Name: lentiviral vector platform for the efficient delivery of epigenome-editing tools into human induced pluripotent stem cell-derived disease models
Uploaded: 2019-03-29T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lentiviral Vector Platform for the Efficient Delivery of Epigenome-editing Tools into Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Disease Models at JoVE.com

这项工作的部分资金来自卡恩神经技术发展奖 (致 o. c.) 和国家健康研究所/国家神经疾病和中风研究所 (NIH/NDS) (r01 NS085011 至 o. c.)。

1. 系统设计和病毒生产
<ol><li>质粒设计与制造 请注意:利用 Ortinski 等人出版的生产和表达优化表达盒, 构建了一体机 Lv-grna-dna-dnt3a 矢量.矢量盒式磁带带有转录因子 sp1 的识别点的重复, 并在 3 ' 长的终端重复 (ltr) (ltr) (图 2a) 30、36的未翻译 (u3 ')区域内进行最先进的删除。病媒主干已被?...

Lv 已开始成为表观基因组编辑的首选载体, 特别是在遗传疾病的情况下, 主要是因为它们能够 (i) 容纳大量 DNA 有效载荷和 (ii) 有效地传输广泛的分裂和非分裂细胞。Lv 的大包装功效尤其适用于涉及超大尺寸 Crispr/cas9 系统包装的应用。从这个角度来看, Lv 代表了交付一体机 CRISPR/Cas9 系统的首选平台。事实上, AAV 平台, 这是通常用于临床前和临床基因治疗应用, 并不完全能够容纳大尺寸的 dCas9 效应系?...

最近开发了多个表观基因组编辑平台, 针对控制基因表达1,2的区域中的任何 dna 序列。创建的表观基因组编辑工具旨在 (i) 调节转录, (ii) 改变翻译后组蛋白修饰, (iii) 修改 DNA 甲基化, (四) 调节调控元素相互作用。将转录-染色质改性剂固定到从以前开发的表观基因编辑平台 (如锌指蛋白 (Zfp) 和转录激活剂 (Tals) 中提出的失活 (死) Cas9 (Dcas9) 的方法,具有强大的转录效应域 (ED) 融合到设计的 dna 结合域 (DBD)3。所需表型 (如激活或抑制) 的结果由锚定在内源位点上的效应分子定义 (图 1)。为了创建可编程转录激活剂, dcas9/grna 模块与 vp164、5、6 (图 1a) 相连, 这是一个病毒激活域, 它招募了 pol ii 和一般转录机制。该系统的修改包括 vp64, vp16 域的四聚体, 提供了更强大的激活率5,6。该系统已成功地用于通过定位促进者和调控元素激活编码和非编码区域。重要的是, 尽管 VP64 分子不会直接改变目标区域中的染色质结构, 但它会招募染色质改性剂, 从而结合活性 (染色质) 标记的沉积, 包括 hh/H4 乙酰化和 H3-k4 二/三甲基化5,6。除 VP64 外, 人类 nf-b 复合体的 p65 亚基还与 dCas9/gRNA 模块7相连。有趣的是, 这些效应因子与转录起始位点 (Tss) 上游区域和启动子内的连接会导致强基因诱导。然而, vp64 和 p65 效应器也可以发挥激活作用, 同时与位于 tss 下游和远端增强器7,8的区域相连。为了获得更有力的转录反应, 需要招募多个 dcas9-vp64 或 dcas9-p65 融合到一个单一的目标位点9,10。因此, 与 Dcas9-vp64 融合对应者相比, 最近开发的下一代激活器通过 suntag 等单个 Dcas9-grna 复合体招募多个效应域,从而提高了激活能力11,12. 通过将 vp64、P65 和 RTA (vpr)----从γ-疱疹病毒到 dcas9 13 c-末端的转激活域----融合在一起, 获得了更好的转录激活 (图 1 a)。为针对具体目标的镇压开发了类似的 Crispr/cas9 系统 (图 1b)。
内源基因抑制可以通过工程抑制融合通过各种机制实现 (图 1b)。已经证明, crispr/dcas9 系统与抑制 dbd 相连 (即使没有效应因子 domain s), 可以有效地沉默基因表达, 同时与启动子或上流-向下-tss 区域3,6 ,14。转录因子结合和 RNA 聚合酶处理对转录的影响是由类固醇干扰引起的。然而, 需要更全面的方法, 因为仅仅通过位块来抑制基因往往不足以进行强有力的沉默。基于 Crispr/cas9 系统的消音器的最新发展, 该系统具有转录抑制域 (Trd)、组蛋白修饰剂 (H3-k9-Di-t"甲基化、H3-k27----三甲基化;h3-k36-/三甲基化, h h4 去乙酰化) 和 dna (cpg) 甲基化导致表观遗传工具的构建, 允许更强大的沉默效果4,5,15,16, 17,18,19,20。已经证明, 这些表观遗传修饰剂的制备 dna 可能会导致形成更封闭和浓缩的染色质, 这通常会产生更有效的沉默结果21,22。dbd 最常用的静音域是与 Krüppel-associated 的盒子 (krab)4,5。该因子的招募已被证明与染色质的变化相对应;然而, 这些修改的机制还有待阐明 16、17、18。最近, 已经证明, KRAB 定位 DNA 可以促进组蛋白甲基转移酶 SETDB1 和组蛋白去乙酰化 (HDAC) NuRD 复合物的组装, 这表明这些相互作用介导形成的可能性。染色质凝结和转录沉默3,13。作为另一种方法, 效应域可以与 Dbd 融合, 以创建自定义表观遗传沉默蛋白。该系统直接催化抑制性 DNA 标记或组蛋白修饰。
最近, 使用与 DNMT3A 酶结合的合成 Crispr/cas9 系统已被重新用于转录失活。dnmt3a 催化 dna 甲基化, 在内源性基因启动子和其他调控区域异染色质形成过程中进行转录抑制 (图 1b)18、20。McDonald等人, 18岁和 vojta等人, 是第一个报告 dna 甲基化可用于表观基因沉默或抑制的作者, 这表明等离子体交付的 dcas9-dnmt3a 融合系统可以有效地增强胞嘧啶甲基化在 tss18,20附近。麦当劳和同事证明, 该战略的使用可能会导致大幅减少 (约 40%)在肿瘤抑制基因中, CDKN2A mrna 水平为 18。同样, 针对bach或il6st基因的非甲基化启动子区域显示 cpg 甲基化增加, 这与基因表达20的两倍减少有关.我们的实验室最近重新使用 DNA 甲基化来减轻Snca过度表达的病理结果 (图 2)23。该策略的基础是选择性增强snca内含子1区域内的 dna 甲基化, 因为它以前曾报道过在 pd 和痴呆与莱维体 (dlb) 大脑24,25的低甲基化, 26岁这种低甲基化与snca过度表达有关, 从而为治疗干预提供了一个有吸引力的目标 24,27,28。我们最近在 hpscc 衍生的多巴胺能 npc 中的 Snca 内含子1区域中显示了低 DNA 甲基化水平, 这些 Nbc 是从一个患有 snca三联23的 pd 患者获得的. 这种实验模型的优点是, Npc 可以在培养中有力地繁殖或进一步分化为成熟的神经元, 从而能够有效地筛选, 以识别调节细胞表型的遗传因素, 包括氧化压力和细胞凋亡29。此外, 该模型系统使科学家能够重述患者症状出现前发生的发育事件。此外, hpsc 衍生的 Npc 是测试与基因表达相关的细胞和分子途径的重要工具。重要的是, hepc 衍生的 Npc 与最先进的 Crisprus-epigenome 技术相结合, 可以极大地促进许多神经退行性疾病的 "下一代药物" 的开发。
为了降低 SNCA 表达的病理水平, 我们最近开发了一个基于慢病毒的系统, 该系统携带了 DCAS9-DNMT3A 融合蛋白和 gRNA, 专门针对Snca内含子 1 (图 2a)中的 cpg 甲基化。该协议将详细描述慢病毒载体 (LV) 的设计和生产。Lv 是提供 Crispr/cas9 成分的有效手段, 原因有几个, 即: (一) 它们携带笨重 DNA 插入物的能力, (ii) 高效地传输广泛的细胞, 包括分裂和不分割细胞30和 (iii) 它们诱导最小细胞毒性和免疫原性反应的能力。最近, 我们将 LV 系统应用于具有 Snca位点的复用的患者的 hepc 衍生多巴胺能神经元, 并演示了 lv 在提供表观基因组编辑甲基化工具方面的治疗潜力 23 (图 2 b)。事实上, Lv-grna/dnt3a 系统会导致 Snca 内ss1 区域的 DNA 甲基化显著增加。这一增加与Snca mrna 和蛋白质23水平的降低相对应。此外, snca下调还将相关的表型恢复在snca三联/hipc 衍生的多巴胺能神经元 (例如, 线粒体 ros 的产生和细胞活力)23。重要的是, 我们证明了 Lv-grna-dnas3a 系统在 Snca 表达中的减少能够逆转 Hipc 衍生的多巴胺能神经元的表型, 而这些表型是 hipc 衍生的多巴胺能神经元的特征。SNCA三联, 如线粒体 ros 的产生和细胞活力23。本协议的目的是: 1) 概述用于生成高分病毒制剂的优化 LV 平台的生产和浓缩协议; 2) 描述 Hipsc 向 npc 的分化, 这些差异化模式是成熟的多巴胺能神经元31,32 和描述的甲基化水平的目标区域内 snca 内合子1。
与最流行的载体平台, 即腺相关载体 (aav) 相比, 慢病毒平台具有主要优势, 后者是前者容纳更大的基因插入33、34 的能力。Aav 的产量可以高得多, 但包装能力很低 (lt;4.8 kb), 这影响了其在提供一体机 CRISPR/Cas9 系统方面的使用。因此, 在交付 Crispr/cas9 工具所涉及的应用程序中, Lv 似乎是首选平台。因此, 这里概述的协议将是一个宝贵的工具, 研究人员希望有效地提供表观基因组编辑组件的细胞和器官。该协议进一步概述了通过修改矢量表达盒 30、35中的元素来增加向量的生产和表达能力的策略。该战略以我们实验室开发和研究的新系统为基础, 突出了其在 1010个病毒单位 (vu)/30,35范围内产生病毒颗粒的能力。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima XPN-80 Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A99839</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;M filter unit, 1L</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45-&#956;m filter unit, 500mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100mm TC-Treated Culture Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mm TC-Treated Cell Culture dishes with 20 mm Grid</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aggrewell 800</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>34811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allegra 25R tabletop centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>369434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACS</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>338960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical bottom ultracentrifugation tubes</td>
			<td>Seton Scientific</td>
			<td>5067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tube adapters</td>
			<td>Seton Scientific</td>
			<td>PN 4230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Cell Imaging Slides</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30742060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-binding 96-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3366</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted fluorescence microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DM IRB2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit (50)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reversible Strainer</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>27215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW32Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>369650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR&#174; Disposable Serological Pipets, Glass, Nonpyrogenic</td>
			<td>VWR</td>
			<td>93000-694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR&#174; Vacuum Filtration Systems</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89220-694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xMark&#8482; Microplate Absorbance plate reader</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1681150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human embryonic kidney 293T (HEK 293T) cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>7920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Adherence Rinsing Solution</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>7010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-FOXA2 Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab60721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Nestin Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab18102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-antimycotic solution, 100X</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5955-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X), minus vitamin A</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B9879 - BES</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Albumin Fraction V (7.5% solution)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15260037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>72052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Matrigel hESC-Qualified Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>08-774-552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cosmic Calf Serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30087.04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-719</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNeasy Blood &#38; Tissue Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EpiTect PCR Control DNA Set</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>596945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ DNA Methylation Kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D5001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G1800-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15750078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentle Cell Dissociation Reagent</td>
			<td>stemCell Technologies</td>
			<td>7174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Recombinant bFGF</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>78003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Recombinant&#160;EGF</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>78006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Recombinant Shh (C24II)</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>78065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>85850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17502001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Essential Amino Acid (NEAA)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30087.04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyroMark PCR Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>978703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 media</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>72232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S8636-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STEMdiff&#160;Neural Induction Medium</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>5835</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STEMdiff Neural Progenitor Freezing Medium</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>5838</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Assay FOXA2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Hs00232764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Assay GAPDH</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Hs99999905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Assay Nestin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Hs04187831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Assay OCT4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Hs04260367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Assay PPIA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Hs99999904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA 0.05%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y27632</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>72302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p24 ELISA reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal anti-p24 antibody</td>
			<td>NIH AIDS Research and Reference Reagent Program</td>
			<td>3537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit horseradish peroxidase IgG</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>12-348</td>
			<td>Working concentration 1:1500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum, Sterile, 10mL</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9023</td>
			<td>Working concentration 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIV-1 standards</td>
			<td>NIH AIDS Research and Reference Reagent Program</td>
			<td>SP968F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal mouse serum, Sterile, 500mL</td>
			<td>Equitech-Bio</td>
			<td>SM30-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal rabbit anti-p24 antibody</td>
			<td>NIH AIDS Research and Reference Reagent Program</td>
			<td>SP451T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMB peroxidase substrate</td>
			<td>KPL</td>
			<td>5120-0076</td>
			<td>Working concentration 1:10,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMD2.G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRSV-Rev</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>52961</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>psPAX2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction enzymes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BsmBI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0580S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BsrGI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0575S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRV</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0195S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KpnI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0142S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PacI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0547S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SphI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0182S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lentiviral vector platform for the efficient delivery of epigenome-editing tools into human induced pluripotent stem cell-derived disease models

hipscs 衍生细胞的使用是研究人类神经退行性疾病的一种有价值的方法。在这里, 我们描述了一个优化的方案, 用于区分从患者的α-syecrin 基因 (Snca) 位点的α-syecin 基因 (Snca) 到帕金森病 (pd) 相关的多巴胺能神经元群的 hpsc。越来越多的证据表明,高 Snca水平是导致 pd 发展的原因. 认识到建立新的 pd 治疗方法的需求未得到满足, 特别是针对snca表达调控的方法, 我们最近开发了一个基于 Crisprce/dna 甲基的系统, 通过丰富Snca内带1调控区域的甲基化水平, 对 snca 转录进行表观调节.为了提供该系统, 包括一个死 (失活) 版本的 Cas9 (dCas9) 融合了 Dna 甲基转移酶 3 a (DMT3A) 的催化域, 使用了慢病毒载体。该系统应用于具有 Snca位点的神经, 通过snca内含子1的靶向 dna 甲基化, 可将 snca-mrna 和蛋白质水平降低约 30%. 对 SNCA 水平的微调下调, 可以拯救与疾病相关的细胞表型。在目前的协议中, 我们的目标是描述一个逐步的过程, 区分高维动物分为神经祖细胞 (Npc), 并建立和验证热测序检测, 以评估在 Snca中的甲基化剖面内德龙 1.为了更详细地概述这些实验中使用的小病毒-Crispr/cas9 系统, 该协议描述了如何生产、纯化和浓缩慢病毒载体, 并强调了它们是否适合于使用Hpsc 和 Npc。该协议易于适应, 可用于生产高滴度慢病毒的体外和体内应用。

与天真的 GFP 对应因素相比, 验证 Lv-dcas9-dnt3a-gfp-puro 载体的生产滴度
我们进行了 p24口型elisa 比较了 Lv-dcash9-dnt3a-gfp-puro 的物理滴度与天真的 Gfp/puro 同行。图 5A中给出的代表性结果表明, 使用本文概述的协议生成的向量的物理产量是可比较的。这表明, 优化的矢量主干的效用, 加上优化?...

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Lentiviral Vector Platform for the Efficient Delivery of Epigenome-editing Tools into Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Disease Models

靶向 DNA 表观基因组编辑是一种强有力的治疗方法。该协议描述了一种一体式慢病毒载体的生产、纯化和浓度, 这些载体窝藏 CRISPR9-DNMT3A 转导基因, 用于人类诱导的多能干细胞 (hiPSC) 衍生神经元的表观基因编辑应用。

慢病毒载体平台, 用于将表观基因编辑工具高效地传递到人类诱导的多能干细胞衍生疾病模型中

The use of hiPSC-derived cells represents a valuable approach to study human neurodegenerative diseases. Here, we describe an optimized protocol for the ...

伦蒂病毒向量平台比最流行的向量平台有一个主要优势，特别是由于伦蒂病毒载体能够容纳更大的基因插入。因此，扁病毒载体似乎是应用的首选平台，涉及CRISPR/Cas工具的交付。该技术模仿α-核素表达的自然调节机制，当受损时与疾病相关。它允许微调表达水平与基因表达的强健变化。我强烈建议使用多个指南 RNA 进行筛选验证此或类似方法。导向RNA效力存在很大变异性。确定它的唯一方法就是有强大而全面的筛选和验证。开发系统可以很容易地适应其他模型系统，如动物模型，包括啮齿动物和非人类灵长类动物。这些后续实验可以作为未来临床研究的概念证明。演示该程序将是叶卡捷琳娜·伊利希博士，一个高级工作人员在我的实验室，专注于执行分子克隆程序，以创建与该项目相关的伦蒂病毒向量质粒。她还将演示伦蒂病毒向量生产中涉及的关键步骤。演示该程序还将是Lidia Tagliafierro博士，一个博士后从我的实验室专注于人类 iPS 细胞分化到病理相关细胞。她将演示建立测定的关键步骤，以评估合成素内创的甲基化特征1。阿希拉·斯里坎达，我实验室的工作人员，专注于人类 iPS 细胞衍生神经祖细胞的培养。首先，通过放大载体的DNMT3A部分，从d-Cas9-DNMT3A-GFP开发DNMT3A催化域。使用 BamH1 限制性酶消化 DNMT3A 片段后。将其放入带 d-Cas9 的经过修改的 PBK-301 载体的 BamH1 站点，通过直接桑格测序进行验证，用 FSC 1 替换纯美森报告基因和生成的质粒，以 GFP 消化 d-Cas9-DNMT3A-P2A 纯美森和质粒。使用凝胶纯化方法净化载体片段。使用 FSC-1 消化 PBK-201 来准备刀片。将 FSC 1 片段克隆到矢量中以创建 d-Cas9-DNMT3A-P2A-GFP。涂15厘米板与0.2%明胶的转染，并等待10分钟。然后吸气明胶，加入22.5毫升的高葡萄糖介质和2.5毫升以前培养的 HEK-293T 细胞悬浮液。在37摄氏度下用5%CO2孵育板，直到达到70至80%的汇合。要准备足够 115 厘米板的质粒混合，请使用手稿中描述的四个质粒。将 312.5 微升的一摩尔氯化钙加入与质粒相同的 15 毫升管中，并使用无菌双蒸馏水将最终体积达到 1.25 毫升。轻轻添加 1.25 毫升的两个 X BBM 溶液下降到管明智， 而漩涡。在室温下孵育30分钟。从细胞中吸出该介质，加入22.5毫升新鲜准备好的高葡萄糖DMEM，无需血清。在每个板中加入2.5毫升的转染混合物。在37摄氏度下用5%CO2孵育，孵育后两到三个小时，每板加入2.5毫升血清，在37摄氏度下达到10%稀释，在5%CO2下孵育。要收获病毒，从所有转染的细胞中收集上流液，并在50毫升锥形管中拉取。在室温下以 400 至 450 g 的离心机 10 分钟，然后通过 0.45 微米真空过滤器单元过滤上清液。接下来，通过制备锥形超离心管创建蔗糖梯度。小心地将过滤的上清液添加到梯度中，将病毒上清液在每个超离心管中均匀分布，每个管的填充至少四分之三。在17摄氏度下以70000克离心样品两小时。轻轻地将 30% 至 60% 蔗糖馏分收集到干净的管中，加入冷 1X PBS 至总体积 100 毫升，并多次混合移液器。在每个管中小心地将四毫升 20%蔗糖加入到每个管中，通过每管将大约 20 到 25 毫升的病毒溶液移液，使病毒制剂继续分层。小心平衡管，然后在70000g下离心2小时，温度为17摄氏度。小心吸走剩余的液体，以完全去除所有液体离开含有颗粒的病毒，这些颗粒几乎看不到小半透明斑点。排空后，上清液倒置纸巾上的管子，让剩余的液体排出。将 70 微升 1X PBS 添加到第一管中，并彻底移液器以重新悬浮颗粒。将悬浮液转移到下一管，并重复移液和转移，直到所有颗粒重新悬浮。将额外的 50 微升 1X PBS 添加到第一管中，混合洗涤。然后将悬浮液转移到第二管清洗，并继续像以前一样清洗和转移，产生约120微升的微乳最后悬浮液。在10000 g的离心机60秒，以获得一个明确的悬浮将上清液转移到一个新的管，使5微升等分，并储存在负80摄氏度的克里维亚尔与MD NPC到37摄氏度热块两分钟，并转移解冻的细胞到15毫升锥形管与10毫升温暖的DMEM-F12。在300克下离心5分钟。吸升液，并在预热完整N2B2介质的两毫升中重新悬浮细胞。将两毫升 N2B27 添加到细胞悬浮液中，并在先前准备的 BMM 编码的六井板的每个井中加入两毫升的细胞。在37摄氏度下孵育细胞，在一夜之间用5%的二氧化碳孵育。当MD NPC处于70%汇合时，通过添加两微升的扁病毒导引RNA d-Cas9-DNMT3A载体来换乘它们，然后轻轻地旋转板。在相同条件下孵育细胞16小时后，在转导后48小时更换N2B27介质。加入N2B27与5微克每毫升纯美森获得稳定的MDNPC线，生长细胞三个星期在N2B27加上纯美森，以特征SNCA intron 1的甲基化配置文件。首先使用DNA提取试剂盒从每个稳定的传感器细胞系中提取DNA，然后使用800纳米的DNA图使用市售试剂盒进行双硫化物转化，然后用双硫化物将DNA转换为每微升20纳米图。对于热测序分析，准备在无核管中的PCR主混合物将反应板转移到热循环器并启动PCR。使用两升PCR产品，在阿加罗斯凝胶电泳后用30和溴化物染色来可视化安普利森。对于热测序测定，使用硫化物转化的DNA和热测序试剂的未甲基化和甲基化混合物，如手稿中所述。使用伦蒂病毒 d-Cas9-DMMT3A-GFP 载体的物理产量计算每个 CPG 站点的甲基化值，使用该协议生成的 Naive GFP 载体具有可比性。这表明，优化的载体骨干网与优化的生产协议相结合，使Lentivirus d-Cas9-DNMT3 GFP载体的CRISPR-dCas9载体转导率比天真的GFP载体低四倍，表明CRISPR d-Cas9-RNA的包装效率降低。与d-Cas9-DNMT3A向量相比，NaivePURO矢量的转导率高出五倍。这些结果得到了进一步证实使用天真的GNP和d-Cas9-DNMT3A-GFP。此处描述的基于 EB 的协议允许 MD NPC. hipscs 表示快乐效力标记 10 月 4 日， 而 MD NPC 同时表示内辛和 FoxA2 。为SNCA intron 1中的甲基化状态的定量设计并验证了七种热测序测定。所有 7 种检测都经过验证并显示出线性相关性，使用经过验证的检测方法，可以确定 SNCA intron 1 中 23 个 CPG 的甲基化水平，与参加此过程相关的最重要的事情是使用显示适当生长和健康状况的细胞，以确保实验的一致性。本演示中突出显示的扁豆载体的生产可以很容易地用于生产积分缺陷的抗病毒，也可以轻松扩大，以产生更大的数量或更集中的病媒。这项技术可以为探索基因去调控对年龄相关或包括阿尔茨海默病和相关痴呆症在内的生成性疾病的致病影响铺平道路。扁豆载体在这里发展的优点是，它不是危害或不传染性扁豆载体只有最小的影响细胞周期，他们是安全可靠的传递平台的基因治疗应用。

Research

JoVE Journal

Genetics

Systemic Delivery of MicroRNA Using Recombinant Adeno-associated Virus Serotype 9 to Treat Neuromuscular Diseases in Rodents

重组腺相关病毒9型 MicroRNA 系统分娩治疗啮齿动物神经肌肉疾病

RNA interference via the endogenous miRNA pathway regulates gene expression by controlling protein synthesis through post-transcriptional gene silencing. ...

科研

遗传学

An Array-based Comparative Genomic Hybridization Platform for Efficient Detection of Copy Number Variations in Fast Neutron-induced Medicago truncatula Mutants

An Array-based Comparative Genomic Hybridization Platform for Efficient Detection of Copy Number Variations in Fast Neutron-induced Medicago truncatula Mutants

一种基于阵列的比较基因组杂交平台, 有效检测快中子诱导的苜蓿蒺藜突变体的拷贝数变化

Mutants are invaluable genetic resources for gene function studies. To generate mutant collections, three types of mutagens can be utilized, including ...

A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells

整合酶缺陷慢病毒载体载体的制备及其在细胞 CRISPR/Cas9-mediated 基因敲除中的表达

Lentiviral vectors are an ideal choice for delivering gene-editing components to cells due to their capacity for stably transducing a broad range of cells ...

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

金小蜂金小蜂基因组操作的胚胎显微注射和移植技术

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9 对小鼠和人造血祖细胞的高效基因破坏

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

Lentiviral Mediated Production of Transgenic Mice: A Simple and Highly Efficient Method for Direct Study of Founders

慢病毒载体介导的转基因小鼠生产: 一种简单高效的创始人直接研究方法

For almost 40 years, pronuclear DNA injection represents the standard method to generate transgenic mice with random integration of transgenes. Such a ...

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

人牙小泡干细胞的分离、鉴定及微 rna 遗传修饰

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9 诱导人多潜能干细胞内源蛋白标记的应用

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

Isolating, Sequencing and Analyzing Extracellular MicroRNAs from Human Mesenchymal Stem Cells

人骨髓间充质干细胞细胞外微 rna 的分离、测序和分析

Extracellular and circulating RNAs (exRNA) are produced by many cell types of the body and exist in numerous bodily fluids such as saliva, plasma, serum, ...

Lentiviral Mediated Gene Silencing in Human Pseudoislet Prepared in Low Attachment Plates

伦蒂病毒介导基因在低附着板中制备的人类伪性沉默

Various genetic tools are available to modulate genes in pancreatic islets of rodents to dissect function of islet genes for diabetes research. However, ...