Name: lentiviral vector platform for the efficient delivery of epigenome-editing tools into human induced pluripotent stem cell-derived disease models
Uploaded: 2019-03-29T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lentiviral Vector Platform for the Efficient Delivery of Epigenome-editing Tools into Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Disease Models at JoVE.com

تم تمويل هذا العمل جزئيا بجائزة التنمية الأعصاب خان (لقائد) والوطنية معاهد للصحة الوطنية المعهد من الاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية (المعاهد الوطنية للصحة/NINDS) (NS085011 R01 إلى قائد).

1-نظام تصميم وإنتاج فيروس
<ol><li>بلازميد التصميم والبناء ملاحظة: يتم تنفيذ بناء متجه LV-جرنة-dCas9-DNMT3A-الكل في واحد باستخدام إنتاج-والتعبير التعبير الأمثل كاسيت نشرتها أورتينسكي et al.30. كاسيت ناقلات تحمل تكرار الموقع التعرف على عامل النسخ حزمة الخدمة Sp1 وحذف الدو...

LVs قد بدأت في الظهور كالوسيلة للاختيار لتحرير ابيجينومي، لا سيما في سياق الأمراض الوراثية، ويرجع ذلك أساسا إلى قدرتها على (ط) استيعاب حمولات كبيرة من الحمض النووي و (ii) ترانسدوسي كفاءة مجموعة واسعة من تقسيم والخلايا نونديفيدينج. فعالية العبوة الكبيرة LVs مفيد بوجه خاص للتطبيقات التي تنطوي ع?...

تم وضع منصات متعددة تحرير epigenome مؤخرا لاستهداف أي تسلسل الحمض النووي في المناطق التي تتحكم في الجينات التعبير1،2. صممت أدوات تحرير epigenome الذي تم إنشاؤه ل (ط) تنظيم النسخ و (ثانيا) تغيير التعديلات هيستون بوستترانسلاشونال، (ثالثا) تعديل مثلايشن الحمض النووي و (رابعا) تعدل التفاعلات العنصر التنظيمي. النهج لربط معدلات النسخ/الكروماتين إلى Cas9 (ميتا) المعطلة (dCas9) التي أثيرت من قبل منصات التحرير epigenome المتقدمة، مثل الزنك الإصبع البروتينات (زفبس) والنسخ الشبيهة بالمنشط المستجيبة (حكايات)، إيواء مجال المستجيب النسخي قوية تنصهر (ED) إلى مجال الحمض النووي ملزم المصممة (DBD)3. ويعرف نتائج النمط الظاهري المطلوب مثل التنشيط أو القمع الجزيء المستجيب ترتكز المكاني الذاتية (الشكل 1). لإنشاء وسائل تفعيل الترانسكربتي القابلة للبرمجة، ترتبط وحدات dCas9/جرنا VP164،،من56 (الشكل 1A)، مجال تنشيط فيروسية المجندين "بول الثاني" وآلات النسخ العام. وشمل تعديل هذا النظام VP64، تيترامير VP16 المجالات، توفير إطار حتى أكثر قوة تفعيل5،معدل6. وقد استخدمت بنجاح النظام لتنشيط مناطق الترميز وفضله باستهداف العناصر التنظيمية والمروجين. الأهم من ذلك، على الرغم من أن الجزيئات VP64 مباشرة لا تقم بتعديل هيكل الكروماتين في المنطقة المستهدفة، من المجندين المعدلات الكروماتين الذي ربط النتائج في ترسب علامات النشطة (يوتشروماتين)، بما في ذلك ك acetylation H3/H4 و H3-K4 دي/ مثلايشن ثلاثي5،6. بالإضافة إلى VP64، وقد تم المربوطة الوحيدات p65 المجمع NF-κB البشرية إلى الوحدة النمطية dCas9/جرنة7. من المثير للاهتمام، يؤدي الربط هذه المستجيبة لمناطق المنبع لمواقع بدء النسخ (تحديد) وداخلها المروجين تحريض جينات قوية. ومع ذلك، يمكن أيضا ممارسة المستجيبة VP64 و p65 آثار أكتيفاتوري حين ارتباطها بالمناطق الواقعة أسفل النهر لتحديد وفي معززات القاصي7،8. للحصول على رد النسخي أكثر قوة، اندماج dCas9-VP64 أو dCas9-p65 متعددة بحاجة إلى تجنيد لهدف واحد موضع9،10. على هذا النحو، أدت التطورات الأخيرة في تفعيل الجيل القادم، التي تقوم بتجنيد العديد من المجالات المستجيب بمجمع جرنة dCas9 واحد، مثل سونتاج، أقوى تنشيط القدرة مقارنة ب نظرائهم الانصهار dCas9-VP6411 , 12-تم الحصول على تنشيط النسخي محسنة من خلال الدمج بين VP64، p65، و "هيئة الطرق والمواصلات" (VPR)، مجال transactivation من أشعة غاما-هيربيسفيروسيس، إلى ج-المحطة dCas913 (الشكل 1A). وقد وضعت نظم كريسبر/dCas9 مماثلة للقمع محددة الهدف (الشكل 1B).
يمكن تحقيق القمع الجينات الذاتية مع اندماج قامع هندسيا من خلال مجموعة متنوعة من الآليات (الشكل 1B). وقد ثبت أن نظم كريسبر/dCas9، مرتبطة قامع دبد (حتى بدون مجال المستجيب/s)، يمكن إسكات كفاءة التعبير الجيني في حين المربوطة إلى مروج أو المنبع/المتلقين للمعلومات-خدمات الدعم التقني مناطق3،6 ،14. آثار على النسخ بسبب تدخل الفراغية النسخ عامل ربط وتجهيز بوليميريز الحمض النووي الريبي. على الرغم من ذلك، يلزم اتباع نهج أكثر شمولاً، كما القمع الجينات بعائق الفراغية وحدها في كثير من الأحيان لا تكفي لإسكات صوت قوي. تطوير الجيل القادم من كواتم الصوت الأخيرة استناداً إلى نظم كريسبر/dCas9 تقل معدلات هيستون قامع النسخي المجالات (تردس)، (دي H3-K9-/مثلايشن ثلاثي، H3-K27 دي--/ثلاثي-مثلايشن؛ H3-K36 دي--/ثلاثي-مثلايشن، ديسيتيلاتيون H3/H4)، والحمض النووي (البد) مثلايشن أدت إلى بناء أدوات جينية السماح أكثر قوة إسكات آثار4،5،،من1516، 17،18،،من1920. وقد ثبت أن توظيف هذه المعدلات جينية للحمض النووي قد يؤدي إلى تشكيل أكثر الكروماتين المغلقة والمكثفة، التي عادة ما تولد من أقوى إسكات نتائج21،22. هو المجال الأكثر شيوعاً إسكات المستخدمة مع دبدس4،مربع المرتبطة كربل (KRAB)5. وقد ثبت توظيف عامل لتتوافق مع التغييرات الكروماتين؛ ومع ذلك، آليات هذه التعديلات بعد أن أوضحت16،،من1718. في الآونة الأخيرة، فقد ثبت أن إضفاء الطابع المحلي على KRAB للحمض النووي يمكن أن تعزز الجمعية methyltransferase هيستون SETDB1 والمجمعات نورد هيستون ديسيتيليشن (هداك)، مما يوحي بإمكانية أن هذه التفاعلات التوسط من أجل تشكيل التكثيف الكروماتين وإسكات النسخي3،13. كنهج بديل، يمكن أن تنصهر فيها المجالات المستجيب دبدس لخلق بروتين إسكات جينية مخصصة. مباشرة يحفز هذا النظام القمعي علامات الحمض النووي أو تعديلات هيستون.
في الآونة الأخيرة، قد تم أغراض أخرى استخدام نظم كريسبر/dCas9 الاصطناعية المربوطة للانزيم DNMT3A للتعطيل النسخي. DNMT3A يحفز مثلايشن الحمض النووي التي تمارس القمع النسخي في جميع أرجاء تشكيل heterochromatin على مروجي الجينات الذاتية والأخرى18،المناطق التنظيمية (الشكل 1B)20. وكانت ماكدونالد et al.18 وفويتا et al.20 الكتاب الأول التقرير أن مثلايشن الحمض النووي يمكن أن تستخدم لإسكات الجينات epigenome أو القمع، مما يدل على أن النظام الانصهار تسليم بلازميد dCas9-DNMT3A يمكن أن يعزز حقاً مثلايشن السيتوزين حول خدمات الدعم التقني من18،20. ماكدونالد وزملاء العمل أظهرت أن توظيف الاستراتيجية قد يؤدي انخفاض كبير (حوالي 40%) في جين ورم القامع، مستويات مرناً CDKN2A 18. وبالمثل، يظهر استهداف منطقة المروج أونميثيلاتيد الجينات باخ أو IL6ST مثلايشن البد المتزايدة التي قد تم يرتبط بانخفاض مزدوج في التعبير الجيني20. لدينا مختبر قد مؤخرا إعادة توجيه الغرض منه استخدام مثلايشن الحمض النووي لتخفيف النتائج المرضية من سنكا أوفيريكسبريشن (الشكل 2)23. ترتكز الاستراتيجية على تعزيز انتقائية في مثلايشن الحمض النووي داخل منطقة إنترون 1 سنكا ، كما أفيد سابقا أن يكون هيبوميثيلاتيد في شعبة المشتريات والخرف مع ليفي الهيئات (دلب) العقول24،25، 26. ارتبط هذا هيبوميثيليشن overexpression سنكا ، وهكذا تقدم هدفا جذاباً للتدخل العلاجي24،،من2728. نحن مؤخرا قد أظهرت انخفاض مستوى الحمض النووي مثلايشن في إنترون سنكا 1 المنطقة في الشخصيات تتميز المستمدة من هيبسك التي تم الحصول عليها من مريض PD مع تريبليكيشن سنكا 23. وميزة هذا النموذج التجريبي هو أن الشخصيات يمكن نشر قوة في الثقافة أو زيادة متباينة في الخلايا العصبية الناضجة، مما يتيح فحص كفاءة تحديد العوامل الوراثية التي تتوسط تعمل الخلوية، بما في ذلك عنصر مؤكسد الإجهاد والمبرمج29. وعلاوة على ذلك، يتيح هذا النظام النموذجي العلماء تلخيص الأحداث التنموية التي حدثت قبل ظهور الأعراض في المرضى. وبالإضافة إلى ذلك، تمثل الشخصيات المستمدة من هيبسك أداة عظيمة لاختبار مسارات الخلوية والجزيئية المرتبطة بالتعبير الجيني. الأهم من ذلك، الشخصيات المستمدة من هيبسك جنبا إلى جنب مع الدولة من أحدث التكنولوجيا كريسبر/Cas9-ابيجينومي يمكن أن يسهل وضع "المخدرات الجيل القادم" للعديد من أمراض الأعصاب.
لتقليل مستويات مرضية للتعبير سنكا، وضعنا مؤخرا نظام قائم على لينتيفيروس تحمل البروتين الانصهار dCas9-DNMT3A، وجرنة بالتحديد الهدف البد مثلايشن داخل إنترون سنكا 1 (الشكل 2A)23. وسيصف هذا البروتوكول متجه لينتيفيرال (LV) التصميم والإنتاج بالتفصيل. LVs تمثل وسيلة فعالة لتوصيل المكونات كريسبر/dCas9 لعدة أسباب، إلا وهي إدراج (ط) قدرتها على تحمل الحمض النووي الضخمة، (الثاني) كفاءة عالية لمجموعة واسعة نطاق من الخلايا، بما في ذلك الخلايا الفاصل سواء نونديفيدينج30 ترانسدوسينج ، (ثالثا) وقدرتها على حمل ردود السامة للخلايا ومكسبه الحد الأدنى. في الآونة الأخيرة، ونحن تطبيق النظام LV تتميز هيبسك المستمدة من الخلايا العصبية من مريض مع تريبليكيشن محور سنكا وأظهر إمكانات LVs العلاجية لتقديم ابيجينومي--تحرير أدوات مثلايشن23 ( الشكل 2B). في الواقع، يؤدي نظام LV-جرنة/dCas9-DNMT3A زيادة كبيرة في مثلايشن الحمض النووي في منطقة إنترون 1 سنكا . يقابل هذه الزيادة مع انخفاض مستويات سنكا مرناً والبروتين23. وعلاوة على ذلك، تنقذ downregulation سنكا المتعلقة بالمشتريات تعمل في سنكا تريبليكيشن/هيبسك-مشتقة تتميز الخلايا العصبية (مثل المتقدرية روس إنتاج الخلية من الناحيتين)23. الأهم من ذلك، أثبتنا أن التخفيض في التعبير سنكا بالنظام LV-جرنة-dCas9-DMNT3A قادر على عكس تعمل التي هي سمة مميزة للخلايا العصبية تتميز هيبسك المستمدة من مريض PD قاموا سنكا تريبليكيشن، مثل روس المتقدرية الإنتاج وخلية بقاء23. والهدف من هذا البروتوكول هو 1) لتحديد البروتوكول للإنتاج وتركيز منصة LV الأمثل لتوليد الأعمال التحضيرية الفيروسية تيتيريد عالية و 2) لوصف التفريق بين هيبسكس إلى الشخصيات منقوشة لتصبح ناضجة تتميز 31،الخلايا العصبية32 وتوصيف مستويات مثلايشن المنطقة المستهدفة داخل سنكا إنترون 1.
منصات لينتيفيرال لها ميزة كبيرة على منصة ناقلات الأكثر شعبية، إلا وهي المرتبطة بالغدد ناقلات (آفس)، الذي هو في السابق القدرة على استيعاب أكبر إدراج الوراثية33،34. آفس يمكن أن تتولد في غلات أعلى بكثير ولكن تملك قدرة تغليف منخفضة (< 4.8 كيلو بايت)، المساس باستخدامها لإيصال نظم كريسبر/Cas9 الكل في واحد. وهكذا، يبدو أن LVs المنصة الاختيار في التطبيقات المشتركة في تقديم أدوات كريسبر/dCas9. ولذلك، سوف يكون البروتوكول الواردة هنا أداة قيمة للباحثين ورغبة منها في فعالية تسليم المكونات ابيجينومي--تحرير الخلايا والأجهزة. ويحدد البروتوكول كذلك الاستراتيجية الرامية إلى زيادة قدرات الإنتاج والتعبير لناقلات المرض عن طريق تعديل في رابطة الدول المستقلة من العناصر داخل ناقلات التعبير كاسيت30،35. وتقوم الاستراتيجية على الرواية النظام المتقدمة ودراستها في المختبر لدينا ويسلط الضوء على قدرته على إنتاج الجزيئات الفيروسية في نطاق/mL الوحدات الفيروسية (فو)10 1030،35.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima XPN-80 Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A99839</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;M filter unit, 1L</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45-&#956;m filter unit, 500mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100mm TC-Treated Culture Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mm TC-Treated Cell Culture dishes with 20 mm Grid</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aggrewell 800</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>34811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allegra 25R tabletop centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>369434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACS</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>338960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical bottom ultracentrifugation tubes</td>
			<td>Seton Scientific</td>
			<td>5067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tube adapters</td>
			<td>Seton Scientific</td>
			<td>PN 4230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Cell Imaging Slides</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30742060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-binding 96-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3366</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted fluorescence microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DM IRB2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit (50)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reversible Strainer</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>27215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW32Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>369650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR&#174; Disposable Serological Pipets, Glass, Nonpyrogenic</td>
			<td>VWR</td>
			<td>93000-694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR&#174; Vacuum Filtration Systems</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89220-694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xMark&#8482; Microplate Absorbance plate reader</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1681150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human embryonic kidney 293T (HEK 293T) cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>7920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Adherence Rinsing Solution</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>7010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-FOXA2 Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab60721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Nestin Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab18102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-antimycotic solution, 100X</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5955-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X), minus vitamin A</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B9879 - BES</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Albumin Fraction V (7.5% solution)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15260037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>72052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Matrigel hESC-Qualified Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>08-774-552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cosmic Calf Serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30087.04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-719</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNeasy Blood &#38; Tissue Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EpiTect PCR Control DNA Set</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>596945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ DNA Methylation Kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D5001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G1800-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15750078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentle Cell Dissociation Reagent</td>
			<td>stemCell Technologies</td>
			<td>7174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Recombinant bFGF</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>78003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Recombinant&#160;EGF</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>78006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Recombinant Shh (C24II)</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>78065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>85850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17502001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Essential Amino Acid (NEAA)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30087.04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyroMark PCR Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>978703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 media</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>72232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S8636-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STEMdiff&#160;Neural Induction Medium</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>5835</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STEMdiff Neural Progenitor Freezing Medium</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>5838</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Assay FOXA2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Hs00232764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Assay GAPDH</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Hs99999905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Assay Nestin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Hs04187831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Assay OCT4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Hs04260367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Assay PPIA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Hs99999904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA 0.05%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y27632</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>72302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p24 ELISA reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal anti-p24 antibody</td>
			<td>NIH AIDS Research and Reference Reagent Program</td>
			<td>3537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit horseradish peroxidase IgG</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>12-348</td>
			<td>Working concentration 1:1500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum, Sterile, 10mL</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9023</td>
			<td>Working concentration 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIV-1 standards</td>
			<td>NIH AIDS Research and Reference Reagent Program</td>
			<td>SP968F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal mouse serum, Sterile, 500mL</td>
			<td>Equitech-Bio</td>
			<td>SM30-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal rabbit anti-p24 antibody</td>
			<td>NIH AIDS Research and Reference Reagent Program</td>
			<td>SP451T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMB peroxidase substrate</td>
			<td>KPL</td>
			<td>5120-0076</td>
			<td>Working concentration 1:10,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMD2.G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRSV-Rev</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>52961</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>psPAX2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction enzymes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BsmBI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0580S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BsrGI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0575S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRV</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0195S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KpnI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0142S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PacI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0547S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SphI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0182S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lentiviral vector platform for the efficient delivery of epigenome-editing tools into human induced pluripotent stem cell-derived disease models

ويمثل استخدام الخلايا المشتقة من هيبسك نهجاً قيماً لدراسة أمراض الأعصاب البشرية. وهنا، يمكننا وصف بروتوكولا أمثل للتفريق بين هيبسكس المستمدة من مريض مع تريبليكاتيون موضع الجينات (سنكا) ألفا سينوكلين في مرض باركنسون (PD)-السكان العصبية تتميز ذات الصلة. تتراكم الأدلة أظهرت أن مستويات عالية من سنكا المسببة لتطوير النادي واعترافاً بالحاجة غير المستوفاة إنشاء نهج علاجية جديدة لشعبة المشتريات، وبخاصة تلك التي تستهدف تنظيم التعبير سنكا ، ونحن وضعت مؤخرا كريسبر/dCas9 الحمض النووي-مثلايشن-نظام يستند ابيجينيتيكالي تعدل النسخ سنكا بإثراء مستويات مثلايشن في المنطقة التنظيمية إنترون 1 سنكا . لتسليم النظام، تتألف من القتلى الإصدار (المعطلة) من Cas9 (dCas9) تنصهر مع المجال الحفاز من 3A الإنزيم ميثيلترانسفيراسي الحمض النووي (DNMT3A)، يستخدم ناقل لينتيفيرال. هذا النظام يطبق على الخلايا التي تحتوي تريبليكيشن محور سنكا ويقلل من سنكا-مرناً ومستويات البروتين بحوالي 30% من خلال مثلايشن الحمض النووي المستهدف من سنكا إنترون 1. Downregulation صقل مستويات سنكا تنقذ تعمل الخلوية المتعلقة بالمرض. في البروتوكول الحالي، ونحن نهدف إلى وصف إجراء خطوة بخطوة للتفرقة بين هيبسكس في الخلايا العصبية السلف (الشخصيات)، وإنشاء والتحقق من صحة من فحوصات بيروسيكوينسينج لتقييم الشخصية مثلايشن في سنكا إنترون 1. لإنشاء مخطط تفصيلي بمزيد من التفصيل في منظومة lentivirus-كريسبر/dCas9 المستخدمة في هذه التجارب، يصف هذا البروتوكول كيفية إنتاج وتنقية وتركيز ناقلات لينتيفيرال وتسليط الضوء على ملاءمتها لاستخدام تطبيقات تحرير ابيجينومي والجينوم هيبسكس والشخصيات. البروتوكول قابل للتكيف بسهولة ويمكن استخدامها لإنتاج لينتيفيروسيس عيار عالية لتطبيقات في المختبر والمجراه.

التحقق من صحة التتر الإنتاج موجهات LV-dCas9-DNMT3A-بروتينات فلورية خضراء/بورو مقارنة بنظيره بروتينات فلورية خضراء ساذجة
أجرينا p24اسكت أليسا لمقارنة بين التتر المادية من LV-dCas9-DNMT3A-بروتينات فلورية خضراء/بورو مع نظرائهم بروتينات فل...

Watch this Scientific Journal Video about Lentiviral Vector Platform for the Efficient Delivery of Epigenome-editing Tools into Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Disease Models at JoVE.com

Lentiviral Vector Platform for the Efficient Delivery of Epigenome-editing Tools into Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Disease Models

واستهدفت epigenome الحمض النووي يمثل تحرير نهج علاجية قوية. يصف هذا البروتوكول إنتاج وتنقية، وتركيز ناقلات لينتيفيرال الكل في واحد إيواء التحوير كريسبر-dCas9-DNMT3A لتطبيقات تحرير ابيجينومي في الخلايا الجذعية البشرية المستحثة pluripotent (هيبسك)-المستمدة من الخلايا العصبية.

منهاج متجه لينتيفيرال الكفاءة في تقديم أدوات تحرير ابيجينومي إلى الإنسان الناجمة عن نماذج المرض المستمدة من الخلايا الجذعية Pluripotent

The use of hiPSC-derived cells represents a valuable approach to study human neurodegenerative diseases. Here, we describe an optimized protocol for the ...

نظام النواة متجه العدستية لديها ميزة كبيرة على منصة ناقلات الأكثر شعبية، وتحديدا بسبب قدرة ناقلات العدسي الفيروسية لاستيعاب إدراج أكبر الوراثية. وهكذا، يبدو أن ناقل العدسي الفيروسي سيكون منصة الاختيار في التطبيق تنطوي على تسليم CRISPR / أدوات كاس. هذه التقنية تقليد الآلية التنظيمية الطبيعية للتعبير ألفا-سينوكلين التي عندما تضعف ترتبط مع المرض.وهو يسمح بصقل مستوى التعبير مقابل التغيرات القوية في التعبير الجيني. أود أن أوصي بشدة التحقق من صحة هذا النهج أو ما شابه ذلك باستخدام RNAs دليل متعددة للفحص. هناك قدر كبير من التقلبات في قوة RNA دليل.والطريقة الوحيدة لتحديد ذلك هو وجود فحص قوي وشامل والتحقق من الصحة. ويمكن بسهولة تكييف النظام المطور مع أنظمة نموذجية أخرى مثل النماذج الحيوانية بما في ذلك القوارض والرئيسات غير البشرية. هذه المتابعة يمكن أن تكون بمثابة دليل على مفهوم الدراسات السريرية في المستقبل.وسوف يكون إثبات الإجراء الدكتور إيكاترينا Ilich، وهو موظف كبير في مختبري، مع التركيز على تنفيذ إجراء الاستنساخ الجزيئي لإنشاء بلاسميدس ناقل لينتيفيرال ذات الصلة بهذا المشروع. وقالت انها سوف تظهر أيضا الخطوات الرئيسية التي ينطوي عليها إنتاج ناقلات العدين الفيروسية. كما سيتم إثبات الإجراء سيكون الدكتور ليديا Tagliafierro، وهو ما بعد الدكتوراه من مختبري مع التركيز على تمايز خلايا iPS البشرية إلى الخلايا المرضية ذات الصلة.وقالت انها سوف تظهر الخطوات الرئيسية في إنشاء المقايسات لتقييم ملامح الميثيل من synuclein intron1. Ahila Sriskanda ، وهو موظف في مختبري مع التركيز على ثقافة الخلايا الجذعية الخلايا العصبية المشتقة من iPS الإنسان. للبدء، تطوير المجال الحفاز DNMT3A من d-Cas9-DNMT3A-GFP عن طريق تضخيم جزء DNMT3A من المتجه.بعد هضم جزء DNMT3A باستخدام إنزيم تقييد BAMH1. Cloat في موقع BamH1 من ناقلات PBK-301 المعدلة التي تحمل د-Cas9 والتحقق منها من قبل تسلسل سانجر المباشر، لتحل محل الجين مراسل Meissen النقي وbasmid الناتجة مع GFP هضم د-Cas9-DNMT3A-P2A ميسين نقية وبلازميد مع FSC 1. تنقية الجزء المتجه باستخدام طريقة تنقية هلام.إعداد إدراج عن طريق هضم PBK-201 مع FSC-1. استنساخ 1 FSC جزء في ناقلات لإنشاء d-Cas9-DNMT3A-P2A-GFP. معطف 15 سم مع 0.2٪ الجيلاتين لtransfefection وانتظر لمدة 10 دقائق.ثم pirate الجيلاتين وإضافة 22.5 ملليلتر من ارتفاع الجلوكوز المتوسطة و 2.5 ملليلتر من سابقا مثقف HEK-293T تعليق الخلية. احتضان لوحات في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 حتى تصل إلى 70 إلى 80٪ التقاء. لتحضير مزيج البلازمي يكفي لصفيحة 115 سنتيمتر استخدم البلازميدات الأربعة الموصوفة في المخطوطة.إضافة 312.5 ميكرو لتر من كلورايد الكالسيوم الضرس واحد إلى نفس أنبوب 15 ملليلتر مع البلازميدات وتقديم الحجم النهائي إلى 1.25 ملليلتر باستخدام الماء المقطر المزدوج العقيمة. إضافة بلطف 1.25 ملليلتر من اثنين من حل BBM X إسقاط الحكمة إلى أنبوب أثناء دوامة. احتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.التعرق المتوسطة من الخلايا وإضافة 22.5 ملليلتر من DMEM عالية الجلوكوز أعدت طازجة دون المصل. إضافة 2.5 ملليلتر من الخليط transfection قطرة الحكمة إلى كل لوحة. دوامة لوحات واحتضان في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 لمدة ساعتين إلى ثلاث ساعات بعد الحضانة إضافة 2.5 ملليلتر من المصل لكل لوحة لتحقيق 10٪ تخفيف واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2.لحصاد الفيروس جمع نابير من جميع الخلايا المصابة وسحبها في أنابيب مخروطية 50 ملليلتر. جهاز طرد مركزي في 400 إلى 450 غرام لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة ومن ثم تصفية فائقة من خلال 0.45 وحدة تصفية فراغ ميكرومتر. المقبل إنشاء التدرج السكروز عن طريق إعداد أنابيب مخروطية فائقة الطرد المركزي.إضافة بعناية عظمى المصفاة إلى التدرج عن طريق توزيع على قدم المساواة فائقة الفيروسية بين كل أنبوب الطرد المركزي جدا ملء ما لا يقل عن ثلاثة أرباع كل أنبوب. أجهزة الطرد المركزي العينات في 70000 غرام لمدة ساعتين في 17 درجة مئوية. جمع بلطف 30٪ إلى 60٪ كسور السكروز في أنابيب نظيفة إضافة 1X PBS الباردة تصل إلى 100 ملليلتر من الحجم الإجمالي والماصات عدة مرات لخلط.إضافة بعناية أربعة ملليلتر من 20٪ السكروز في 1X PBS إلى كل أنبوب لتطنيج إعداد الفيروسية تستمر عن طريق الأنابيب ما يقرب من 20 إلى 25 ملليلتر من الحل الفيروسي لكل أنبوب. توازن بعناية الأنابيب ثم الطرد المركزي في 70000 غرام لمدة ساعتين في 17 درجة مئوية. التعرق بعناية السائل المتبقي لإزالة تماما كل السائل ترك الفيروس التي تحتوي على الكريات التي تكاد تكون مرئية كما البقع شفافة صغيرة.بعد إفراغ المناط قلب الأنابيب على المناشف الورقية للسماح السائل المتبقية لاستنزاف. إضافة 70 لتراً من 1X PBS إلى الأنبوب الأول وماصات جيداً لإعادة تعليق بيليه. نقل التعليق إلى أنبوب المقبل وتكرار مع الأنابيب ونقل حتى يتم إعادة تعليق جميع الكريات.إضافة 50 ميكرو لتر إضافي من 1X PBS إلى الأنبوب الأول ومزيج لغسله. ثم نقل التعليق إلى أنبوب الثاني لغسل والاستمرار مع الغسيل ونقل كما كان سابقا، مما أسفر عن ما يقرب من 120 لترا من الحليبي تعليق النهائي قليلا. جهاز طرد مركزي في 10000 غرام لمدة 60 ثانية للحصول على تعليق واضح نقل supernatant إلى أنبوب جديد وجعل خمسة ميكرو لتر aliquot وتخزينها في السلبية 80 درجة مئوية مكان كريبوفيال مع MD NPC في كتلة الحرارة 37 درجة مئوية لمدة دقيقتين ونقل الخلايا المذابة إلى أنبوب مخروطي 15 ملليلتر مع 10 ملليلتر من 10MEM-F12 دافئ.جهاز طرد مركزي في 300 غرام لمدة خمس دقائق. استلهمت من فوق و إعادة تعليق الخلايا في مليلترين من قبل تدفئة كاملة N2B2 المتوسطة. إضافة ملليلترين من N2B27 إلى تعليق الخلية ولوحة مليلترين من الخلايا في كل بئر من BMM أعدت سابقا ستة لوحة جيدا.احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 بين عشية وضحاها. عندما MD NPCs هي في التقاء 70٪، transduce لهم بإضافة لترين من فيروس العدس دليل رنا د-Cas9-DNMT3A ودوامة بلطف لوحة. بعد احتضان الخلايا في نفس الظروف كما كان سابقا لمدة 16 ساعة استبدال N2B27 المتوسطة 48 ساعة بعد النقل.إضافة N2B27 مع خمسة ميكروغرام لكل ملليلتر من Meissen نقية للحصول على خطوط المجلس الوطني الديمقراطي مستقرة، وتنمو الخلايا لمدة ثلاثة أسابيع في N2B27 بالإضافة إلى Meissen نقية لتوصيف ملف تعريف الميثيل من SNCA intron 1. استخراج الحمض النووي أولا من كل خط خلية محول مستقر باستخدام عدة استخراج الحمض النووي، ثم استخدام 800 نانوغرام من الحمض النووي لإجراء تحويل ثنائي الكبريت مع مجموعة متاحة تجاريا ومن ثم تحويل الحمض النووي ثنائي السلفيد إلى 20 نانوغرام لكل لتر صغير. لتحليل تسلسل البيرو إعداد المزيج الرئيسي PCR في نواة أنبوب حر نقل لوحة التفاعل إلى دورة حرارية وبدء PCR.تصور amplicons باستخدام لترين من الدقيقة من المنتج PCR مع 30 وبروميد تلطيخ بعد Agarose هلام electrophoresis. بالنسبة لمقايسات تسلسل البرواني المستخدمة في خليط من غير الميثيلية والميثيلات بالكبريتيد المحول DNAs والكواشف ذات التسلسل البرواني كما هو موضح في المخطوطة. حساب قيم المثيل لكل موقع CPG باستخدام البيرو تسلسل الإنتاجية المادية لبرنامج العدط d-Cas9-DMMT3A-GFP ناقلات وناقل GFP السذاجة التي تم إنشاؤها باستخدام هذا البروتوكول قابلة للمقارنة.وهذا يشير إلى أن فائدة العمود الفقري للمتجه الأمثل جنبا إلى جنب مع بروتوكول الإنتاج الأمثل النتائج في غلة عالية أكثر إحكاما من ناقلات كريسبر-dCas9 معدلات النقل من ناقلات العدط d-Cas9-DNMT3 GFP ناقلات كان أربع مرات أقل من أن من الناقل GFP السذاجة مما يشير إلى أن كفاءة التعبئة والتغليف من CRISPR د-Cas9-RNA يتم تخفيض. وكانت معدلات النقل من متجه PURO السذاجة خمسة أضعاف أعلى بالمقارنة مع D-Cas9-DNMT3A ناقلات. وقد تأكدت هذه النتائج أيضاً باستخدام برنامج السذاجة GFP و D-Cas9-DNMT3A-GFP.البروتوكول المستندة إلى EB الموصوف هنا يسمح بالتمايز بين مراكز MD NPCs. أعرب hiPSCs عن علامة قوة المتعة Oct4 في حين يتم التعبير عن MD NPC على حد سواء نستين وفوإكسا2. صُممت سبع عمليات فحص تسلسلية لبيرو وتم التحقق من صحتها لتحديد كمي حالة المثيل في SNCA intron 1.تم التحقق من صحة جميع 7 المقايسات وأظهرت الارتباط الخطي، وذلك باستخدام المقايسات التحقق من صحة كان من الممكن لتحديد مستويات المثيل في 23 CPGs في إنترون SNCA 1 أهم شيء أن نتذكر من حضور هذا الإجراء هو العمل مع الخلايا التي تظهر النمو السليم والصحة لضمان الاتساق عبر التجارب. إنتاج ناقلات العدس أبرز في هذا العرض يمكن اعتمادها بسهولة لإنتاج التكاملات نقص مكافحة الفيروسات كما أنه يمكن أيضا أن يكون بسهولة توسيع لتوليد كميات أكبر أو ناقلات أكثر تركيزا. هذه التقنية يمكن أن تمهد الطريق لاستكشاف الأثر الممرض للجينات إلغاء التنظيم على العمر ذات الصلة ولا الاضطرابات التوليدية بما في ذلك مرض الزهايمر والخرف ذات الصلة.ميزة ناقلات العدس تتطور هنا هو أنه ليس خطر أو ليس ناقلات العدس المعدية لها تأثير ضئيل فقط على دورة الخلية انهم منصة تسليم آمنة وموثوق بها لتطبيقات العلاج الجيني.

Research

JoVE Journal

Genetics

Systemic Delivery of MicroRNA Using Recombinant Adeno-associated Virus Serotype 9 to Treat Neuromuscular Diseases in Rodents

منهجية تقديم ميكرورنا باستخدام النمط المصلي المسيطر المؤتلف الفيروسات المرتبطة بالغدة 9 لعلاج الأمراض العصبية العضلية في القوارض

RNA interference via the endogenous miRNA pathway regulates gene expression by controlling protein synthesis through post-transcriptional gene silencing. ...

An Array-based Comparative Genomic Hybridization Platform for Efficient Detection of Copy Number Variations in Fast Neutron-induced Medicago truncatula Mutants

An Array-based Comparative Genomic Hybridization Platform for Efficient Detection of Copy Number Variations in Fast Neutron-induced Medicago truncatula Mutants

المستندة إلى صفيف "مقارنة الجينوم التهجين منصة" "الكشف عن كفاءة من نسخ عدد الاختلافات" في طفرات "سريعة النيوترون" المستحثة فصة برميلية

Mutants are invaluable genetic resources for gene function studies. To generate mutant collections, three types of mutagens can be utilized, including ...

A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells

بروتوكول لإنتاج ناقلات لينتيفيرال إينتيجراسي التي تفتقر لخروج المغلوب كريسبر/Cas9-بوساطة الجينات في تقسيم الخلايا

Lentiviral vectors are an ideal choice for delivering gene-editing components to cells due to their capacity for stably transducing a broad range of cells ...

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Microinjection الأجنة وتقنية زرع "التلاعب الجينوم" فيتريبينيس ناسونيا

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

تعطيل الجينات ذات كفاءة عالية من الخلايا السلف مورين والبشرية المكونة للدم قبل كريسبر/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

Lentiviral Mediated Production of Transgenic Mice: A Simple and Highly Efficient Method for Direct Study of Founders

لينتيفيرال توسط إنتاج فئران المحورة وراثيا: طريقة بسيطة وذات كفاءة عالية للدراسة مباشرة من مؤسسي

For almost 40 years, pronuclear DNA injection represents the standard method to generate transgenic mice with random integration of transgenes. Such a ...

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

عزل وتوصيف والمستندة إلى MicroRNA التحوير الوراثي للخلايا الجذعية البشرية جريب طب الأسنان

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

البروتين الذاتية في الإنسان التي يسببها الخلايا الجذعية Pluripotent باستخدام كريسبر/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

Isolating, Sequencing and Analyzing Extracellular MicroRNAs from Human Mesenchymal Stem Cells

عزل، وتسلسلها، وتحليل MicroRNAs خارج الخلية من الخلايا الجذعية البشرية الوسيطة

Extracellular and circulating RNAs (exRNA) are produced by many cell types of the body and exist in numerous bodily fluids such as saliva, plasma, serum, ...

Lentiviral Mediated Gene Silencing in Human Pseudoislet Prepared in Low Attachment Plates

لينتيفيروسي تسكت الجينات بوساطة في الزائفة البشرية أعدت في لوحات مرفق منخفضة

Various genetic tools are available to modulate genes in pancreatic islets of rodents to dissect function of islet genes for diabetes research. However, ...