Name: in vivo application of the remote-control system for the manipulation of endogenous gene expression
Uploaded: 2019-03-29T14:00:00
Duration: 8 min 54 s
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Agradecemos a la tarde el Dr. Heidi Scrable por su generosa donación de la construcción de gen lacI mamíferos (Mayo Clinic, Rochester, MN), Dr. Daniel Louvard (Instituto Curie, Paris, Francia) para que el promotor de bandido y el Dr. Laurie Jackson-Grusby (Hospital de niños, Boston, MA) por sus contribuciones a las primeras etapas de este desarrollo de la tecnología. Estamos agradecidos por la Dr. Nancy Wu y el Dr. Robert Maxson por su asistencia en la generación de los ratones transgénicos y knockout. Agradecemos a los miembros del laboratorio Laird de discusiones útiles y apoyo. Este trabajo fue financiado por los institutos nacionales de salud [R01 CA75090 DA030325 R01, CA157918 R01 y R01 CA212374 a P.W.L. y 1F31CA213897-01A1 a N.A.V.S].

PWL es miembro de la juntas asesora científica de AnchorDx y Progenity, Inc.

Un paso crítico y una limitación potencial del sistema de control remoto es el reto asociado con la inserción del represor o sitios de unión del activador sin afectar la expresión del gen objetivo. Nuestro enfoque de represión original, tal como se aplica al gen Dnmt1 , implicó la inserción de sitios de unión de represor lac dentro de regiones transcripcionalmente críticas de un promotor. Para reducir el riesgo de afectar la función de promotor y por lo tanto a mejorar la aplicabilidad general del sistema de control remoto, hemos desarrollado un enfoque basado en el intrón de la represión. La potencia de nuestro sistema mejorado lac permitió reprimir firmemente la transcripción de todos los promotores fuertes, probamos a operadores ubicados cientos a varias kilobases abajo de la transcripción Inicio sitios (figura 3A, C) 10. lo importante, los niveles de represión eran independientes de los puntos fuertes transcripcionales de los promotores (figura 3A – C)10. Esto sugiere que la capacidad de represión de nuestro sistema de represión basado en el intrón supera la fuerza transcripcional de los promotores de la prueba. En este enfoque basado en el intrón, es probable que la represión es mediada a través de la interferencia física entre dos componentes, el mecanismo de elongación de la transcripción y los represores lac del57. Este mecanismo de represión simple y la robustez demostrada del método basado en el intrón pueden representar este enfoque general aplicable a los organismos, tejidos y genes diferentes.
La regulación al alza por el sistema de control remoto requiere las secuencias de enlace transactivator en proximidad con el promotor del gene de la blanco, que entraña un riesgo de afectar la función de promotor. Sin embargo, encontramos que la posición de enlace de secuencias puede ser fuera de la región transcripcionalmente crítica. Dnmt1 y EF1α promotores fueron firme alza de operadores tet encuentra un par de cien bases aguas arriba de la transcripción Inicio sitios10. Esta restricción relajada reduce considerablemente la posibilidad de afectar la función de promotor de un gene de la blanco en ausencia del transactivator. Aumentar el número de enlace de secuencias o uso de transactivators más fuerte podría ayudar a reducir el riesgo al permitir upregulation de sitios más lejos de la página de inicio de transcripción.
Nuestro sistema de control remoto proporciona un elegante control del nivel, el momento y el lugar de la expresión de genes endógenos, lo que permite la reversibilidad de un fenotipo y las consecuencias de los niveles de expresión diferente, que no son fácilmente alcanzables por la prueba tecnologías actuales en vivo gene expresión de control. Es importante tener en cuenta que en la mayoría análisis de expresión del gene, incluido el nuestro, expresión valores representan la media de una población de células entre las que se puede encontrar una variación considerable. Esta heterogeneidad puede influir en procesos celulares de la toma de decisiones, como diferenciación o apoptosis58. Aunque es probable que la precisión de control de expresión del gene puede mejorarse aún más por circuito genético adicional ingeniería59, la potencia observada de nuestro actual sistema permitirá investigación útil de funciones de los genes en muchos contextos biológicos. Además, se espera un alto grado de especificidad de la blanco debido a la complejidad de las secuencias del operador, así como la gran distancia evolutiva entre los mamíferos y las especies originarias de los componentes regulatorios60. Además, líneas de ratón transgénico de represores y activadores pueden ser desarrolladas y empleadas para cualquier gen endógeno. Por ejemplo, se pueden adaptar modelos de ratón de transactivator de tet existentes para lograr la regulación al alza de un gene de la blanco en los tejidos de ratón deseado. Recientemente hemos desarrollado una línea transgénica que puede conducir robusta expresión tejido-específico de nuestro represor lac mayor en múltiples tipos de tejidos cuando se combina con líneas existentes de la Cre por introducción del gen lacIGY en el locus Hipp11 48 bajo el control de un elemento de Lox-parada-Lox (inédito). Esta línea facilitaría sustancialmente la aplicación de tejidos específicos del sistema de control remoto.
Upregulation de gene por el sistema de control remoto ofrece varias ventajas en comparación con el actuales enfoques transgénicos inducibles. No requiere generación de varias líneas transgénicas para probar efectos de posición de la inserción, ya que utiliza el locus endógeno. Además, este enfoque es adecuado para upregulation de los genes con expresión de base fuerte debido a aumenta la expresión de un promotor ya sólido, mientras que los modelos transgénicos dependen de promotores virales mínimas. Por último, el tejido especificidad, control del ciclo celular y que empalman la variantes de un gene de la blanco pueden conservarse al upregulation de nuestro enfoque, que conserva elementos de regulación natural como natural cis-elementos reguladores. El advenimiento de la tecnología de gene targeting CRISPR/Cas-mediada facilitan enormemente la aplicación de esta tecnología en sistemas de diversos modelos.

Knockout genético o enfoques transgénicos han sido medios eficaces para estudiar la función génica en modelos animales. Sin embargo, la regulación de la expresión de estos enfoques es dicotómica (encendido/apagado), no temporal y así no es capaz de revelar el espectro funcional completado de un gen. Condicional Cre/LoxP tecnologías han permitido spatio-temporal inactivación o activación de funciones de los genes, pero su naturaleza dicotómica continúa planteando limitaciones, tales como la mortalidad celular irreversible y1,2 , 3. con el fin de llenar este vacío, condicional precipitación se han desarrollado con tet-regulado shRNA o miRNA4. Sin embargo, los efectos off-target siguen siendo una preocupación para RNAi5 y difíciles de controlar en vivo. Más recientemente, CRISPR/Cas-mediada por tecnologías de control transcripcional han introducido un enfoque más versátil para lograr tanto arriba y desregulación de la expresión génica endógena y demostró sus utilidades6,7 . Sin embargo, la efectividad del control transcripcional CRISPR/Cas-mediada aún es confusa en vivo y la reversibilidad de la basado en KRAB represión queda vista, fuerte represión por parte de KRAB y sus proteínas interactuantes KAP1 ha demostrado inducir 8,9el silenciamiento del gen permanente.
Para hacer frente a estas limitaciones, hemos desarrollado un novedoso sistema de regulación transcripcional capaz de controlar condicionalmente la expresión de genes endógenos en un reversible y manera armonioso en ratones mediante ingeniería transcripcional procariota binario sistemas de regulación10. Procariotas sistemas de regulación transcripcionales binario con ligandos reguladoras, como la lac y tet, han permitido tal reversible y armoniosa expresión control11,12,13, 14. sin embargo, la potencia de represión inadecuada de los sistemas binarios actuales ha impedido su adopción amplia para controlar la expresión de genes endógenos en mamíferos. Hemos desarrollado un sistema de represión de lac mejorado suficientemente potente para la represión de genes endógenos y empleó una nueva estrategia de focalización activadores transcripcionales tet directamente al cognado promotor de un gen endógeno para lograr upregulation robusta (figura 1)10. Con esta tecnología, hemos conseguido casi dos órdenes de magnitud control de expresión del gen Dnmt1 endógeno en un armonioso, inducible y reversible de manera10. Aquí proporcionamos instrucciones detalladas para su aplicación en vivo a otros genes y organismos usando ratones como especie modelo.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59235/59235fig1.jpg"> Figura 1 : Resumen del sistema de control remoto. La transcripción de un gen endógeno objetivo puede regularse utilizando ingeniería lac represor y tet activador sistemas. El promotor del gen blanco o intrón está diseñado para contener operadores para el represor de LacIGY apretado-que atan o rtactivador TA-M2. R indica Repron (Represión intron), que contiene 12 operadores lac simétrico (S) además un intron de beta-globina conejo parcial. T indica el operador de TTE . El represor o activador está/se expresan de un promotor específico de tejido. La expresión del gen objetivo puede entonces reversible ajustarse al nivel deseado de la expresión administración de IPTG (Isopropil β-D-1-tiogalactopiranósido, un antagonista del LacIGY represor) o doxiciclina (Dox). Esta figura ha sido modificada de Lee et al.10<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59235/59235fig1large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Antes de iniciar este protocolo, revisar cuadro 1 para identificar las medidas pertinentes para el control deseado de la expresión génica. Por ejemplo, para diseñar un ratón que permite reversible downregulation de "Gen X", complete las secciones 1, 3 y 4 del siguiente protocolo. También, la tabla 1 resume los componentes necesarios del sistema de control remoto.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Cambio de expresión deseada</td>
			<td>Represión sólo</td>
			<td>Activación sólo</td>
			<td>Activación y represión</td>
		</tr>
<tr>
<td>Secciones pertinentes del Protocolo de</td>
			<td>1, 3-4</td>
			<td>2-4</td>
			<td>1-4</td>
		</tr>
<tr>
<td>Secuencia de control remoto en Gene de la blanco</td>
			<td>Repron ("Intrón de represión"; 12 operadores lac simétrica más un intrón de beta-globina conejo parcial)</td>
			<td>Operadores de Tet</td>
			<td>Operadores Repron y Tet</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ubicación de la secuencia de control remoto</td>
			<td>Intrón</td>
			<td>Promotor</td>
			<td>Intrón y promotor</td>
		</tr>
<tr>
<td>Activador/represor necesario para el Control deseado</td>
			<td>LacIGY represor</td>
			<td>Activador de rtTA M2</td>
			<td>LacIGY represor y activador rtTA M2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ligandos reglamentarios</td>
			<td>IPTG</td>
			<td>Doxiciclina</td>
			<td>IPTG o doxiciclina</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1: Resumen de componentes de control remoto.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:715px;" width="715">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">B6C3F1/J</td>
			<td style="width:149px;">The Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:183px;">100010</td>
			<td style="width:167px;">https://www.jax.org/strain/100010</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cas9 Protein</td>
			<td style="width:149px;">PNA Bio</td>
			<td style="width:183px;">CP04</td>
			<td>http://www.pnabio.com/products/CRISPR_Cas9.htm?gclid=EAIaIQobChMIsoG8pLL33QIVBr7ACh0naQ4dEAAYAiAAEgKyHvD_BwE</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CRISPOR</td>
			<td>Haeussler et al. 2016</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td>http://crispor.tefor.net/</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Doxycycline-Containing Mouse Diet</td>
			<td style="width:149px;">Envigo</td>
			<td style="width:183px;">Varies by concentration</td>
			<td>https://www.envigo.com/products-services/teklad/laboratory-animal-diets/custom-research/doxycycline-diets/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ENCODE Database</td>
			<td style="width:149px;">Stanford University</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td>https://www.encodeproject.org/</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">iCre mRNA synthesis plasmid (pBBI)</td>
			<td style="width:149px;">Addgene</td>
			<td>65795</td>
			<td>https://www.addgene.org/65795/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">IPTG</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td style="width:183px;">I2481C</td>
			<td>https://www.goldbio.com/search?isSearch=Y&#38;q=iptg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">pGL3-Basic</td>
			<td style="width:149px;">Promega</td>
			<td style="width:183px;">E1751</td>
			<td>https://www.promega.com/products/reporter-assays-and-transfection/reporter-vectors-and-cell-lines/pgl3-luciferase-reporter-vectors/?catNum=E1751</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">SVM-BPfinder</td>
			<td style="width:149px;">Regulatory Genomics, Pompeu Fabra University</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td>http://regulatorygenomics.upf.edu/Software/SVM_BP/</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">TiProD: Tissue specific promoter Database</td>
			<td style="width:149px;">Department of Bioinformatics, UMG,&#160;University of G&#246;ttingen&#160;</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td>http://tiprod.bioinf.med.uni-goettingen.de</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">UCSC Genome Browser</td>
			<td style="width:149px;">University of California Santa Cruz</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td>https://genome.ucsc.edu/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo application of the remote-control system for the manipulation of endogenous gene expression

Aquí se describe un protocolo para la implantación del sistema de control remoto (Reversible Manipulation of Transcription en Endogenous loci), que permite para el control de la expresión reversibles y regulables de un gen endógeno de interés en la vida del modelo de sistemas. El sistema de control remoto emplea sistemas de activación de mejorada lac de la represión y tet para lograr abajo - o regulación al alza de un gene de la blanco dentro de un sistema biológico único. Represión apretado puede lograrse de flexible encuentra sitios de unión del represor lejos río abajo de un sitio de inicio de transcripción por inhibición de la elongación de la transcripción. Upregulation robusto puede lograrse incrementando la transcripción de un gen endógeno dirigiéndose a activadores transcripcionales de tet al promotor cognado. Este control reversible y armoniosa expresión pueda ser aplicado y retirado varias veces en los organismos. La potencia y la versatilidad del sistema, según lo demostrado por endógeno Dnmt1 , permitirá más precisos análisis funcionales in vivo permitiendo la investigación de funciones de los genes en los distintos niveles de expresión y por la prueba de la reversibilidad de un fenotipo.

La capacidad de represión del sistema de control remoto ha sido demostrada hasta ahora en dos enfoques diferentes. En el primer enfoque, sitios de unión del represor lac fueron insertados en el endógeno promotor del gen Dnmt1 . En el segundo enfoque, que es recomendado por este protocolo, los sitios de unión del represor fueron insertados en un intrón aguas abajo para evitar el riesgo potencial de afectar la función de promotor de la inserción y de tal modo para simplificar la aplicación del control remoto sistema. Ambos enfoques dio lugar a la represión exitosa (figura 2A, B y Figura 3A-C)10. Dnmt1 expresión fue reprimida al 15% de los niveles no regulados mediante el enfoque basado en el promotor (figura 2A). Esta represión apretada se revirtió de forma dosis-dependiente por el tratamiento de ratones con cantidades variables de IPTG (figura 2A). La represión de Dnmt1 observada fue validada en el nivel de proteína immunostaining (figura 2B). No observamos ninguna diferencia notable en expresión de Dnmt1 entre Dnmt1+ + y Dnmt1LO/LO ratones, confirmando que nuestra inserción de operador lac había interrumpido no promotor normal función10. El enfoque basado en el intrón alcanzadas más de represión del 90% de los operadores situados aguas abajo de varios kilobases del sitio de inicio de transcripción atenuando transcripción elongación (figura 3A, B)10. Este enfoque basado en el intrón fue validado otros siete promotores robustos adicionales (figura 3C). Represión invariablemente apretada logró de todos los promotores probados. No observó ninguna correlación entre los niveles de expresión residual y los puntos fuertes de los promotores, lo que sugiere que la capacidad de represión de nuestro sistema de represión basado en intrón supera la potencia transcripcional de todos los promotores robustos que hemos probado () Figura 3 C).
La capacidad de regulación al alza en vivo del sistema de control remoto también fue demostrada en el gen Dnmt1 . Presentamos dos copias del operador tet en el promotor de Dnmt1 , junto con secuencias de operador lac , para permitir el upregulation o regulación a la baja dependiendo de cual efectoras proteína está presente. Upregulation robusto y desregulación de la expresión de Dnmt1 , cerca de dos órdenes de magnitud (10 a 650%), fueron alcanzados en CES que contiene el alelo modificado de Dnmt1 endógeno (Dnmt1LGT) (figura 4A)10 . Ambas normas fueron completamente reversibles e inducible por tratamientos de IPTG y Dox, respectivamente (figura 4A). A continuación presentamos la modificación de Dnmt1LGT en la línea germinal de ratón para poner a prueba la capacidad de regulación al alza en vivo del sistema de control remoto. Fuerte regulación al alza de Dnmt1 se observó desde el hígado, bazo y riñón, mientras que ningún upregulation detectable en el corazón se observó (figura 4B)7. El patrón de expresión dependiente de ciclo celular de Dnmt1 y la escasez de las células proliferativas en el corazón pueden ser la base de esta observación10,56. Queda por verse si esta limitación se puede superar aumentando el nivel de expresión del activador o el número de sus sitios de Unión.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59235/59235fig2.jpg"> Figura 2 : En vivo represión de Dnmt1 por el represor LacIGY. Ratones (A) con los operadores lac (LO) insertados en el promotor de Dnmt1 , con o sin expresión de LacIGY, fueron tratados con diversas dosis de IPTG. Análisis de expresión de Dnmt1 qRT-PCR muestran la inversión dependiente de la dosis de represión Dnmt1 en vivo por tratamiento de IPTG. Cada barra representa los datos de un ratón diferente. Los datos representan la media ± SEM (n = 3). (B) Immunostaining de proteína Dnmt1 en las criptas colónicas de ratones proporcionó agua potable con o sin 160 mM IPTG durante 3 semanas. Esta figura ha sido modificada de Lee et al.10<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59235/59235fig2large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59235/59235fig3.jpg"> Figura 3 : En vivo y represión en vitro de diversos promotores por el sistema de control remoto. (A) una primera versión de la secuencia de Repron (R *) fue insertado en un intrón aguas abajo del promotor bandido en un ratón transgénico de bandido-mKate2 (VilmKate2). se muestran el análisis de expresión de mKate2 en el intestino de los ratones con o sin el represor LacIGY qRT-PCR. Cada barra representa los datos de un ratón diferente. (B) mKate2 Confocal imágenes del intestino delgado con y sin expresión de LacIGY . Seis operadores de lac simétrico (C) (S) fueron insertados entre varios promotores y un reportero de luciferasa. Plásmidos de represor y Reporteros (50 ng/bien en placa de 96 pocillos) transitoriamente se introdujeron en las células NIH/3T3 en una proporción molar 1:1. Valores de luciferasa fueron evaluado 24 h después de transfección. Estos in vitro datos representan el porcentaje de expresión de luciferasa en LacIGY-expresar las células en relación a los que no funcional LacI (NFlacI). Se utilizaron pruebas T para determinar la significación estadística. Los datos representan la media ± SEM (n = 3). P ≤ 0.05, **P ≤ 0.01. Esta figura ha sido modificada de Lee et al.10<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59235/59235fig3large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59235/59235fig4.jpg"> Figura 4 : Abajo - o upregulation de Dnmt1 expresión in vitro e in vivo. (A) el sistema de control remoto completo fue diseñado en CES cultivadas por gene targeting y electroporación enfoques. Máxima represión de Dnmt1 expresión fue alcanzada con ningún tratamiento mientras que la activación máxima fue alcanzada por el tratamiento de IPTG y Dox. Los datos representan la media ± SEM (n = 3). P ≤ 0.05, **P ≤ 0.01 (de Welch t-tests). (B) activación In vivo de Dnmt1 por el sistema de control remoto, según lo demostrado por inmunotinción de proteína Dnmt1 en varios tejidos de los ratones de control remoto. El alelo de la LGT representa modificación promotor de Dnmt1 contienen sitios de unión de activador de operador y tet de lac . Ratones fueron tratados con una dieta normal o con Dox (Doxiciclina hiclato de 5000 mg/kg) durante un mes. Esta figura ha sido modificada de Lee et al.10<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59235/59235fig4large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Supplementary Figure 1" src="/files/ftp_upload/59235/59235supfig1.jpg"> Figura 1 complementaria : Ejemplo de inserción de cojín del aterrizaje en murino Dnmt1 del intrón 1. (A) esquema de plantilla de la DNA para el aterrizaje de la inserción de cojín, adaptado de Quadros et al., (2015)31. Heterotípicos loxP sitios, JT15 y Lox2272, están separados por una secuencia de espaciador corto (sp) y flanqueados a cada lado por 60-bp de DNA que es homólogo a la región genómica de destino. (B) muestra ADN plantilla para inserción de cojín del aterrizaje en el intrón Dnmt1 usando lo sgRNA siguiente: CTAGTACCACTCCTGTACCG (que apunta a la hebra de atrás). La región intronic seleccionada fue bioinformatically por paso 1.1, y el sgRNA fue identificada usando CRISPOR29. (C) ejemplo de diseño de la cartilla PCR para evaluar la inserción de la plataforma de aterrizaje. Cebadores PCR fueron diseñados fuera de los brazos de la homología de la plantilla para confirmar la integración endógena Dnmt1. El amplicon PCR de tipo salvaje es 213 bp; al insertar, se convierte en 291 BP <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59235/59235supfig1large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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In vivo Application of the REMOTE-control System for the Manipulation of Endogenous Gene Expression

Aplicación in vivo del sistema de control remoto para la manipulación de genes endógenos

Este protocolo describe los pasos necesarios para generar un modelo de sistema en que se puede regular la transcripción de un gen endógeno de interés condicional en animales vivos o células con mayor lac represor y tet activador de sistemas.

Here we describe a protocol for implementing the REMOTE-control system (Reversible Manipulation of Transcription at Endogenous loci), which allows for ...

La importancia de nuestro método es su versatilidad y potencia. Permite a los investigadores tener un control robusto sobre la expresión génica endógena de maneras que han sido difíciles de lograr utilizando los métodos existentes. Permite a los investigadores investigar la función de un gen en varios niveles de expresión y de manera espacio-temporal.Por lo tanto, permite probar la reversibilidad de un fenotipo, que es útil cuando se estudian genes relacionados con la enfermedad. Para lograr la represión, el gen objetivo intrón está diseñado para contener repron R, que contiene 12 operadores lac simétricos. Cuando el represor LacIGY se expresa desde el promotor específico del tejido deseado, el gen objetivo se reprime.La represión del gen objetivo puede revertirse o ajustarse al nivel de expresión deseado mediante la administración de IPTG, un antagonista del represor LacIGY. Para lograr la regulación, el promotor del gen objetivo está diseñado para contener cuatro o más operadores de Tat, T, como sitios de unión para los activadores rtTA-M2. Cuando el activador se expresa desde el promotor específico del tejido deseado en presencia de doxiciclina, se induce la regulación ascendente del gen objetivo.La regulación del gen objetivo se puede invertir o ajustar al nivel de expresión deseado retirando o alterando la concentración de doxiciclina. Para lograr tanto la represión como la activación, se pueden combinar los sistemas de represor Lac y Activador Tat. Para modificar el gen de interés para la represión, se debe identificar un intrón transcripcionalmente inerte hacia el extremo cinco del gen de interés para la inserción de la secuencia de repron.Para obtener la secuencia genómica del gen de interés, vaya al navegador del genoma de la UCSC y seleccione el último borrador del genoma del ratón en la pestaña Genomas. Introduzca el nombre o símbolo del gen de interés en la barra de búsqueda para ver las transcripciones del gen y, a continuación, haga clic en ir. A continuación, seleccione la variante de transcripción deseada para el gen de interés y haga clic en el símbolo genético junto a la variante de transcripción de interés.A continuación, en el banner de secuencia y vínculos a herramientas y bases de datos, haga clic en el vínculo de secuencia genómica. Para las opciones de región de recuperación de secuencia, seleccione solo exones, intrones y el registro FASTA predeterminado por gen. Para las opciones de formato de secuenciación, seleccione exones en mayúsculas, todo lo demás en minúsculas y la máscara se repite en N.Then, haga clic en Enviar.Por último, guarde esta secuencia, conservando el formato en mayúsculas y minúsculas en un documento o programa que se puede anotar. Para evitar la interrupción de las islas CpG, seleccione show para la pista de islas CpG bajo el banner de expresión y regulación del navegador del genoma UCSC y haga clic en refresh. Acercar los cinco intrones primos, haga clic en cada isla CpG que se muestra en verde y seleccione ver EL ADN para esta característica.Después de seleccionar las repeticiones de máscara a N, haga clic en obtener ADN para obtener la secuencia de islas CpG. Por último, superponga estas secuencias con el archivo de secuencia original y anote estas como regiones intrónicas que se deben evitar. Para evitar regiones intrónicas con firmas potenciadoras en los tejidos de interés, vaya a la base de datos ENCODE y seleccione el icono de experimentos.Para el tipo de ensayo, seleccione ChiP-seq o DNase-seq y rellene las otras categorías según las celdas que se van a diseñar. Después de la selección de la operación, seleccione el pictograma más a la izquierda en azul, para el que aparece la vista de los resultados como lista. A continuación, seleccione los conjuntos de datos para los objetivos de la monometilación h3k4, la acetilación h3k27, DNase 1 y CTCF que más se ajustan a las celdas que se van a diseñar.Dentro de cada conjunto de datos relevante, desplácese a la sección del archivo, verifique que los mm10 y UCSC estén seleccionados, y haga clic el botón visualizar. Ahora, en el navegador del genoma UCSC, haga zoom en los cinco intrones primos y haga clic en cada pico en las pistas de pico anotadas. Obtenga la secuencia de ADN para cada región de pico haciendo clic en las coordenadas cromosómicas para cada pico.En el menú desplegable de la vista, seleccione ADN y haga clic en máscaras repetidas en N.Finalmente, superponga estas secuencias con el archivo de secuencia original y anote estas como regiones intrónicas para evitarlas. Para identificar un sgRNA en las regiones intrínsecos restantes con alta especificidad y puntuaciones de eficiencia previstas, navegue a una herramienta de diseño de SGRNA en línea de su elección, como CRISPOR. Introduzca la secuencia de la región intrónica de interés, especifique el genoma de referencia relevante y seleccione el motivo adyacente del protoespacial.A continuación, haga clic en Enviar. A continuación, ordene la puntuación de especificidad de sgRNA pronosticada y seleccione una o más sgRNA que también tengan una puntuación de eficiencia pronosticada alta. Por último, diseñe una plantilla de ADN que contenga una secuencia de almohadilla de aterrizaje PITT flanqueada en ambos lados por brazos homológicos de 60 bases que correspondan al sitio de corte sgRNA.Para la reversión de la represión genética objetivo, administre IPTG en el agua potable de los ratones criados homocigotos con el alelo modificado de interés disolviendo completamente la cantidad deseada de IPTG en agua destilada estéril el día de la administración. Envuelva el frasco con papel de aluminio y administre el agua IPTG en una botella ligera protegida a los ratones del genotipo y controles apropiados durante al menos una semana. Proceder a analizar la expresión del gen de interés en el tejido objetivo.Para inducir la regulación del gen, administre la doxiciclina en la dieta durante una semana y proceda a analizar la expresión del gen de interés en el tejido objetivo. qRT PCR anaylisis demostró que la expresión DNMT1 fue reprimida al 15% de los niveles no regulados utilizando el enfoque basado en el promotor. La represión se revirtió de manera dependiente de la dosis mediante el tratamiento de ratones con cantidades variables de IPTG.La represión DNMT1 observada y la reversión de la represión DNMT1 por el tratamiento con IPTG se validaron a nivel proteico mediante inmunosumanidad. el análisis pcR qRT de la expresión mKate2 mostró que el enfoque basado en intrón logró más del 90% de la represión de los operadores ubicados varias kilobases aguas abajo del sitio de inicio de la transcripción al atenuar el alargamiento de la transcripción. Las imágenes confocales de la expresión mKate2 en la pequeña intenstina de los ratones con o sin el represor LacIGY validaron el enfoque basado en intrón.La fuerte regulación y regulación de la expresión DNMT1 se lograron en células madre embrionarias que contenían el alelo endógeno modificado DNMT1 con secuencias de operadores Tat y Lac. Ambas regulaciones fueron totalmente reversibles e inducibles mediante tratamientos IPTG y Dox. Se observó una fuerte regulación de DNMT1 desde el hígado, el bazo y el riñón.Sin embargo, no se observó una regulación ascendente detectable en el corazón, lo que sugiere que el patrón de expresión dependiente del ciclo celular de DMNT1 y la escasez de células proliferativas en el corazón pueden subyaver esta observación. Estudiar la función in vivo de un gen crítico manipulando su expresión a menudo ha sido un desafío debido a la letalidad. Nuestro método nos permitió superar el fenotipo letal para nuestro gen de interés y nos permitió estudiar su papel en la tumorogénesis in vivo.Del mismo modo, esta tecnología permitirá la investigación de otros genes esenciales que han sido difíciles de estudiar.

Research

JoVE Journal

Genetics

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

Los ensayos in vitro de transcripción y su aplicación en el descubrimiento de medicamentos

In vitro transcription assays have been developed and widely used for many years to study the molecular mechanisms involved in transcription. This process ...

Investigación

Genética

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

La manipulación genética del patógeno de la planta<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; Estudiar biología de hongos y plantas Microbe Interactions

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the ...

Inducible T7 RNA Polymerase-mediated Multigene Expression System, pMGX

Inducible T7 RNA polimerasa mediada Multigene Expression System, pMGX

Co-expression of multiple proteins is increasingly essential for synthetic biology, studying protein-protein complexes, and characterizing and harnessing ...

Controllable Ion Channel Expression through Inducible Transient Transfection

Expresión Ion Channel controlable a través de la transfección transitoria inducible

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be ...

Studying Cell Cycle-regulated Gene Expression by Two Complementary Cell Synchronization Protocols

Estudio de la expresión genética regulada por el ciclo celular mediante dos protocolos complementarios de sincronización celular

The gene expression program of the cell cycle represents a critical step for understanding cell cycle-dependent processes and their role in diseases such ...

Production and Purification of Baculovirus for Gene Therapy Application

Producción y purificación de Baculovirus para la aplicación de la terapia génica

Baculovirus has traditionally been used for the production of recombinant protein and vaccine. However, more recently, baculovirus is emerging as a ...

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

Manipulación de ploidía en Caenorhabditis elegans

Mechanisms that involve whole genome polyploidy play important roles in development and evolution; also, an abnormal generation of tetraploid cells has ...

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

Explorar el microbioma de la raíz: extracción de datos de la comunidad bacteriana del suelo, rizosfera y raíz Endosphere

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...

Manipulation of Gene Function in Mexican Cavefish

Manipulación de la función del Gene en mexicano Cavefish

Cave animals provide a compelling system for investigating the evolutionary mechanisms and genetic bases underlying changes in numerous complex traits, ...

Efficient Transcriptionally Controlled Plasmid Expression System for Investigation of the Stability of mRNA Transcripts in Primary Alveolar Epithelial Cells

Sistema eficiente de expresión de plásmido controlado por transcripción para la investigación de la estabilidad de las transcripciones de ARNm en células epiteliales alveolares primarias

Studying posttranscriptional regulation is fundamental to understanding the modulation of a given messenger RNA (mRNA) and its impact on cell homeostasis ...