Name: in vivo application of the remote-control system for the manipulation of endogenous gene expression
Uploaded: 2019-03-29T14:00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In vivo Application of the REMOTE-control System for the Manipulation of Endogenous Gene Expression at JoVE.com

Biz geç Dr Heidi Scrable memeli lacI gen yapısı (Mayo Clinic, Rochester, MN), onun cömert bir hediye için teşekkür Dr Daniel Villin organizatörü sağlamak için Louvard (Institut Curie, Paris, Fransa) ve Dr Laurie Jackson-Grusby (Çocuk Hastanesi, Boston, MA) bu teknoloji gelişme erken aşamalarında onun katkıları için. Dr Nancy Wu ve Dr Robert Maxson transgenik ve nakavt fareler üreten onların yardım için sana şükrediyoruz. Biz yararlı tartışmalar için Laird laboratuvar üye teşekkür ve destek. Bu eser Ulusal Sağlık Enstitüleri [R01 CA75090, R01 DA030325, R01 CA157918 ve R01 CA212374 için P.W.L. ve 1F31CA213897-01A1 N.A.V.S için] tarafından desteklenmiştir.

AnchorDx bilimsel Danışma kurulları ve Progenity, Inc PWL hizmet vermektedir

Uzaktan kumanda sistemi potansiyel sınırlama ve kritik adım hedef gen ekspresyonu etkilemeden önleyici ve/veya harekete geçirmek bağlayıcı siteleri ekleme ile ilgili sorun var. Özgün Baskı yaklaşımımız, Dnmt1 gen için uygulanan olarak lac önleyici bağlayıcı siteleri bir organizatörü transcriptionally kritik bölgeleri içinde ekleme dahil. Organizatörü işlevi etkileyen ve bu nedenle riskini azaltmak amacıyla uzaktan kumandalı sistem genel uygulanabilirliği geliştirmek, biz bir intron tabanlı baskı yaklaşım geliştirmiştir. Gelişmiş lac sistemimiz potens bizi sıkı bir şekilde yer alan işleçler test ettik güçlü rehberleri transkripsiyon bastırmak izin birkaç kilobases aşağı transkripsiyonu yüzlerce siteleri (şekil 3A-C) başlatmak 10. baskı düzeyleri önemlisi, Organizatör (şekil 3A-C)10transkripsiyon güçlerinden bağımsız olduğunu. Bu baskı kapasitesi bizim intron tabanlı baskı sisteminin test rehberleri transkripsiyon gücünü aştığını göstermektedir. İntron tabanlı bu yaklaşım, baskı yoluyla iki bileşeni, transkripsiyon uzama makine ve lac repressors57arasında fiziksel girişime aracılık ettiği olasıdır. Bu basit baskı mekanizması ve intron tabanlı yöntemi gösterdiği sağlamlık bu yaklaşım genellikle farklı genler, doku ve organizmalar için geçerli hale gelebilir.
Upregulation uzaktan kumanda sistemi tarafından organizatörü işlevi etkileyen riski üzerine kuruludur hedef gen düzenleyici bir mesafede olmak transactivator Bağlayıcı sıraları gerektirir. Ancak, dizileri bağlama pozisyon dışında transcriptionally kritik bölgesi olabilir bulundu. Hem Dnmt1 hem de EF1α rehberleri sağlam upregulated tet operatörleri transkripsiyon başlangıç siteleri10yüz üsleri akıntıya karşı birkaç yer vardı. Bu rahat sınırlama organizatörü işlevi bir hedef gen transactivator yokluğunda etkileyen şansını büyük ölçüde azaltır. Bağlama artırıldığında dizileri ve/veya daha güçlü transactivators kullanımı daha da azaltmak belgili tanımlık tehlike yanında olanaklı kılmak uzak uzak transkripsiyon başlangıç sitesinden sitelerden upregulation yardımcı olabilir.
Bizim uzaktan kumandalı sistem düzeyinde, zamanlama ve endojen gen ifadesinin bir fenotip reversibility ve tarafından kolayca ulaşılabilir değildir farklı ifade düzeyleri sonuçlarını test etmek için izin vererek, konumunu zarif kontrol sağlar vivo gen ifade-kontrol teknolojilerinde geçerli. Bizimki de dahil olmak üzere çoğu gen ifade analizleri içinde bir nüfus arasında önemli farklılıklar bulunan hücrelerin ortalamasını ifade değerleri temsil unutmamak gerekir. Bu heterojenlik farklılaşma veya apoptosis58gibi hücresel karar alma süreçlerine etkileyebilir. Gen ifadesi denetim duyarlığını ek genetik devre mühendislik59tarafından büyük olasılıkla daha fazla geliştirilebilir rağmen mevcut sistem gözlenen potens birçok biyolojik bağlamlarda yararlı gen fonksiyon incelenmesi izin verir. Buna ek olarak, hedef özgüllüğü yüksek derecede operatör dizileri yanı sıra büyük bir evrimsel mesafe memeliler ve düzenleyici bileşenleri60kaynak türleri arasında karmaşıklığı nedeniyle bekleniyor. Ayrıca, repressors ve harekete geçirmek transgenik fare satırları geliştirilen ve endojen herhangi bir gen için istihdam. Örneğin, varolan tet transactivator fare modelleri upregulation hedef gen istenen fare dokularda gerçekleştirmek için adapte edilebilir. Biz son zamanlarda bizim gelişmiş lac önleyici sağlam doku özgü ifade lacIGY gen48 Hipp11 odağı getirerek mevcut Cre satırları ile birlikte birden fazla doku türlerinde sürebilirim transgenik bir çizgi geliştirilen (yayınlanmamış) bir somon balığı-STOP-Lox öğesinin kontrol altında. Bu satırı önemli ölçüde uzaktan kumandalı sistem doku özgü uygulanmasının kolaylaştırılması.
Gene upregulation uzaktan kumanda sistemi tarafından geçerli indüklenebilir transgenik yaklaşımlar ile karşılaştırıldığında birçok avantaj sağlar. Endojen locus kullanır gibi ekleme konumu etkili için sınama için birden çok satıra transgenik nesil gerektirmez. O zaten güçlü bir organizatörü ifadeden artırır çünkü geleneksel transgenik modelleri üzerinde en az viral rehberleri itimat ise buna ek olarak, bu yaklaşım gen güçlü temel ifade ile upregulation için çok uygundur. Son olarak, doku özgüllük, hücre döngüsü kontrol ve bir hedef gen türevleri Uçbirleştirme muhafaza upregulation yaklaşımımız tarafından doğuştan gelen BDTgibi doğal düzenleme unsurları korur gibi-düzenleyici elemanlarının. CRISPR/CA-aracılı gen hedefleme teknolojisi gelişine bu teknoloji farklı modeli sistemlerinde büyük ölçüde kolaylaştıracaktır.

Genetik nakavt veya transgenik yaklaşımlar hayvan modellerinde gen işlevini öğrenmek için etkili yol olmuştur. Ancak, bu yaklaşımlarla ifade Yönetmeliği (açık/kapalı) ayrılmalar, geçici olmayan ve böylece bir gen tam fonksiyonel yelpazesini belirleme yeteneğine sahip değildir. Koşullu Cre/MoxP teknolojileri spatio-temporal inactivation veya gen fonksiyon aktivasyonu sağladı ama ayrılmalar doğaları hücre ölümcül ve irreversibility1,2 gibi sınırlamalar oluşturmaya devam ediyor , 3. bu boşluğu doldurmak için tetkullanarak koşullu devirme yaklaşımlar geliştirilmiştir-shRNA veya miRNA4düzenlenir. Ancak, hedef kapalı efektleri RNAi5 için bir endişe kalır ve içinde vivo. kontrol etmek zor oldu Daha yakın zamanlarda, CRISPR/CA-aracılı transkripsiyon kontrolü teknolojileri hem yukarı - ve endojen gen ekspresyonu downregülasyon ulaşmak daha çok yönlü bir yaklaşım tanıttı ve kendi araçları6,7 gösterdi . Ancak, transkripsiyon kontrolü CRISPR/CA-aracılı etkinliğini henüz vivo, belirsizdir ve reversibility KRAB tabanlı baskı KRAB görüldü, güçlü baskı gerekmektedir ve onun etkileşen protein KAP1 ikna etmek için gösterilen kalıcı gene8,9susturmak.
Bu sınırlamaları gidermek için bir roman transkripsiyon düzenleyici sistem koşullu olarak bir tersinir endojen gen ifadesinde kontrol yetenekli geliştirdiğimiz ve fare kullanarak ayarlanabilir şekilde prokaryotik ikili transkripsiyon mühendislik düzenleyici sistemleri10. Prokaryotik ikili transkripsiyon düzenleyici sistemleri ile lac ve tet, gibi düzenleyici ligandlar böyle tersinir etkin ve akort ifade kontrol11,12,13, 14. ancak, geçerli ikili sistemler yetersiz baskı potens endojen gen ekspresyonu memelilerde kontrol etmek için onların geniş kabulü engelledi. Biz bir gelişmiş lac baskı sistemi yeterince güçlü endojen genler baskı için geliştirilen ve tet transkripsiyon aktivatörleri ulaşmak için doğrudan soydaş organizatörü endojen bir gen için hedefleme yeni bir strateji istihdam sağlam upregulation (şekil 1)10. Bu teknoloji ile neredeyse iki büyüklük ifade kontrolünü endojen Dnmt1 gene bir akort, indüklenebilir ve geri dönüşümlü bir şekilde10elde ettik. Burada diğer genler ve fare modeli tür olarak kullanarak organizmalar içinde vivo uygulanması için adım adım yönergeler sağlar.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59235/59235fig1.jpg"> Resim 1 : Uzaktan kumandalı sistem bakış. Bir endojen hedef gen transkripsiyonu mühendislik lac önleyici ve tet harekete geçirmek sistemleri kullanarak düzenlenmiş olması. Hedef gen Düzenleyici veya intron sıkı bağlama LacIGY önleyici ve/veya rtiçin işleçler içeren şekilde tasarlanmıştır TA-M2 harekete geçirmek. R Repron (Repression intrüzerinde), bir kısmi tavşan beta-globin intron 12 simetrik lac operatörleri (S) içeren gösterir. T tet işleç gösterir. Önleyici ve/veya harekete geçirmek/doku özgü organizatörü ifade edilir. Hedef gen ifadesinin ardından geri dönülebilir olarak istenen ifade seviyeye IPTG (izopropil β-D-1-thiogalactopyranoside, LacIGY önleyici bir antagonist) veya Doxycycline (Dox) yönetimi tarafından ayarlanan. Bu rakam Lee ve ark.10değiştirildi<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59235/59235fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
Bu iletişim kuralı başlamadan önce Tablo 1 gen ekspresyonu istediğiniz denetim için ilgili adımları tanımlamak için gözden geçirin. Örneğin, "Gen x" tersine çevrilebilir downregülasyon sağlar bir fare mühendis için bölümler 1, 3 ve 4 / tamamlamak Protokolü aşağıda. Tablo 1 de uzaktan kumanda sisteminin gerekli bileşenleri özetler.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>İstenen ifadeyi Değiştir</td>
			<td>Sadece baskı</td>
			<td>Yalnızca etkinleştirme</td>
			<td>Baskı ve harekete geçirmek</td>
		</tr>
<tr>
<td>Protokolü'nün ilgili bölümleri</td>
			<td>1, 3-4</td>
			<td>2-4</td>
			<td>1-4</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hedef geni gerekli uzaktan kumanda sırası</td>
			<td>Repron ("Baskı intron"; 12 simetrik lac operatörleri artı bir kısmi tavşan beta-globin intron)</td>
			<td>Tet operator(s)</td>
			<td>Repron ve Tet operator(s)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Uzaktan kumandalı sıra konumu</td>
			<td>İntron</td>
			<td>Organizatörü</td>
			<td>İntron & organizatörü</td>
		</tr>
<tr>
<td>Harekete geçirmek/önleyici istediğiniz denetim için gerekli</td>
			<td>LacIGY önleyici</td>
			<td>rtTA-M2 harekete geçirmek</td>
			<td>LacIGY önleyici ve rtTA-M2 aktivatör</td>
		</tr>
<tr>
<td>Düzenleyici ligandlar</td>
			<td>IPTG</td>
			<td>Doksisiklin</td>
			<td>IPTG ve/veya Doxycycline</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1: Uzaktan kumandalı bileşenleri bakış.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:715px;" width="715">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">B6C3F1/J</td>
			<td style="width:149px;">The Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:183px;">100010</td>
			<td style="width:167px;">https://www.jax.org/strain/100010</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cas9 Protein</td>
			<td style="width:149px;">PNA Bio</td>
			<td style="width:183px;">CP04</td>
			<td>http://www.pnabio.com/products/CRISPR_Cas9.htm?gclid=EAIaIQobChMIsoG8pLL33QIVBr7ACh0naQ4dEAAYAiAAEgKyHvD_BwE</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CRISPOR</td>
			<td>Haeussler et al. 2016</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td>http://crispor.tefor.net/</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Doxycycline-Containing Mouse Diet</td>
			<td style="width:149px;">Envigo</td>
			<td style="width:183px;">Varies by concentration</td>
			<td>https://www.envigo.com/products-services/teklad/laboratory-animal-diets/custom-research/doxycycline-diets/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ENCODE Database</td>
			<td style="width:149px;">Stanford University</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td>https://www.encodeproject.org/</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">iCre mRNA synthesis plasmid (pBBI)</td>
			<td style="width:149px;">Addgene</td>
			<td>65795</td>
			<td>https://www.addgene.org/65795/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">IPTG</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td style="width:183px;">I2481C</td>
			<td>https://www.goldbio.com/search?isSearch=Y&#38;q=iptg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">pGL3-Basic</td>
			<td style="width:149px;">Promega</td>
			<td style="width:183px;">E1751</td>
			<td>https://www.promega.com/products/reporter-assays-and-transfection/reporter-vectors-and-cell-lines/pgl3-luciferase-reporter-vectors/?catNum=E1751</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">SVM-BPfinder</td>
			<td style="width:149px;">Regulatory Genomics, Pompeu Fabra University</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td>http://regulatorygenomics.upf.edu/Software/SVM_BP/</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">TiProD: Tissue specific promoter Database</td>
			<td style="width:149px;">Department of Bioinformatics, UMG,&#160;University of G&#246;ttingen&#160;</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td>http://tiprod.bioinf.med.uni-goettingen.de</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">UCSC Genome Browser</td>
			<td style="width:149px;">University of California Santa Cruz</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td>https://genome.ucsc.edu/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo application of the remote-control system for the manipulation of endogenous gene expression

Burada biz için ters çevrilebilir ve akort ifade kontrolünü sağlayan uzaktan kumanda sistemi (Reversible Manipulation of Transcription Endogenous loci,), uygulama için bir iletişim kuralı tanımlamak bir yaşam ilgi endojen gen sistemleri model. Uzaktan kumanda sistemi aşağı - ya da upregulation bir hedef genin tek bir biyolojik sistem içinde elde etmek için gelişmiş lac baskı ve tet aktivasyon sistemleri kullanır. Sıkı baskı esnek bulunan sitelerde bağlama önleyici elde edilebilir çok transkripsiyon uzama inhibe bir transkripsiyon başlangıç sitesine aşağı. Sağlam upregulation soydaş organizatörü için tet transkripsiyon aktivatörleri hedefleyerek endojen bir gen transkripsiyonu güçlendirerek elde edilebilir. Bu geri dönüşümlü ve akort ifade denetimi uygulanan ve canlılar arasında art arda çekilmiş. Güç ve çok yönlülük endojen Dnmt1 için burada gösterildiği gibi sistem daha kesin içinde vivo fonksiyonel analiz araştırma çeşitli ifade düzeylerde gen işlevinin etkinleştirilmesi ve reversibility in test sağlayacak bir fenotip.

Baskı yeteneği uzaktan kumanda sisteminin şu ana kadar iki farklı yaklaşımlar gösterilmiştir. İlk yaklaşımda lac önleyici bağlayıcı siteleri Dnmt1 gen düzenleyici endojen yerleştirildi. Bu iletişim kuralı tarafından tavsiye edilir, ikinci yaklaşımda önleyici bağlayıcı siteleri bir aşağı akım intron organizatörü işlev ekleme tarafından etkileyen potansiyel riskini önlemek için ve böylece uygulama uzaktan kumandanın basitleştirmek için eklenmiş sistem. Her iki yaklaşımın başarılı baskı (Şekil 2A, B ve şekil 3A-C)10' sonuçlandı. Dnmt1 ifade organizatörü dayalı yaklaşım (Şekil 2A) kullanarak düzensiz düzeyleri % 15'i için baskı. Bu sıkı baskı IPTG (Resim 2A) değişen miktarlarda ile fareler davranarak bir doz bağımlı şekilde ters. Gözlenen Dnmt1 baskı protein düzeyinde immunostaining (Resim 2B) tarafından doğrulandı. Biz Dnmt1 ifade Dnmt1arasında herhangi bir fark fark gözlemlemek değil+/ + ve Dnmt1LO/LO fareler, bizim lac operatör ekleme normal organizatörü kesintiye değil teyit işlev10. İntron dayalı bir yaklaşım elde daha fazla % 90 baskı operatörleri transkripsiyon uzama (şekil 3A, B)10inceltiyorum tarafından transkripsiyon başlangıç sitesinin birkaç kilobases nehrin aşağısında yer. Bu intron dayalı yaklaşım daha fazla yedi ek sağlam rehberleri (şekil 3C) üzerinde doğrulandı. Her zaman sıkı baskı test rehberleri tümünden sağlanır. Kalan ifade düzeyleri ve güçlü bir rehberleri arasında hiçbir bağlantı gözlendi, baskı kapasitesi bizim intron tabanlı baskı sisteminin tüm sağlam rehberleri transkripsiyon potens aştığını öne test ettik () Şekil 3 C).
Uzaktan kumanda sistemi içinde vivo upregulation yeteneği de Dnmt1 gen üzerinde gösterilmiştir. Ya upregulation ya da hangi efektör bağlı olarak protein mevcut downregülasyon için izin vermek için Dnmt1 düzenleyici, lac operatör dizileri, birlikte tet işleç iki kopyasını girmiştir. Sağlam upregulation ve iki büyüklük (10 650-%), yakın Dnmt1 ifade downregülasyon değiştirilmiş endojen Dnmt1 gen (Dnmt1LGT) (şekil 4A) içeren ESCs elde edildi10 . Her iki yönetmelik tam tersine çevrilebilir ve tedaviler, IPTG ve Dox tarafından indüklenebilir idi (şekil 4A). Biz sonraki uzaktan kumanda sistemi içinde vivo upregulation yeteneğini test etmek için fare germline içine Dnmt1LGT değişiklik tanıttı. Hiçbir tespit upregulation ' kalbinde (şekil 4B)7gözlendi, ancak güçlü upregulation Dnmt1 , karaciğer, dalak ve böbrek, gözlendi. Dnmt1 hücre döngüsü bağımlı ifade desenini ve proliferatif kalp hücrelerinde kıtlığı bu gözlem10,56altında yatan. Belgili tanımlık harekete geçirmek veya onun bağlama sitelerin sayısı ifade düzeyini artırarak bu sınırlamayı aşmak olup olmadığını görülecek.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59235/59235fig2.jpg"> Resim 2 : Vivo Dnmt1 baskı LacIGY önleyici tarafından. Dnmt1 organizatörü, veya LacIGY, ifade olmadan eklenen(a)fareler lac operatörleri (LO) ile IPTG çeşitli dozları ile tedavi. Dnmt1 ifade analizini qRT-PCR Dnmt1 baskı doz bağımlı iptali ile IPTG tedavi içinde vivo gösterir. Her çubuk farklı bir fareden veri temsil eder. Verileri temsil eden ortalama ± SEM (n = 3). (B) Immunostaining farelerin kolon kriptalarının Dnmt1 proteinin içme suyu ile veya olmadan 160 mM IPTG 2 hafta için sağlanan. Bu rakam Lee ve ark.10değiştirildi<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59235/59235fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59235/59235fig3.jpg"> Şekil 3 : Vivo ve Uzaktan kumanda sistemi tarafından çeşitli rehberleri tüp bebek bastırma. (A) Repron sıra (R *) önceki bir sürümü bir intron aşağı bir Villin-mKate2 transgenik Mouse (VilmKate2) Villin düzenleyicinin içine eklenen. ince bağırsak mKate2 ifadede fare ile veya olmadan LacIGY önleyici analizini qRT-PCR gösterilir. Her çubuk farklı bir fareden veri temsil eder. İnce bağırsak ile ve LacIGY ifade olmadan (B) Confocal mKate2 görüntüleri. (C) altı simetrik lac operatörleri (S) çeşitli rehberleri ve luciferase muhabir arasında yerleştirildi. Gazetecilere (50 ng/96-şey plaka iyi) ve önleyici plazmid geçici bir 1:1 molar oranı NIH/3T3 hücreye kullanılmaya başlanmıştır. Luciferase değer biçilen 24 saat sonra transfection vardı. Bunlar tüp bebek veri temsil LacIGYluciferase ifade yüzde-hücreleri göre bu işlevsel olmayan LacI (NFlacI) ifade ifade. T-testleri istatistiksel anlamlılık belirlemek için kullanılmıştır. Verileri temsil eden ortalama ± SEM (n = 3). P ≤ 0,05, **P ≤ 0,01. Bu rakam Lee ve ark.10değiştirildi<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59235/59235fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59235/59235fig4.jpg"> Şekil 4 : Aşağı - ve/veya tüp bebek ve içinde vivo Dnmt1 ifade upregulation. (A) tam uzaktan kumanda sistemi kültürlü ESCs gen hedefleme ve elektroporasyon yaklaşımlar tarafından geliştirilmiş. Maksimal harekete geçirmek IPTG ve Dox elde ederken Dnmt1 ifade maksimal baskı ile hiçbir tedavi sağlanır. Verileri temsil eden ortalama ± SEM (n = 3). P ≤ 0,05, **P ≤ 0,01 (Welch t-testleri). (B) In vivo aktivasyonu Dnmt1 gibi uzaktan kumandalı fareler immunostaining Dnmt1 protein çeşitli dokularda tarafından uzaktan kumanda sistemi tarafından. LGT alleli lac operatör ve tet harekete geçirmek bağlayıcı siteleri içeren Dnmt1 organizatörü değişiklik gösterir. Fare ile normal veya Dox içeren diyet (5000 mg/kg Doksisiklin Hyclate) bir ay boyunca tedavi edildi. Bu rakam Lee ve ark.10değiştirildi<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59235/59235fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Supplementary Figure 1" src="/files/ftp_upload/59235/59235supfig1.jpg"> Ek resim 1 : Örnek pad ekleme fare Dnmt1 intron 1 iniş. (A)şeması DNA şablonunun pad ekleme, Brezilya'lı ve ark. (2015)31adapte açılış için. Heterotypic loxP siteleri, JT15 ve Lox2272, (sp) kısa spacer sırası tarafından ayrılmış ve 60-bp hedef genomik bölgesine homolog DNA'ın her tarafında çevrili. Pad ekleme aşağıdaki sgRNA kullanarak Dnmt1 intron iniş için (B) örnek DNA şablon: (ki ters strand hedefleyen) CTAGTACCACTCCTGTACCG. Seçili intronic bölge bioinformatically adım 1.1 tarafından haberdar oldu ve sgRNA CRISPOR29kullanarak tespit edildi. (C) örnek ekleme iniş pisti değerlendirmek için PCR astar tasarım. PCR astar şablonu homoloji silah dışında endojen Dnmt1entegrasyon onaylamak için tasarlanmıştır. 213 wildtype PCR amplicon olan kan basıncı; ekleme, 291 olur bp. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59235/59235supfig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about In vivo Application of the REMOTE-control System for the Manipulation of Endogenous Gene Expression at JoVE.com

In vivo Application of the REMOTE-control System for the Manipulation of Endogenous Gene Expression

Uzaktan kumandalı sistem in vivo uygulama için işleme endojen gen ekspresyonu

Bu iletişim kuralı canlı hayvan veya gelişmiş lac önleyici ve/veya tet harekete geçirmek sistemleri kullanarak hücreleri içinde ilgi endojen bir gen transkripsiyonu koşullu olarak kontrol edilebilir bir modeli sistemi oluşturmak için gereken adımları açıklar.

Here we describe a protocol for implementing the REMOTE-control system (Reversible Manipulation of Transcription at Endogenous loci), which allows for ...

Yöntemimizin önemi çok yönlülüğü ve gücüdür. Araştırmacıların mevcut yöntemleri kullanarak elde etmek için zor olan şekillerde endojen gen ekspresyonu üzerinde sağlam kontrole sahip olmasını sağlar. Araştırmacıların bir genin işlevini çeşitli ekspresyon düzeylerinde ve spatio-temporal bir şekilde araştırmalarına olanak tanır.Böylece hastalıkla ilgili genleri incelerken yararlı olan bir fenotipin geri döndürülemesini test etmeye olanak sağlar. Baskıyı gerçekleştirmek için, hedef gen intron 12 simetrik Lac operatörleri içeren repron R içerecek şekilde tasarlanır. LacIGY represör istenilen doku özel organizatörü ifade edildiğinde, hedef gen bastırılır.Hedef genin baskısı, LacIGY represörünün bir antagonisti olan IPTG'nin uygulanması yla tersine çevrilebilir veya istenilen ifade düzeyine ayarlanabilir. Upregulation gerçekleştirmek için, hedef gen organizatörü rtTA-M2 aktivatörleri için bağlayıcı siteleri olarak dört veya daha fazla Tat operatörleri, T, içerecek şekilde tasarlanmıştır. Aktivatör doksisiklin varlığında istenilen dokuya özgü promotörden ifade edildiğinde, hedef genin yeniregülasyonu na neden olur.Doksisiklin konsantrasyonu geri çekilerek veya değiştirilerek hedef genin yükseltilmesi tersine çevrilebilir veya istenilen ifade düzeyine ayarlanabilir. Hem baskı hem de aktivasyon gerçekleştirmek için, Lac baskı ve Tat aktivatör sistemleri kombine edilebilir. Baskı için ilgi genini değiştirmek için, repron dizisinin eklenmesi için ilgi geninin beş asal ucuna doğru transkripsiyonel inert intron tanımlanmalıdır.İlgi geni için genomik diziyi elde etmek için UCSC genom tarayıcısına gidin ve genom sekmesi altındaki fare genomunun en son taslağını seçin. Genin transkriptlerini görüntülemek için arama çubuğuna ilgi geninin adını veya sembolüni girin ve ardından git'e tıklayın. Daha sonra, ilgi geni için istenilen transkript varyantını seçin ve ilginin transkript varyantının yanındaki gen sembolüne tıklayın.Daha sonra, dizi ve araçlar ve veritabanları afiş bağlantılar altında, genomik dizi bağlantısını tıklatın. Sıra alma bölgesi seçenekleri için yalnızca ekzonlar, intronlar ve gen başına varsayılan bir FASTA kaydı nı seçin. Biçimlendirme seçeneklerini sıralamak için, büyük harfle exons seçin, küçük harf ve maske yinelenen her şey N.Then, gönder'i tıklatın.Son olarak, açıklamalı olabilecek bir belge veya programdaki üst ve küçük harflerle biçimlendirmeyi koruyarak bu sırayı kaydedin. CpG adalarının kesintiye uğramasını önlemek için, UCSC genom tarayıcısının ifade ve düzenleme bayrağı altında CpG adaları için göster'i seçin ve yenile'yi tıklatın. Beş asal intronları yakınlaştırırken, yeşil renkte gösterilen her CpG adasına tıklayın ve bu özellik için görünüm DNA'sını seçin.Maske tekrarlarını N'ye seçtikten sonra, CpG adaları dizisini elde etmek için DNA'yı edinin'i tıklatın. Son olarak, bu dizileri özgün sıra dosyasıyla birlikte bindirme ve önlemek için bunları intronic bölgeler olarak açıklama olarak ekleyin. İlgi çekici dokularda artırıcı imzaları bulunan intronik bölgeleri önlemek için ENCODE veri tabanına gidin ve denemeler simgesini seçin.Teşp türü için ChiP-seq veya DNase-seq'yi seçin ve diğer kategorileri tasarlanacak hücrelere göre doldurun. Özellik seçiminden sonra, sonuçları liste olarak görüntüleyen mavi renkte soldaki en piktogramı seçin. Daha sonra, h3k4 monometilasyon, h3k27 asetilasyon, DNase 1 ve kullanılacak hücrelerle en yakından eşleşen CTCF hedefleri için veri kümelerini seçin.İlgili her veri kümesiiçinde dosya bölümüne gidin, mm10 ve UCSC'nin seçili olduğundan doğrulayın ve visualize düğmesini tıklatın. Şimdi, UCSC genom tarayıcısında, beş asal intronu yakınlaştırın ve açıklamalı tepe parçadaki her tepeye tıklayın. Her tepe bölgesi için kromozom koordinatlarını tıklayarak her tepe bölgesi için DNA dizilimini elde edin.Görünüm açılır menüsünde DNA'yı seçin ve Maske Yinelemeleri'ni N.Finally'a tıklatın, bu dizileri orijinal sıra dosyasıyla birlikte böşeyr ve önlemek için bunları intronic bölgeler olarak açıklama olarak ekleyin. Yüksek özgüllük ve öngörülen verimlilik puanlarıile kalan intronic bölgelerde bir sgRNA belirlemek için, CRISPOR gibi tercih edilen bir çevrimiçi sgRNA tasarım aracına gidin. İlgi intronic bölgenin sırasını girin, ilgili referans genomu belirtin ve istenilen protospacer bitişik motifi seçin.Ardından gönder'i tıklatın. Daha sonra, öngörülen sgRNA'ları özgüllük puanına göre sıralayın ve öngörülen verimlilik puanı yüksek olan bir veya daha fazla sgRNA seçin. Son olarak, sgRNA kesme alanına karşılık gelen 60 bazlık homoloji kolları ile her iki tarafta kuşatılmış bir PITT iniş pisti dizisi içeren bir DNA şablonu tasarlayın.Hedef gen baskısının tersine çevrilmesi için, homozigot yetiştirilen farelerin içme suyunda IPTG'yi, yönetim gününde steril distile suda istenilen miktarda IPTG'yi tamamen eriterek değiştirilmiş ilgi aleliyle iptg uygulayın. Şişeyi folyoyla sarın ve IPTG suyunu ışık korumalı bir şişede uygun genotip ve kontrollere sahip farelere en az bir hafta boyunca uygulayın. Hedef dokudaki ilgi geninin ekspresyonunu analiz etmeye devam edin.Gen upregülasyon indüklemek için, bir hafta boyunca diyet doksisiklin yönetmek ve hedef dokuda ilgi genin ekspresyonunu analiz etmeye devam. qRT PCR anaylisis DNMT1 ifadesinin promotör tabanlı yaklaşımı kullanarak düzensiz seviyelerin %15'ine bastırıldığını göstermiştir. Baskı, farklı miktarlarda IPTG ile farelertedavi edilerek doza bağımlı bir şekilde tersine çevrildi.Gözlenen DNMT1 baskısı ve IPTG tedavisi ile DNMT1 baskısının tersine çevrilmesi immünoboyama ile protein düzeyinde doğrulandı. mKate2 ekspresyonunun qRT PCR analizi, transkripsiyon uzaması nedeniyle transkripsiyon başlangıç bölgesinin birkaç kilobase'inde bulunan operatörlerden intron tabanlı yaklaşımın %90'dan fazla baskı elde ettiğini göstermiştir. LacIGY represörü olan veya olmayan farelerin küçük intenstine mKate2 ifadesinin konfokal görüntüleri intron tabanlı yaklaşımı doğruladı.Tat ve Lac operatör dizilimi ile modifiye endojen DNMT1 alel içeren embriyonik kök hücrelerde DNMT1 ekspresyonunun sağlam upregülasyonu ve downregülasyonu sağlandı. Her iki yönetmelik de IPTG ve Dox tedavileri ile tamamen geri dönüşümlü ve indükleyiciydi. Karaciğer, dalak ve böbrekten Güçlü DNMT1 regülasyonu gözlendi.Ancak, dmnt1 hücre döngüsüne bağlı ekspresyon deseni ve kalpte proliferatif hücrelerin azlığı bu gözlemaltında yatan olabileceğini düşündüren, kalpte tespit edilebilir bir upregulationgözlenme gözlenmiştir. Kritik bir genin in vivo işlevini, ifadesini manipüle ederek incelemek, öldürücülük nedeniyle sık sık zor olmuştur. Metodumuz, ilgi genimiz için ölümcül fenotipin üstesinden gelmemizi sağladı ve in vivo'daki tümörogenezdeki rolünü incelememizi sağladı.Aynı şekilde, bu teknoloji, incelenmesi zor olan diğer temel genlerin araştırılmasını sağlayacaktır.

Research

JoVE Journal

Genetics

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

İn Vitro Transkripsiyon Tahliller ve İlaç Keşfi Onların Uygulama

In vitro transcription assays have been developed and widely used for many years to study the molecular mechanisms involved in transcription. This process ...

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Bitki patojeni olarak genetik manipülasyonu<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; Mantar Biyoloji ve Bitki Mikrop Etkileşimleri Eğitim için

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the ...

Inducible T7 RNA Polymerase-mediated Multigene Expression System, pMGX

İndüklenebilir T7 RNA Polimeraz aracılı Çok Boylu İfade Sistemi, pMGX

Co-expression of multiple proteins is increasingly essential for synthetic biology, studying protein-protein complexes, and characterizing and harnessing ...

Controllable Ion Channel Expression through Inducible Transient Transfection

İndüklenebilir geçici transfeksiyon yoluyla kontrol edilebilir iyon kanal İfade

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be ...

Studying Cell Cycle-regulated Gene Expression by Two Complementary Cell Synchronization Protocols

Hücre Çevrimiyle Düzenlenen Gen İfadesini İki Tamamlayıcı Hücre Senkronizasyon Protokolü İle Çalışmak

The gene expression program of the cell cycle represents a critical step for understanding cell cycle-dependent processes and their role in diseases such ...

Production and Purification of Baculovirus for Gene Therapy Application

Üretim ve Baculovirus arınma gen tedavisi uygulaması için

Baculovirus has traditionally been used for the production of recombinant protein and vaccine. However, more recently, baculovirus is emerging as a ...

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans Ploitlik manipülasyon

Mechanisms that involve whole genome polyploidy play important roles in development and evolution; also, an abnormal generation of tetraploid cells has ...

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

Kök Microbiome keşfetmek: toprak, rizosferde ve kök Endosphere bakteriyel topluluk verileri ayıklama

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...

Manipulation of Gene Function in Mexican Cavefish

Meksika Cavefish işlevinde Gene manipülasyon

Cave animals provide a compelling system for investigating the evolutionary mechanisms and genetic bases underlying changes in numerous complex traits, ...

Efficient Transcriptionally Controlled Plasmid Expression System for Investigation of the Stability of mRNA Transcripts in Primary Alveolar Epithelial Cells

Primer Alveolar Epitel Hücrelerde MRNA Transkriptlerinin Kararlılığının Araştırılması için Etkili Transkripsiyonel Kontrollü Plazmid Ekspresyon Sistemi

Studying posttranscriptional regulation is fundamental to understanding the modulation of a given messenger RNA (mRNA) and its impact on cell homeostasis ...