style="width:149px;">Stanford University</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td>https://www.encodeproject.org/</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">iCre mRNA synthesis plasmid (pBBI)</td>
			<td style="width:149px;">Addgene</td>
			<td>65795</td>
			<td>https://www.addgene.org/65795/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">IPTG</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td style="width:183px;">I2481C</td>
			<td>https://www.goldbio.com/search?isSearch=Y&#38;q=iptg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">pGL3-Basic</td>
			<td style="width:149px;">Promega</td>
			<td style="width:183px;">E1751</td>
			<td>https://www.promega.com/products/reporter-assays-and-transfection/reporter-vectors-and-cell-lines/pgl3-luciferase-reporter-vectors/?catNum=E1751</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">SVM-BPfinder</td>
			<td style="width:149px;">Regulatory Genomics, Pompeu Fabra University</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td>http://regulatorygenomics.upf.edu/Software/SVM_BP/</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">TiProD: Tissue specific promoter Database</td>
			<td style="width:149px;">Department of Bioinformatics, UMG,&#160;University of G&#246;ttingen&#160;</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td>http://tiprod.bioinf.med.uni-goettingen.de</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">UCSC Genome Browser</td>
			<td style="width:149px;">University of California Santa Cruz</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td>https://genome.ucsc.edu/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo application of the remote-control system for the manipulation of endogenous gene expression

Здесь мы описываем протокол для реализации системы дистанционного управления (Reversible Manipulation of Transcription на Endogenous локусов), которая позволяет контролировать реверсивные и перестраиваемые выражение эндогенные гена интереса к жизни модели систем. Система дистанционного управления использует расширение лак репрессий и тет активации систем для достижения вниз - или upregulation целевых генов в рамках единой биологической системы. Жесткие репрессии может быть достигнуто с репрессор привязки сайтов гибко расположен далеко вниз по течению от сайта начало транскрипции, подавляя транскрипции удлинения. Надежные upregulation может быть достигнуто путем повышения транскрипции гена эндогенного ориентации тет transcriptional активаторы родственных промоутер. Этот элемент управления реверсивные и перестраиваемые выражение можно применять и неоднократно выведены в организмах. Потенции и универсальность системы, как показано для эндогенного Dnmt1 здесь, позволит более точно в естественных условиях функциональный анализ, позволяя расследования функции гена на различных уровнях выражение и путем тестирования обратимости фенотип.

Репрессии возможностей системы дистанционного управления до настоящего времени было продемонстрировано в два различных подхода. В первом подходе лак репрессор привязки сайтов были вставлены в эндогенного промоутер Dnmt1 гена. В втором подходе, который рекомендуется настоящим Протоколом, репрессор привязки сайтов были вставлены в нижнем Интрон чтобы избежать потенциального риска промоутер функции путем вставки и, таким образом, чтобы упростить применение дистанционного управления системы. Оба подхода привели к успешным репрессий (рис. 2A, B и Рисунок 3A-C)10. Dnmt1 выражение был репрессирован в 15% от нерегулируемого уровня, используя подход на основе промоутер (рисA). Это жесткие репрессии была обращена вспять в зависимости от дозы, рассматривая мышей с различным количеством IPTG (рисA). Наблюдаемые Dnmt1 репрессий был подтвержден на уровне белок иммуноокрашивания (рис. 2B). Мы не выявили каких-либо заметная разница в выражении Dnmt1 между Dnmt1+/ + и мышей Dnmt1Ло Лоу , подтверждающий, что наш оператор вставки лак не нарушается нормальный промоутер Функция10. Интрон-подход на основе достигнутого, более чем 90% репрессий от операторов расположен нескольких kilobases вниз по течению сайта начало транскрипции смягчающих транскрипции удлинение (рис. 3A, B)10. Далее этот подход на основе Интрон был апробирован на семь дополнительных надежных промоутеров (рис. 3C). Из всех протестированных промоутеров было достигнуто неизбежно жесткие репрессии. Было отмечено отсутствие корреляции между уровни остаточного выражения и сильные промоутеров, предполагая, что репрессии против нашей системы на основе Интрон репрессий превышает transcriptional потенции всех надежных промоутеров мы тестировали () Рисунок 3 C).
В естественных условиях upregulation возможностей системы дистанционного управления также была продемонстрирована на Dnmt1 ген. Мы ввели две копии оператора тет в Dnmt1 промоутер, вместе с лак оператор последовательности, чтобы позволить upregulation или Даунрегуляция, в зависимости от которых эффекторных присутствует белка. В ЭСК, содержащий измененные эндогенного Dnmt1 аллеля (Dnmt1LGT) (рис. 4A) были достигнуты надежная upregulation и Даунрегуляция Dnmt1 выражения, недалеко от двух порядков (10% до 650%),10 . Оба положения были полностью обратимо и индуцибельной IPTG и Dox обработками, соответственно (рис. 4A). Мы далее представил Dnmt1LGT изменения в мыши микрофлорой для тестирования в естественных условиях upregulation возможностей системы дистанционного управления. Сильный upregulation Dnmt1 было отмечено из печени, селезенки и почек, в то время как не обнаружено upregulation в самом сердце было отмечено (рис. 4B)7. Шаблон цикла клетки зависимой выражения Dnmt1 и нехватка пролиферативной клетки в сердце могут лежать в основе этого наблюдения10,56. Он по-прежнему следует рассматривать ли это ограничение можно преодолеть путем повышения уровня выражения активатора или количество своих сайтов связывания.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59235/59235fig2.jpg"> Рисунок 2 : В естественных условиях подавление Dnmt1 , репрессор LacIGY. (A) мышей с операторами лак (LO) вставляется в Dnmt1 промоутер, с или без выражения LacIGY, лечили различных доз IPTG. qRT ПЦР анализ экспрессии Dnmt1 показывает дозозависимый разворота Dnmt1 репрессий в естественных условиях IPTG лечения. Каждый бар представляет данные из различных мыши. Данные представляют собой среднее ± SEM (n = 3). (B) иммуноокрашивания Dnmt1 белка в толстой склепы мышей питьевой воды с или без 160 мм ИПТГ предусмотрено 3 недели. Эта цифра была изменена от Lee et al.10<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59235/59235fig2large.jpg" target="_blank">пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59235/59235fig3.jpg"> Рисунок 3 : В естественных условиях и в пробирке репрессии в отношении различных промоутеров системой дистанционного управления. (A) ранняя версия Repron последовательности (R *) был вставлен в Интрон вниз по течению Виллин промоутер в трансгенные мыши Виллин mKate2 (VilmKate2). qRT ПЦР-анализа выражения mKate2 в тонком кишечнике мышей с или без LacIGY репрессор показано. Каждый бар представляет данные из различных мыши. (B) конфокальной mKate2 образы тонкой кишки с и без LacIGY выражение. (C), шесть симметричных лак операторы (S) были вставлены между различными промоутеров и Люцифераза репортер. Репортеры (50 нг/хорошо в 96-луночных плиты) и плазмид репрессор были временно вводят в клетки NIH/3T3 в молярное соотношение 1:1. Люцифераза значения были начисленных 24 ч после transfection. Эти в пробирке данных представляют процент Люцифераза выражение в LacIGY-выражая клеток по отношению к тем выражая нефункциональные ЗСБН (NFlacI). T-тесты были использованы для определения статистической значимости. Данные представляют собой среднее ± SEM (n = 3). P ≤ 0,05, **P ≤ 0.01. Эта цифра была изменена от Lee et al.10<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59235/59235fig3large.jpg" target="_blank">пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59235/59235fig4.jpg"> Рисунок 4 : Вниз - и/или upregulation Dnmt1 выражения в vitro и in vivo. (A) полная система дистанционного управления был разработан в культивированный ЭСК гена ориентации и электропорации подходы. Максимальное подавление Dnmt1 выражения был достигнут без лечения, в то время как максимальная активации было достигнуто путем IPTG и Dox лечения. Данные представляют собой среднее ± SEM (n = 3). P ≤ 0,05, **P ≤ 0.01 (Уэлча t-тесты). (B) в естественных условиях Активация Dnmt1 пульт дистанционного управления системой, как это продемонстрировано иммуноокрашивания Dnmt1 белка в различных тканях от пульта дистанционного управления мышей. ЛГТ аллеля представляет промоутер модификации Dnmt1 содержать лак оператора и тет активатор привязки сайтов. Мышей относились с нормальным или Dox содержащих диеты (5000 мг/кг доксициклин гиклат) на один месяц. Эта цифра была изменена от Lee et al.10<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59235/59235fig4large.jpg" target="_blank">пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Supplementary Figure 1" src="/files/ftp_upload/59235/59235supfig1.jpg"> Дополнительные рисунок 1 : Пример посадки колодки вставки в мышиных Dnmt1 Интрон 1. (A) схема шаблона дна для посадки колодки вставки, адаптированный Quadros et al. (2015)31. Сайты гетеротипичной loxP , JT15 и Lox2272, разделенных последовательности коротких распорку (sp) и на каждой стороне в окружении 60-bp, гомологично к целевой области геномной ДНК. (B) образец ДНК шаблон для посадки колодки вставки в Интрон Dnmt1 , используя следующие sgRNA: CTAGTACCACTCCTGTACCG, (которая ориентирована стренги обратного). Выбранный регион intronic был bioinformatically, сообщил шагом 1.1, и sgRNA был определен с помощью CRISPOR29. (C) пример конструкции праймера PCR для оценки вставки посадки колодки. Праймеры PCR были разработаны за пределами гомологии герб шаблон для подтверждения интеграции эндогенного Dnmt1. Ампликон ПЦР wildtype-213 bp; После вставки, он становится 291 bp. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59235/59235supfig1large.jpg" target="_blank">пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about In vivo Application of the REMOTE-control System for the Manipulation of Endogenous Gene Expression at JoVE.com

In vivo Application of the REMOTE-control System for the Manipulation of Endogenous Gene Expression

В естественных условиях применение системы дистанционного управления для манипуляции эндогенного экспрессии генов

Этот протокол описывает шаги, необходимые для создания модели системы, в которой транскрипции эндогенного гена интереса может управляться условно в живых животных или клеток с использованием расширенной лак репрессор или тет активатор систем.

Here we describe a protocol for implementing the REMOTE-control system (Reversible Manipulation of Transcription at Endogenous loci), which allows for ...

Значение нашего метода заключается в его универсальности и потенции. Это позволяет исследователям иметь надежный контроль над эндогенной экспрессии генов таким образом, что были сложными для достижения с помощью существующих методов. Это позволяет исследователям исследовать функцию гена на различных уровнях экспрессии и в пространственно-временной манере.Таким образом, это позволяет проверить обратимость фенотипа, который полезен при изучении генов, связанных с болезнями. Для выполнения репрессий, целевой ген intron разработан, чтобы содержать репрон R, который содержит 12 симметричных операторов Lac. Когда репрессор LacIGY выражается из желаемой ткани конкретного промоутера, целевой ген подавляется.Репрессии в отношении гена-мишени могут быть обращены вспять или скорректированы до желаемого уровня экспрессии путем введения IPTG, антагониста репрессатора LacIGY. Для выполнения upregulation, целевой промоутер гена разработан, чтобы содержать четыре или более tat операторов, T, в качестве связывающих сайтов для активаторов rtTA-M2. Когда активатор выражается из желаемой ткани конкретных промоутер в присутствии доксициклина, upregulation целевого гена индуцируется.Upregulation гена цели можно обратить вспять или отрегулировать к пожеланную уровень выражения путем снимать или изменять концентрацию доксициклина. Для выполнения как репрессий, так и активации могут быть объединены системы репрессатора Lac и Tat. Чтобы изменить ген, представляющий интерес для репрессий, транскрипционно инертный интрон к пяти основных концах гена интереса должны быть определены для вставки репронной последовательности.Чтобы получить геномную последовательность для гена, представляющий интерес, перейдите в браузер генома UCSC и выберите последний проект генома мыши под вкладкой геномов. Введите имя или символ гена интереса в поле поиска, чтобы просмотреть стенограммы гена, а затем нажмите кнопку идти. Затем выберите желаемый вариант стенограммы для гена, представляющий интерес, и нажмите на символ гена рядом с вариантом интересной стенограммы.Далее, под последовательностью и ссылками на инструменты и базы данных баннер, нажмите на ссылку геномной последовательности. Для вариантов области поиска последовательности выберите только экзоны, интроны и по умолчанию одну запись FASTA на ген. Для вариантов форматирования последовательности, выберите exons в верхнем случае, все остальное в нижнем случае и маска повторяется n.Then, нажмите представить.Наконец, сохраните эту последовательность, сохранив форматирование верхнего и нижнего регистра в документе или программе, которые могут быть аннотированы. Чтобы избежать прерывания cpG островов, выберите шоу для cpG острова трек под выражением и регулирование баннера браузера генома UCSC и нажмите кнопку обновления. Масштабирование на пяти основных интронов, нажмите на каждом острове CpG показано зеленым цветом, и выберите вид ДНК для этой функции.После выбора маски повторяется N, нажмите получить ДНК, чтобы получить последовательность островов CpG. Наконец, наложить эти последовательности с исходным файлом последовательности, и аннотировать их как intronic регионов, чтобы избежать. Чтобы избежать intronic регионов с усилителем подписей в тканях, представляющих интерес, перейдите на базу данных ENCODE и выберите значок экспериментов.Для типа анализа выберите ChiP-seq или DNase-seq и заселите другие категории в соответствии с ячейками, которые должны быть спроектированы. После выбора функции выберите левую наиболее пиктограмму синим цветом, для которой отображается результат представления в списке. Затем выберите наборы данных для целей монометриляции h3k4, ацетилирования h3k27, DNase 1 и CTCF, которые наиболее тесно соответствовали ячейкам, которые должны быть спроектированы.В каждом соответствующем наборе данных прокрутите раздел файла, убедитесь, что выбраны mm10 и UCSC, и нажмите кнопку визуализации. Теперь, в браузере генома UCSC, увеличьте масштаб пяти основных интронов и нажмите на каждый пик в аннотированных пиковых треках. Получите последовательность ДНК для каждой пиковой области, нажав на хромосомные координаты для каждого пика.В меню высадки представления выберите ДНК и нажмите маску, чтобы N.Finally, наложить эти последовательности с исходным файлом последовательности и аннотировать их как intronic регионов, чтобы избежать. Чтобы определить sgRNA в остальных нетронных регионах с высокой специфичностью и прогнозируемыми показателями эффективности, перейдите на онлайн-инструмент проектирования sgRNA, такой как CRISPOR. Введите последовательность нетронной области интереса, укажите соответствующий эталонный геном и выберите нужный протопространственный смежный мотив.Затем нажмите представить. Далее, сортировать предсказал sgRNA по специфике оценка и выбрать один или несколько sgRNA, которые также имеют высокий прогнозируемый балл эффективности. Наконец, дизайн шаблона ДНК, содержащего последовательность посадочной площадки PITT, окруженную с обеих сторон 60-базовыми гомологическими руками, которые соответствуют участку разреза sgRNA.Для отмены целевых репрессий генов, управлять IPTG в питьевой воде гомозиготных выведенных мышей с модифицированным аллелью интереса путем полного растворения желаемого количества IPTG в стерильной дистиллированной воде в день введения. Оберните бутылку фольгой и ввемит воду IPTG в свет защищенную бутылку мышам соответствующего генотипа и элементы управления в течение по крайней мере одной недели. Приступайте к анализу экспрессии гена, представляющих интерес для ткани-мишени.Чтобы вызвать гена upregulation, управлять доксициклина в рационе в течение недели и приступить к анализу экспрессии гена интереса в целевой ткани. qRT PCR anaylisis показал, что выражение DNMT1 было подавлено до 15% нерегулируемых уровней, используя подход, основанный на промоутере. Репрессии были отменены в дозе зависимой образом, рассматривая мышей с различным количеством IPTG.Наблюдаемые репрессии DNMT1 и отмена репрессий DNMT1 с помощью лечения IPTG были подтверждены на уровне белка иммуностимулятором. QRT PCR анализ выражения mKate2 показал, что интрон-подход достиг более 90% репрессий со стороны операторов, расположенных на нескольких килобазах ниже по течению от места начала транскрипции путем ослабления удлинения транскрипции. Конфокальные изображения выражения mKate2 в небольшой интенсивности мышей с или без репрессора LacIGY подтвердили интрон-подход.В эмбриональных стволовых клетках, содержащих модифицированный эндогенный аллель DNMT1 с последовательностями оператора Tat и Lac, были достигнуты устойчивые upregulation и downregulation выражения DNMT1. Оба правила были полностью обратимыми и неудобоваемыми для лечения IPTG и Dox. Сильная upregulation DNMT1 наблюдалась от печеночной печени, селезенки, и почки.Тем не менее, не было отмечено upregulation в сердце не наблюдалось, предполагая, что клеточный цикл-зависимой модели выражения DMNT1 и нехватка пролиферативных клеток в сердце может лежать в основе этого наблюдения. Изучение функции in vivo критического гена путем манипулирования его экспрессией часто было сложной задачей из-за летальности. Наш метод позволил нам преодолеть смертельный фенотип для нашего гена интереса и позволил нам изучить его роль в tumorogenesis in vivo.Аналогичным образом, эта технология позволит изучить другие важные гены, которые были трудно изучать.

Research

JoVE Journal

Genetics

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

In Vitro Транскрипция Анализы и их применение в Drug Discovery

In vitro transcription assays have been developed and widely used for many years to study the molecular mechanisms involved in transcription. This process ...

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Генетическая Манипуляция растений Возбудитель<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; По изучению Грибковые биологии и растений микробных взаимодействий

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the ...

Inducible T7 RNA Polymerase-mediated Multigene Expression System, pMGX

Индуцируемая T7-РНК-полимераза-опосредованная мультигенная экспрессия, pMGX

Co-expression of multiple proteins is increasingly essential for synthetic biology, studying protein-protein complexes, and characterizing and harnessing ...

Controllable Ion Channel Expression through Inducible Transient Transfection

Управляемая Expression ионного канала через Индуцибельные временная трансфекция

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be ...

Studying Cell Cycle-regulated Gene Expression by Two Complementary Cell Synchronization Protocols

Изучение экспрессии генов, регулируемых клеточным циклом, двумя протоколами синхронизации комплементарных ячеек

The gene expression program of the cell cycle represents a critical step for understanding cell cycle-dependent processes and their role in diseases such ...

Production and Purification of Baculovirus for Gene Therapy Application

Производства и очистки бакуловирусы для применения генной терапии

Baculovirus has traditionally been used for the production of recombinant protein and vaccine. However, more recently, baculovirus is emerging as a ...

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

Манипуляция плоидности в Caenorhabditis elegans

Mechanisms that involve whole genome polyploidy play important roles in development and evolution; also, an abnormal generation of tetraploid cells has ...

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

Изучения корня микрофлора: извлечение данных бактериальных сообщества из почвы, ризосфере и корень Endosphere

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...

Manipulation of Gene Function in Mexican Cavefish

Манипуляции функции гена в мексиканской Cavefish

Cave animals provide a compelling system for investigating the evolutionary mechanisms and genetic bases underlying changes in numerous complex traits, ...

Efficient Transcriptionally Controlled Plasmid Expression System for Investigation of the Stability of mRNA Transcripts in Primary Alveolar Epithelial Cells

Эффективная транскрипционно контролируемая система выражения плазмида для исследования стабильности транскриптов мРНК в первичных альвеолярных эпителиальных клетках

Studying posttranscriptional regulation is fundamental to understanding the modulation of a given messenger RNA (mRNA) and its impact on cell homeostasis ...