Name: in vivo application of the remote-control system for the manipulation of endogenous gene expression
Uploaded: 2019-03-29T14:00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In vivo Application of the REMOTE-control System for the Manipulation of Endogenous Gene Expression at JoVE.com

Vi tackar den sena Dr Heidi Scrable för hennes generösa gåva på den däggdjur lacI gen konstruktion (Mayo Clinic, Rochester, MN), Dr Daniel Louvard (Institut Curie, Paris, Frankrike) för att tillhandahålla Promotorn Villin och Dr Laurie Jackson-Grusby (Children's Hospital, Boston, MA) för hennes bidrag till de tidiga stadierna av denna teknikutveckling. Vi är tacksamma för Dr Nancy Wu och Dr Robert Maxson för deras hjälp generera de transgena och knockout-möss. Vi tacka medlemmarna i Laird laboratoriet för bra diskussioner och stöd. Detta arbete stöds av National Institutes of Health [R01 CA75090, R01 DA030325, R01 CA157918 och R01 CA212374 till P.W.L. och 1F31CA213897-01A1 till N.A.V.S].

PWL serverar på den vetenskapliga rådgivande brädor av AnchorDx och Progenity, Inc.

Ett kritiskt steg och potentiell begränsning av fjärrkontroll systemet är den utmaning som är associerad med insättningspunkten repressor eller aktivator bindande platser utan att påverka mål genuttryck. Vår ursprungliga förtryck strategi, involverade som tillämpas för genen Dnmt1 , införande av lac repressor bindande platser inom transcriptionally kritiska regioner i en promotor. För att minska risken som påverkar arrangören funktion och därigenom förbättra den allmänna tillämpligheten av fjärrkontroll systemet, vi utvecklat betraktelsesätt intron-baserade förtryck. Styrkan av vår förbättrade lac systemet tillät oss att tätt förtränga transkriptionen av alla starka tillskyndarna vi testat på operatörer som ligger hundratals till flera kilobases nedströms av transkriptionen starta platser (figur 3A – C) 10. allt förtryck var oberoende av transkriptionell styrkorna av de projektansvariga (figur 3A – C)10. Detta tyder på att förtryck kapaciteten hos våra intron-baserade förtryck systemet överskrider testade initiativtagarna transkriptionell styrka. I detta intron-baserat tillvägagångssätt är det sannolikt att förtrycket medieras genom fysiska störningar mellan två komponenter, transkription töjning maskinen och den lac kvinnoförtryckarna57. Denna enkla förtryck mekanism och påvisade robustheten av intron-baserade metoden kan göra detta tillvägagångssätt allmänt tillämpliga på olika gener, vävnader och organismer.
Uppreglering av fjärrkontroll systemet kräver transactivator bindande sekvenser att vara i närheten av promotorn mål genen, som medför risk för påverkar arrangören funktion. Vi fann dock att placeringen av bindande sekvenser kan vara utanför regionen transcriptionally kritiska. Både Dnmt1 och EF1α initiativtagare var kraftigt uppreglerad från tet aktörer ligger ett par hundra baser uppströms av transkription start platser10. Här avslappnad villkoret minskar chansen påverka arrangören funktion av en målgenen i avsaknad av transactivator. Öka antalet bindande sekvenser och/eller användningen av starkare transactivators kunde hjälpa till att ytterligare minska risken genom att aktivera uppreglering från platser längre bort från webbplatsen transkription start.
Vår fjärrkontroll systemet ger eleganta kontroll av nivå, tidpunkten och platsen för endogena genuttryck, möjliggör testning reversibiliteten av en fenotyp och följderna av olika uttryck nivåer, som inte lätt kan uppnås genom aktuella i vivo gen uttryck-control teknik. Det är viktigt att notera att i de flesta gen uttryck analyser, inklusive vår, uttryckets värden representerar i genomsnitt en population av celler bland vilka betydande variation kan hittas. Denna heterogenitet kan påverka cellulära beslutsprocesser, såsom differentiering eller apoptos58. Även om precisionen i gen uttryck kontroll kunde sannolikt ytterligare förbättras genom ytterligare genetiska krets engineering59, gör observerade styrkan av vårt nuvarande system att användbar undersökning av geners funktion i många biologiska sammanhang. Dessutom förväntas en hög grad av målet specificitet på grund av komplexiteten av operatören sekvenser samt stora evolutionära avståndet mellan däggdjur och de ursprungliga arterna av reglerande komponenter60. Transgena möss rader kvinnoförtryckarna och aktivatorer kan dessutom utvecklas och anställd för någon endogena gen. Till exempel kan befintliga tet transactivator musmodeller anpassas för att åstadkomma uppreglering av en målgenen i önskad mus vävnader. Vi har nyligen utvecklat en transgena linje som kan köra robust vävnad-specifika uttryck för vår förbättrade lac repressor i flera vävnadstyper när de kombineras med befintliga Cre linjer genom att införa den lacIGY genen i det Hipp11 locus48 under kontroll av ett Lox-STOP-Lox element (opublicerade). Denna linje skulle väsentligt underlätta vävnadsspecifika tillämpningen av systemets fjärrkontroll.
Gen uppreglering av fjärrkontroll systemet ger flera fördelar jämfört med nuvarande inducerbara transgena metoder. Det kräver inte generation av flera transgena linjerna att testa för position effekter av införande, eftersom det använder det endogena locus. Dessutom, är detta tillvägagångssätt väl lämpad för uppreglering av gener med stark baslinjen uttryck eftersom det förbättrar uttryck från en redan robusta Promotorn, medan konventionella transgena modeller förlitar sig på minimal viral initiativtagare. Slutligen, vävnaden specificitet, cellcykeln kontroll och skarvning varianter av en målgenen får behållas vid uppreglering av vår strategi, eftersom det bevarar element av naturliga förordning såsom medfödda cis-reglerande element. Tillkomsten av CRISPR/Cas-medierad gen-inriktning teknik kommer kraftigt att underlätta tillämpningen av denna teknik i olika modellsystem.

Genetiska knockout eller transgena metoder har varit effektiva medel för att studera geners funktion i djurmodeller. Dock uttryck förordning av dessa synsätt är dikotoma (på/av), icke-temporal, och således är inte kapabel att avslöja kompletta funktionella spectrumen av en gen. Villkorliga Cre/LoxP technologies har tillåtit plats och tid inaktivering eller aktivering av geners funktion, men deras dikotomiska naturen fortsätter att utgöra begränsningar, till exempel cell dödlighet och oåterkallelig1,2 , 3. för att fylla detta tomrum, villkorlig knockdown metoder har utvecklats med hjälp av tet-reglerade shRNA eller miRNA4. Men off-target effekter förbli en angelägenhet för RNAi5 och har varit en utmaning för att styra i vivo. Mer nyligen, CRISPR/Cas-medierad transkriptionell-control teknik har infört en mer mångsidig strategi för att uppnå både upp- och nedreglering av endogena genuttryck och visat deras verktyg6,7 . Dock effektiviteten i CRISPR/Cas-medierad transkriptionell kontroll är ännu oklart i vivo, och reversibiliteten av KRAB-baserade repression återstår att ses, så starkt förtryck av KRAB och dess interagerande protein KAP1 har visats inducera permanent nedtystning8,9.
För att hantera dessa begränsningar, har vi utvecklat en roman transkriptionell regelsystemet kan villkorligt styra endogena genuttryck i en reversibel och avstämbara sätt i möss med konstruerad prokaryota binära transkriptionell regelsystem10. Prokaryota binära transkriptionell regelsystem med föreskrivande ligander, såsom lac och tet, har aktiverat sådana vändbar och avstämbara uttryck styra11,12,13, 14. dock otillräcklig förtryck styrkan hos de nuvarande binära systemen har hindrat deras bred antagande för styrning av endogena genuttryck hos däggdjur. Vi utvecklat en förbättrad lac förtryck system tillräckligt potenta för undertryckandet av endogena gener och anställd en roman strategi av inriktning tet transkriptionell aktivatorer direkt till cognate arrangören av en endogen gen att uppnå robust uppreglering (figur 1)10. Med denna teknik, har vi uppnått nästan två tiopotenser uttryck kontroll av endogena Dnmt1 genen i en avstämbara, inducerbara och reversibel sätt10. Här tillhandahåller vi stegvisa instruktioner för dess Invivo tillämpning på andra gener och organismer med möss som modell art.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59235/59235fig1.jpg"> Figur 1 : Översikt över systemets fjärrkontroll. Transkriptionen av en endogen målgenen kan regleras med hjälp av bakåtkompilerade lac repressor och tet aktivare system. Den mål genen arrangören eller intron är konstruerad för att innehålla operatörer för den snäva-bindande LacIGY repressor eller rtTA-M2 aktivator. R visar Repron (Repression intrpå), som innehåller 12 symmetriska lac operatorer (S) plus en partiell kanin beta-globin intron. T anger tet operatör. Den repressor eller aktivator/uttrycks från en vävnad-specifika Promotorn. Uttrycket av målgenen kan sedan reversibelt stämmas till önskat uttryck nivå genom administrering av IPTG (isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside, en antagonist till den LacIGY repressor) eller doxycyklin (Dox). Denna siffra har ändrats från Lee et al.10<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59235/59235fig1large.jpg" target="_blank">vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.</a>
Innan du börjar detta protokoll, se tabell 1 för att identifiera de relevanta stegen för önskad kontroll av genuttryck. Exempelvis för att iscensätta en mus som gör reversibel nedreglering av ”Gen X”, fylla i avsnitten 1, 3 och 4 i den nedan protokoll. Tabell 1 sammanfattar också de nödvändiga komponenterna i systemets fjärrkontroll.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Önskat uttryck förändring</td>
			<td>Förtrycket bara</td>
			<td>Enbart aktivering</td>
			<td>Både förtryck och aktivering</td>
		</tr>
<tr>
<td>Relevanta delar av protokollet</td>
			<td>1, 3-4</td>
			<td>2-4</td>
			<td>1-4</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fjärrkontroll sekvens behövs i målgenen</td>
			<td>Repron (”förtryck intron”; 12 symmetriska lac operatörer plus en partiell kanin beta-globin intron)</td>
			<td>Tet aktörerna</td>
			<td>Repron och Tet aktörerna</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fjärrkontroll sekvens läge</td>
			<td>Intron</td>
			<td>Arrangören</td>
			<td>Intron & arrangören</td>
		</tr>
<tr>
<td>Aktivator/Repressor behövs för önskad kontroll</td>
			<td>LacIGY Repressor</td>
			<td>rtTA-M2 aktivator</td>
			<td>LacIGY Repressor och rtTA-M2 aktivator</td>
		</tr>
<tr>
<td>Reglerande ligander</td>
			<td>IPTG</td>
			<td>Doxycyklin</td>
			<td>IPTG och/eller doxycyklin</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1: Översikt över fjärrkontrollen komponenter.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:715px;" width="715">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">B6C3F1/J</td>
			<td style="width:149px;">The Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:183px;">100010</td>
			<td style="width:167px;">https://www.jax.org/strain/100010</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cas9 Protein</td>
			<td style="width:149px;">PNA Bio</td>
			<td style="width:183px;">CP04</td>
			<td>http://www.pnabio.com/products/CRISPR_Cas9.htm?gclid=EAIaIQobChMIsoG8pLL33QIVBr7ACh0naQ4dEAAYAiAAEgKyHvD_BwE</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CRISPOR</td>
			<td>Haeussler et al. 2016</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td>http://crispor.tefor.net/</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Doxycycline-Containing Mouse Diet</td>
			<td style="width:149px;">Envigo</td>
			<td style="width:183px;">Varies by concentration</td>
			<td>https://www.envigo.com/products-services/teklad/laboratory-animal-diets/custom-research/doxycycline-diets/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ENCODE Database</td>
			<td style="width:149px;">Stanford University</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td>https://www.encodeproject.org/</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">iCre mRNA synthesis plasmid (pBBI)</td>
			<td style="width:149px;">Addgene</td>
			<td>65795</td>
			<td>https://www.addgene.org/65795/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">IPTG</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td style="width:183px;">I2481C</td>
			<td>https://www.goldbio.com/search?isSearch=Y&#38;q=iptg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">pGL3-Basic</td>
			<td style="width:149px;">Promega</td>
			<td style="width:183px;">E1751</td>
			<td>https://www.promega.com/products/reporter-assays-and-transfection/reporter-vectors-and-cell-lines/pgl3-luciferase-reporter-vectors/?catNum=E1751</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">SVM-BPfinder</td>
			<td style="width:149px;">Regulatory Genomics, Pompeu Fabra University</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td>http://regulatorygenomics.upf.edu/Software/SVM_BP/</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">TiProD: Tissue specific promoter Database</td>
			<td style="width:149px;">Department of Bioinformatics, UMG,&#160;University of G&#246;ttingen&#160;</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td>http://tiprod.bioinf.med.uni-goettingen.de</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">UCSC Genome Browser</td>
			<td style="width:149px;">University of California Santa Cruz</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td>https://genome.ucsc.edu/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo application of the remote-control system for the manipulation of endogenous gene expression

Här beskriver vi ett protokoll för genomförandet av systemet med fjärrkontroll (Reversible Manipulation of Transcription på Endogenous loci), vilket möjliggör reversibla och avstämbara uttryck kontroll av en endogena gen av intresse på levande modell system. Fjärrkontroll systemet använder system för förbättrad lac -förtryck och tet aktivering att uppnå ned- eller uppreglering av en målgenen inom ett enda biologiska system. Tight förtryck kan uppnås från repressor bindningsställen flexibelt ligger långt nedströms en transkription startwebbplats genom att hämma transkription töjning. Robust uppreglering kan uppnås genom att förbättra transkriptionen av en endogen gen genom att rikta tet transkriptionell aktivatorer till cognate arrangören. Reversibel och avstämbara uttryck kontrollen kan tillämpas och dragit tillbaka upprepade gånger i organismer. Styrkan och mångsidighet av systemet, som visats för endogena Dnmt1 här, kommer att möjliggöra mer exakt Invivo funktionella analyser genom att aktivera utredning av geners funktion på olika nivåer och genom att testa reversibiliteten av en fenotyp.

Systemets fjärrkontroll förtryck förmåga har påvisats i två olika metoder hittills. I den första metoden infogades lac repressor bindningsställen på endogena arrangören av Dnmt1 genen. I den andra metoden, som rekommenderas av detta protokoll, infördes de repressor bindningsställen en nedströms intron att undvika risken för påverkar arrangören funktion genom införande och därmed förenkla tillämpningen av fjärrkontrollen- systemet. Båda dessa tillvägagångssätt resulterat i framgångsrika förtryck (figur 2A, B och figur 3A-C)10. Dnmt1 uttryck förtrycktes till 15% av de oreglerade nivåer med hjälp av metoden arrangören-baserade (figur 2A). Denna snäva förtryck bröts på ett dosberoende sätt genom att behandla möss med varierande mängder av IPTG (figur 2A). Observerade Dnmt1 förtrycket har validerats på proteinnivå genom immunfärgning (figur 2B). Vi inte Observera någon märkbar skillnad i Dnmt1 uttryck mellan Dnmt1+/ + och Dnmt1LO/LO möss, bekräftar att våra lac operatören införande inte hade störs normala arrangören funktion10. Den intron-baserat tillvägagångssätt uppnått mer än 90% förtryck från operatörerna ligger flera kilobases nedströms av transkription start platsen av förmildrande transkription töjning (figur 3A, B)10. Detta intron-baserat tillvägagångssätt validerades ytterligare på sju extra robust initiativtagare (figur 3C). Undantagslöst snäva förtryck uppnåddes från alla initiativtagarna testade. Ingen korrelation mellan kvarvarande uttryck och styrkan hos initiativtagarna observerades, vilket tyder på att förtryck kapaciteten hos våra intron-baserade förtryck systemet överskrider transkriptionell styrkan hos alla robust initiativtagarna vi testat () Figur 3 ( C).
Invivo uppreglering förmåga fjärrkontroll systemet visades också på genen Dnmt1 . Vi införde två kopior av operatorn tet i Dnmt1 arrangören, tillsammans med lac operatören sekvenser, som möjliggör antingen uppreglering eller nedreglering beroende på vilken effektor protein är närvarande. Robust uppreglering och nedreglering av Dnmt1 uttryck, nära två tiopotenser (10% till 650%), uppnåddes i ESCs som innehåller den modifierade endogena Dnmt1 allelen (Dnmt1LGT), (figur 4A)10 . Båda förordningarna var fullt reversibel inducerbara av IPTG och Dox behandlingar, respektive (figur 4A). Vi introducerade nästa Dnmt1LGT ändringen i mus könsceller att testa funktionen i vivo uppreglering av systemets fjärrkontroll. Stark uppreglering av Dnmt1 observerades från lever, mjälte och njure, medan inga påvisbara uppreglering i hjärtat observerades (figur 4B)7. Cellcykeln-beroende uttrycksmönstret av Dnmt1 och bristen på proliferativ celler i hjärtat kan ligga bakom denna observation10,56. Det återstår för att se huruvida denna begränsning kan övervinnas genom att öka uttrycket av aktivator eller numrera av dess bindningsställen.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59235/59235fig2.jpg"> Figur 2 : In vivo förtryck av Dnmt1 av den LacIGY repressor. (A) möss med lac operatörer (LO) infogas i Dnmt1 arrangören, med eller utan uttryck för LacIGY, behandlades med olika doser av IPTG. qRT-PCR-analys av Dnmt1 uttryck visar dosberoende återföring av Dnmt1 förtryck i vivo genom IPTG behandling. Varje stapel representerar data från en annan mus. Uppgifterna representerar medelvärde ± SEM (n = 3). (B) immunfärgning av Dnmt1 protein i kolon kryptor av möss som dricksvatten med eller utan 160 mM IPTG för 3 veckor. Denna siffra har ändrats från Lee et al.10<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59235/59235fig2large.jpg" target="_blank">vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59235/59235fig3.jpg"> Figur 3 : In vivo och in vitro-förtryck av olika främjare av fjärrkontroll systemet. (A), en tidig version av sekvensen Repron (R *) infogades i en intron nedströms Villin arrangörens i en transgen mus som Villin-mKate2 (VilmKate2). qRT-PCR-analys av mKate2 uttryck i tunntarmen av möss med eller utan den LacIGY repressor visas. Varje stapel representerar data från en annan mus. (B) Confocal mKate2 bilder av tunntarmen med och utan LacIGY uttryck. (C) sex symmetriska lac operatörer (S) sattes in mellan olika initiativtagare och luciferas reporter. Reportrar (50 ng/hål i plattan med 96 brunnar) och repressor plasmider infördes normalnivå i NIH/3T3-celler i förhållandet 1:1 molar. Luciferas värden var bedömda 24 h efter transfection. Dessa in vitro-data representerar procentandelen luciferas uttryck i LacIGY-uttrycker celler i förhållande till de som uttrycker icke-funktionella Lindeberg (NFlacI). T-test användes för att bestämma statistisk signifikans. Uppgifterna representerar medelvärde ± SEM (n = 3). P ≤ 0,05, **P ≤ 0,01. Denna siffra har ändrats från Lee et al.10<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59235/59235fig3large.jpg" target="_blank">vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59235/59235fig4.jpg"> Figur 4 : Ned- eller uppreglering av Dnmt1 uttryck in vitro- och in vivo. (A) komplett fjärrkontroll systemet var konstruerad i odlade ESCs av genen inriktning och elektroporation metoder. Maximal förtryck av Dnmt1 uttryck uppnåddes med ingen behandling medan maximal aktivering uppnåddes genom både IPTG och Dox behandling. Uppgifterna representerar medelvärde ± SEM (n = 3). P ≤ 0,05, **P ≤ 0,01 (Welch's t-test). (B) In vivo aktivering av Dnmt1 av fjärrkontroll systemet, vilket framgår av immunfärgning av Dnmt1 protein i olika vävnader från fjärrkontroll möss. Den LGT allelen representerar arrangören modifiering av Dnmt1 innehålla lac operatör och tet aktivator bindningsställen. Möss behandlades med en normal eller Dox-innehållande kost (5000 mg/kg Doxycyklinhyklat) för en månad. Denna siffra har ändrats från Lee et al.10<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59235/59235fig4large.jpg" target="_blank">vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Supplementary Figure 1" src="/files/ftp_upload/59235/59235supfig1.jpg"> Kompletterande bild 1 : Exempel på landning pad införande i murina Dnmt1 intron 1. (A) Schematisk bild av DNA mall för landning pad införande, anpassad från Quadros et al. (2015)31. Heterotypic loxP platser, JT15 och Lox2272, separeras genom en kort distans-sekvens (sp) och flankerad på varje sida av 60-bp DNA som är homolog till målet genomisk regionen. (B), Sample DNA mall för landning pad införande i den Dnmt1 intron med hjälp av följande sgRNA: CTAGTACCACTCCTGTACCG (som riktar den omvänd strand). Den valda intronic regionen var bioinformatically informeras av steg 1,1, och sgRNA identifierades med CRISPOR29. (C) exempel på PCR primer design för bedömning av införande av landning pad. PCR primers utformades utanför homologi armarna på mallen för att bekräfta integreras endogena Dnmt1. Den vildtyp PCR-Amplikonen är 213 bp; efter införande, blir det 291 bp. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59235/59235supfig1large.jpg" target="_blank">vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about In vivo Application of the REMOTE-control System for the Manipulation of Endogenous Gene Expression at JoVE.com

In vivo Application of the REMOTE-control System for the Manipulation of Endogenous Gene Expression

In vivo tillämpning av systemet med fjärrkontroll för Manipulation av endogena genuttrycket

Detta protokoll beskriver de steg som behövs för att generera modellsystem där transkriptionen av en endogen gen av intresse kan styras villkorligt i levande djur eller celler använder förbättrad lac repressor eller tet aktivare system.

Here we describe a protocol for implementing the REMOTE-control system (Reversible Manipulation of Transcription at Endogenous loci), which allows for ...

Betydelsen av vår metod är dess mångsidighet och potens. Det gör det möjligt för forskare att ha robust kontroll över endogena genuttryck på ett sätt som har varit utmanande att uppnå med befintliga metoder. Det gör det möjligt för forskare att undersöka en gens funktion på olika uttrycksnivåer och på ett spatio-tidsmässigt sätt.Således möjliggör det för testning reversibiliteten av en fenotyp, vilket är användbart när man studerar sjukdom relaterade gener. För att åstadkomma förtryck, är målet genen intron konstruerad för att innehålla repron R, som innehåller 12 symmetriska Lac operatörer. När LacIGY-repressorn uttrycks från den önskade vävnadsspecifika promotorn förträngs målgenen.Repression av uppsätta som målgenen kan vändas, eller justeras till det önskade uttryckt som är jämn vid administration av IPTG, en antagonist av LacIGYförtryckaren. För att åstadkomma uppreglering, är målet gen promotorn konstruerad för att innehålla fyra eller fler Tat operatörer, T, som bindande platser för rtTA-M2 aktivatorer. När aktivatorn uttrycks från den önskade vävnadsspecifika promotorn i närvaro av doxycyklin induceras uppreglering av målgenen.Uppreglering av målgenen kan vändas eller justeras till önskad uttrycksnivå genom att dra tillbaka eller ändra koncentrationen av doxycyklin. För att åstadkomma både förtryck och aktivering kan Lac-förtrycket och Tat-aktivatorsystemen kombineras. Att ändra genen av intresse för förtryck, en transkriptionally inert intron mot de fem främsta slutet av genen av intresse bör identifieras för införande av repron sekvensen.För att erhålla den genomiska sekvensen för den gen av intresse, navigera till UCSC genomet webbläsare och välj det senaste utkastet av musgenomet under genomet fliken. Ange namnet eller symbolen för den gen av intresse i sökfältet för att visa avskrifter för genen och klicka sedan på gå. Välj sedan önskad avskriftsvariant för den gen av intresse och klicka på gensymbolen bredvid avskriftsvarianten av intresse.Nästa, under sekvensen och länkar till verktyg och databaser banner, klicka på den genomiska sekvenslänken. För alternativ för hämtning av sekvenser väljer du endast exons, introner och standard en FASTA-post per gen. För sekvensering formateringsalternativ, välj exons i versaler, allt annat i små fall och mask upprepas till N.Then, klicka på skicka.Slutligen, spara den här sekvensen, bevara den övre och gemena formatering i ett dokument eller program som kan kommenteras. För att undvika avbrott i CpG öarna, välj visa för CpG öarna spår under uttryck och reglering banner av UCSC genomet webbläsare och klicka på refresh. Zooma in på de fem främsta intronerna, klicka på varje CpG-ö som visas i grönt och välj visa DNA för den här funktionen.Efter att välja mask upprepas till N, klicka på få DNA för att erhålla CpG öarna sekvens. Slutligen överlägg dessa sekvenser med den ursprungliga sekvensfilen, och kommentera dessa som intronic regioner att undvika. Undvik intronic-regioner med förstärkare signaturer i vävnaderna av intresse, navigera till ENCODE data base och välj ikonen experiment.För assaytypen väljer du ChiP-seq eller DNase-seq och fyller de andra kategorierna efter de celler som ska konstrueras. Efter funktionen val, välj den vänstra mest piktogram i blått, för vilka visa resultat som lista visas. Välj sedan datamängderna för målen för monometyleringen H3K4, h3k27 acetylation, DNase 1 och CTCF som mest nära matchade de celler som skulle konstrueras.Inom varje relevant datamängd bläddrar du till filavsnittet, kontrollerar att mm10 och UCSC är markerade och klickar på knappen visualisera. Nu, i UCSC genomet webbläsare, zooma in på de fem främsta introner och klicka på varje topp i kommenterade topp spår. Skaffa DNA-sekvensen för varje toppregion genom att klicka på de kromosomiska koordinaterna för varje topp.I rullgardinsmenyn för vy väljer du DNA och klickar på masken upprepas till N.Finally överlägg dessa sekvenser med den ursprungliga sekvensfilen och kommenterar dessa som intronic-regioner att undvika. För att identifiera ett sgRNA i de återstående intronic-regionerna med hög specificitet och förutsagda effektivitetspoäng, navigera till ett online-sgRNA-designverktyg, till exempel CRISPOR. Ange sekvensen för den intronic regionen av intresse, ange relevant referensgenomet och välj önskad protospacer intilliggande motiv.Klicka sedan på skicka. Därefter sortera den förutspådda sgRNA:s efter specificitetspoäng och välj en eller flera sgRNA:er som också har en hög förväntad effektivitetspoäng. Slutligen utforma en DNA-mall som innehåller en PITT landning pad sekvens flankerad på båda sidor av 60-bas homologi armar som motsvarar sgRNA cut site.För återföring av målgenförtryck, administrera IPTG i dricksvattnet hos de homozygösa uppfödda mössen med den modifierade allelen av intresse genom att helt lösa upp den önskade mängden IPTG i sterilt destillerat vatten på administrationsdagen. Linda flaskan med folie och administrera IPTG-vattnet i en lätt skyddad flaska till mössen av lämplig genotyp och kontroller i minst en vecka. Fortsätt att analysera uttrycket av genen av intresse i målvävnaden.För att inducera genuppregleringen, administrera doxycyklin i kosten i en vecka och fortsätta att analysera uttrycket av genen av intresse för målvävnaden. qRT PCR anaylisis visade att DNMT1 uttryck var förträngda till 15%av de oreglerade nivåerna med hjälp av promotorn-baserade metoden. Förtrycket återfördes på ett dosberoende sätt genom att möss med varierande mängder IPTG behandlas.Det observerade DNMT1-förtrycket och återföringen av DNMT1-förtrycket genom IPTG-behandling validerades på proteinnivå genom immunfärgning. qRT PCR analys av mKate2 uttryck visade att intron-baserade metoden uppnått mer än 90%förtrycket från operatörer som ligger flera kilobases nedströms av transkriptionen startplatsen genom att dämpa transkription töjning. Confocal bilder av mKate2 uttrycket i den lilla intenstine av mössen med eller utan LacIGY repressor validerade intron-baserade metoden.Robust uppreglering och nedreglering av DNMT1 uttryck uppnåddes i embryonala stamceller som innehåller den modifierade endogena DNMT1 allel med Tat och Lac sekvenser. Båda förordningarna var helt reversibla och inducerbara av behandlingar med IPTG och Dox. Stark uppreglering av DNMT1 observerades från levern, mjälte och njure.Ingen detekterbar uppreglering i hjärtat observerades dock, vilket tyder på att cellen cykel-beroende uttryck mönster av DMNT1 och bristen på proliferative celler i hjärtat kan ligger bakom denna observation. Att studera in vivo-funktionen hos en kritisk gen genom att manipulera dess uttryck har ofta varit en utmaning på grund av dödlighet. Vår metod tillät oss att övervinna den dödliga fenotyp för vår gen av intresse och gjorde det möjligt för oss att studera dess roll i tumorogenesis in vivo.På samma sätt kommer denna teknik att möjliggöra undersökning av andra viktiga gener som har varit svåra att studera.

Research

JoVE Journal

Genetics

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

Transkription in vitro analyser och deras tillämpning i Drug Discovery

In vitro transcription assays have been developed and widely used for many years to study the molecular mechanisms involved in transcription. This process ...

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Genmanipulation av växtpatogen<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; Att studera Svamp biologi och växt mikrobinteraktioner

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the ...

Inducible T7 RNA Polymerase-mediated Multigene Expression System, pMGX

Inducerbart T7-RNA-polymeras-medierat multigenexpressionssystem, pMGX

Co-expression of multiple proteins is increasingly essential for synthetic biology, studying protein-protein complexes, and characterizing and harnessing ...

Controllable Ion Channel Expression through Inducible Transient Transfection

Kontrollerbar jonkanalen uttryck genom inducerbara Transient transfektion

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be ...

Studying Cell Cycle-regulated Gene Expression by Two Complementary Cell Synchronization Protocols

Studierande cellcykelreglerade genuttryck av två komplementära cellsynkroniseringsprotokoll

The gene expression program of the cell cycle represents a critical step for understanding cell cycle-dependent processes and their role in diseases such ...

Production and Purification of Baculovirus for Gene Therapy Application

Produktion och rening av baculoviridae för genterapi ansökan

Baculovirus has traditionally been used for the production of recombinant protein and vaccine. However, more recently, baculovirus is emerging as a ...

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

Manipulation av ploiditeten i Caenorhabditis elegans

Mechanisms that involve whole genome polyploidy play important roles in development and evolution; also, an abnormal generation of tetraploid cells has ...

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

Utforska den roten mikrobiomet: extrahera bakteriell gemenskapen Data från jord, odlingsbädden och rot Endosphere

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...

Manipulation of Gene Function in Mexican Cavefish

Manipulation av geners funktion i mexikanska släktet

Cave animals provide a compelling system for investigating the evolutionary mechanisms and genetic bases underlying changes in numerous complex traits, ...

Efficient Transcriptionally Controlled Plasmid Expression System for Investigation of the Stability of mRNA Transcripts in Primary Alveolar Epithelial Cells

Effektivt transkriptionsstyrt plasmiduttryckssystem för undersökning av stabiliteten hos mRNA-avskrifter i primära Alveolar Epitelceller

Studying posttranscriptional regulation is fundamental to understanding the modulation of a given messenger RNA (mRNA) and its impact on cell homeostasis ...