Name: lentiviral vector platform for the efficient delivery of epigenome-editing tools into human induced pluripotent stem cell-derived disease models
Uploaded: 2019-03-29T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lentiviral Vector Platform for the Efficient Delivery of Epigenome-editing Tools into Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Disease Models at JoVE.com

Dette arbejde var delvis finansieret af Kahn Neurotechnology udvikling Award (til O.C.) og nationale institutter for sundhed/National Institute af neurologiske lidelser og slagtilfælde (NIH/NINDS) (R01 NS085011 til OC).

1. system Design og Virus produktion
<ol><li>Plasmid design og konstruktion Bemærk: Opførelsen af en all-in-one LV-gRNA-dCas9-DNMT3A vektor er udført ved hjælp af en produktions- og udtryk-optimeret udtryk kassettebånd udgivet af Ortinski et al.30. Vektor kassette bærer en gentagelse af genkendelsessekvens transkriptionsfaktor Sp1 og en state-of-the-art sletning inden for de uoversatte (U3')-regionen i en 3'-lange terminal Gentag (LTR) (<strong class="x...

LVs begyndt at dukke op som køretøjet af valg til epigenome redigering, især i forbindelse med genetiske sygdomme, hovedsagelig på grund af deres evne til at (i) rumme store DNA nyttelast og (ii) effektivt transduce en bred vifte af dividere og nondividing celler. Store emballage effekten af LVs er især gavnligt for de ansøgninger, der involverer emballage af CRISPR/dCas9, som er overdimensioneret. Fra dette perspektiv repræsenterer LVs platform of choice for levering af All-in-one CRISPR/Cas9 systemer. Faktisk er...

Flere epigenome-redigering platforme er udviklet for nylig for at målrette alle DNA-sekvenser i de regioner, der styrer gen expression1,2. Den oprettede epigenome-redigeringsværktøjer er designet til a regulere transskription, (ii) alter posttranslationelle Histon ændringer, (iii) ændre DNA methylering, og (iv) modulere regulerende element interaktioner. Tilgangen til at forankre transskription/kromatin modifikatorer til en deaktiveret (dead) Cas9 (dCas9) rejst fra tidligere udviklede epigenome-redigering platforme, såsom zink finger proteiner (ZFPs) og transkription aktivere-lignende effektorer (eventyr), husly en potent transcriptional effektor domæne smeltet (ED) til designet DNA-bindende domæne (Bel)3. Resultaterne af den ønskede fænotype som aktivering eller undertrykkelse er defineret af effektor molekylet forankret til de endogene loci (figur 1). Hvis du vil oprette programmerbare transcriptional aktivatorer, er dCas9/gRNA moduler knyttet til VP164,5,6 (figur 1A), en viral aktivering domæne, der rekrutterer Pol II og generelle transskription maskiner. Ændring af dette system har inkluderet VP64, en tetramer af VP16 domæner, giver en endnu mere robust aktivering sats5,6. Systemet har været med succes ansat til at aktivere kodning og noncoding regioner ved at målrette initiativtagere og regulerende elementer. Vigtigere, selvom VP64 molekyler ikke direkte ændrer strukturen kromatin i regionen mål, det rekrutter kromatin modifikatorer, som binder resultater i aflejring af aktive (euchromatin) mærker, herunder som H3/H4 acetylation og H3-K4 di / Tri-methylering5,6. Ud over VP64, har p65 underenheden af den menneskelige NF-κB kompleks været bundet til dCas9/gRNA modul7. Interessant, tøjring af disse effektorer områder opstrøms transskription start websteder (TSSs) og inden for initiativtagerne resulterer i en stærk gen induktion. Ikke desto mindre, VP64 og p65 effektorer kan også udøve de activatory virkninger mens er knyttet til de regioner, der ligger nedenstrøms TSSs og distale smagsforstærkere7,8. For at fremkalde en mere robust transcriptional reaktion, skal flere dCas9-VP64 eller dCas9-p65 fusioner ansættes til et enkelt mål locus9,10. Som sådan, har den seneste udvikling af næste generations aktivatorer, som rekrutterer flere effektor domæner af et enkelt dCas9-gRNA kompleks, såsom SunTag, resulteret i en stærkere aktivering evne at sammenligne til dCas9-VP64 fusion modparter11 , 12. en forbedret transcriptional aktivering er opnået gennem fusion af VP64, p65 og Rta (Benzindampgenvinding), et transactivation domæne fra gamma-herpesvirus, at C-terminus dCas913 (figur 1A). Lignende CRISPR/dCas9 systemer er blevet udviklet til target-specifikke undertrykkelse (figur 1B).
Endogene gen undertrykkelse kan opnås med manipuleret repressor fusions gennem en bred vifte af mekanismer (figur 1B). Det er blevet påvist, at CRISPR/dCas9 systemer, knyttet til repressor Bel (selv uden en effektor domæne/s), effektivt kan lukke munden på genekspression mens bundet til en promotor eller upstream/downstream-TSS regioner3,6 ,14. Effekter på transskription er forårsaget af sterisk indblanding af transskription faktor bindende og RNA polymerase behandling. Ikke desto mindre, mere omfattende tilgange er nødvendige, som genet undertrykkelse af sterisk hindring alene er ofte ikke tilstrækkeligt robust silencing. Den seneste udvikling af den næste generation af lyddæmpere baseret på CRISPR/dCas9 systems transporterer transkriptionel repressor domæner (TRDs), Histon modifikatorer (H3-K9 di-/ tri-methylering, H3-K27 di-/ tri-methylering; H3-K36 di-/ tri-methylering, H3/H4 deacetylation), og DNA (CpG) methylering førte til opførelsen af epigenetiske værktøjer giver mulighed for mere robust silencing effekter4,5,15,16, 17,18,19,20. Det er blevet påvist, at ansættelse af disse epigenetiske modifikatorer til DNA kan føre til dannelse af mere lukkede og kondenseret kromatin, som typisk generere en mere potent silencing resultatet21,22. Domænet oftest silencing anvendes med DBDs er Krüppel-associerede boks (KRAB)4,5. Ansættelse af faktoren, der er blevet påvist for at korrespondere med kromatin ændringer; mekanismerne bag disse ændringer er dog endnu at være belyst16,17,18. For nylig, det har vist sig at lokaliseringen af KRAB DNA kan fremme samling af Histon methyltransferase SETDB1 og Histon deacetylation (HDAC) NuRD komplekser, hvilket tyder på muligheden for, at disse interaktioner mægle dannelsen af kromatin kondens og transcriptional silencing3,13. Som en alternativ tilgang, kan være smeltet effektor domæner til DBDs at oprette en brugerdefineret epigenetiske silencing protein. Dette system katalyserer direkte repressive DNA mærker eller Histon ændringer.
For nylig, brugen af syntetisk CRISPR/dCas9 systems tøjret til DNMT3A enzym har været repurposed for transcriptional deaktivering. DNMT3A katalyserer DNA methylering, der udøver transcriptional undertrykkelse i hele dannelsen af heterochromatin på endogene gen initiativtagere og andre regulerede områder (figur 1B)18,20. McDonald et al.18 og Vojta et al.20 var de første forfattere til at rapportere, at DNA methylering kan bruges til epigenome-genhæmning eller undertrykkelse, demonstrerer, at plasmid-leveret dCas9-DNMT3A fusion system potent kan forbedre cytosin methylering omkring TSS18,20. McDonald og kolleger viste, at beskæftigelse af strategien kan resultere i en betydelig reduktion (omkring 40%) i en tumor-suppressor gen niveauer CDKN2A mRNA18. På samme måde, målretning BACH eller IL6ST gener unmethylated promotor-regionen viser øget CpG methylering, der er blevet korreleret med en dobbelt reduktion i gen expression20. Vores lab har for nylig repurposed brugen af DNA methylering til formildende de patologiske resultater af SNCA overekspression (figur 2)23. Strategien er baseret på selektiv ekstraudstyr i DNA methylering i regionen SNCA intron 1, som det blev tidligere rapporteret at være hypomethylated i PD og demens med Lewy organer (DLB) hjerner24,25, 26. Denne hypomethylation har været forbundet med SNCA overekspression, således tilbyde et attraktivt mål for terapeutisk intervention24,27,28. Vi har for nylig viste et lavt niveau af DNA methylering i SNCA intron 1 region i hiPSC-afledte dopaminerge NPCs fremstillet en PD patient med SNCA tredobling23. Fordelen ved denne eksperimentelle model er at NPCs kan håndfast opformeret i kultur eller yderligere opdeles i modne neuroner, muliggør en effektiv screening at identificere genetiske faktorer, der mægle cellulære fænotyper, herunder oxidative stress og apoptose29. Endvidere, denne modelsystem gør det muligt videnskabsfolk til at sammenfatte de udviklingsmæssige begivenheder, der fandt sted før symptomdebut i patienter. Derudover repræsenterer hiPSC-afledte NPCs et fantastisk værktøj til at teste den cellulære og molekylære veje tilknyttet genekspression. Vigtigere, kan hiPSC-afledte NPCs kombineret med CRISPR/Cas9-epigenome teknologi i høj grad lette udviklingen af "næste generations narkotika" for mange neurodegenerative sygdomme.
For at nedbringe patologiske SNCA udtryk, vi for nylig udviklet en lentivirus-baseret system transporterer en dCas9-DNMT3A fusion protein og gRNA til specifikt mål CpG methylering i SNCA intron 1 (figur 2A)23. Denne protokol beskriver lentiviral vektor (LV) design og produktion i detaljer. LVs udgør et effektivt middel til at levere CRISPR/dCas9 komponenter af flere grunde, nemlig (i) deres evne til at bære voluminøse DNA indsætter, (ii) en høj effektivitet af transducing en bred vifte af celler, herunder både dividere og nondividing celler30 , og (iii) deres evne til at fremkalde minimale cytotoksiske og immunogen svar. For nylig har vi anvendt LV system til hiPSC-afledte dopaminerge neuroner fra en patient med tredobling af SNCA locus og demonstreret LVs terapeutiske potentiale for levering af epigenome-redigering methylering værktøjer23 ( Figur 2B). Faktisk, en LV-gRNA/dCas9-DNMT3A system medfører en betydelig stigning i DNA methylering i regionen SNCA intron 1. Denne stigning svarer med reduktion i niveauet af SNCA mRNA og protein23. Desuden redder SNCA downregulation PD-relaterede fænotyper i SNCA tredobling/hiPSC-afledt dopaminerge neuroner (f.eks. mitokondrie ROS produktion og celle levedygtighed)23. Vigtigere, viste vi, at reduktionen af SNCA udtryk af LV-gRNA-dCas9-DMNT3A-systemet er i stand til at vende den fænotyper, der er karakteristiske for hiPSC-afledte dopaminerge neuroner fra en PD patient, der bar SNCA tredobling, såsom mitokondrie ROS produktion og celle levedygtighed23. Målet med denne protokol er 1) at skitsere protokollen af produktion og koncentration af en optimeret LV platform for at skabe high-fnisede viral præparater og 2) til at beskrive differentieringen af hiPSCs af NPCs mønstret for at blive modne dopaminerge neuroner31,32 og karakterisering af methylering niveauer af det målrettede område SNCA intron 1.
Lentiviral platforme har en stor fordel over de mest populære vektor platform, nemlig adeno-associeret vektorer (AAVs), som er den tidligere evne til at rumme større genetisk skær33,34. AAVs kan genereres på betydeligt højere udbytter men besidder en lav emballage kapacitet (< 4,8 kb), at kompromittere deres brug for at levere All-in-one CRISPR/Cas9 systemer. Det synes således, at LVs ville være platform of choice i de programmer, der er involveret i levering af CRISPR/dCas9 værktøjer. Derfor, den protokol, der er skitseret her vil være et værdifuldt redskab for forskere som ønsker effektivt levere redigering af epigenome komponenter til celler og organer. Protokollen yderligere skitserer strategi for at øge produktion og udtryk kapaciteter af vektorer via en ændring i cis elementer inden for vektor udtryk kassette30,35. Strategien er baseret på romanen system udviklet og studeret i vores laboratorium og fremhæver dens evne til at producere viruspartikler i rækken af 1010 viral enheder (VU) /mL30,35.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima XPN-80 Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A99839</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;M filter unit, 1L</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45-&#956;m filter unit, 500mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100mm TC-Treated Culture Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mm TC-Treated Cell Culture dishes with 20 mm Grid</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aggrewell 800</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>34811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allegra 25R tabletop centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>369434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACS</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>338960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical bottom ultracentrifugation tubes</td>
			<td>Seton Scientific</td>
			<td>5067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tube adapters</td>
			<td>Seton Scientific</td>
			<td>PN 4230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Cell Imaging Slides</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30742060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-binding 96-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3366</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted fluorescence microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DM IRB2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit (50)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reversible Strainer</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>27215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW32Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>369650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR&#174; Disposable Serological Pipets, Glass, Nonpyrogenic</td>
			<td>VWR</td>
			<td>93000-694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR&#174; Vacuum Filtration Systems</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89220-694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xMark&#8482; Microplate Absorbance plate reader</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1681150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human embryonic kidney 293T (HEK 293T) cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>7920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Adherence Rinsing Solution</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>7010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-FOXA2 Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab60721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Nestin Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab18102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-antimycotic solution, 100X</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5955-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X), minus vitamin A</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B9879 - BES</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Albumin Fraction V (7.5% solution)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15260037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>72052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Matrigel hESC-Qualified Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>08-774-552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cosmic Calf Serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30087.04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-719</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNeasy Blood &#38; Tissue Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EpiTect PCR Control DNA Set</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>596945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ DNA Methylation Kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D5001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G1800-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15750078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentle Cell Dissociation Reagent</td>
			<td>stemCell Technologies</td>
			<td>7174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Recombinant bFGF</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>78003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Recombinant&#160;EGF</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>78006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Recombinant Shh (C24II)</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>78065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>85850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17502001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Essential Amino Acid (NEAA)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30087.04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyroMark PCR Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>978703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 media</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>72232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S8636-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STEMdiff&#160;Neural Induction Medium</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>5835</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STEMdiff Neural Progenitor Freezing Medium</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>5838</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Assay FOXA2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Hs00232764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Assay GAPDH</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Hs99999905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Assay Nestin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Hs04187831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Assay OCT4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Hs04260367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Assay PPIA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Hs99999904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA 0.05%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y27632</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>72302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p24 ELISA reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal anti-p24 antibody</td>
			<td>NIH AIDS Research and Reference Reagent Program</td>
			<td>3537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit horseradish peroxidase IgG</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>12-348</td>
			<td>Working concentration 1:1500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum, Sterile, 10mL</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9023</td>
			<td>Working concentration 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIV-1 standards</td>
			<td>NIH AIDS Research and Reference Reagent Program</td>
			<td>SP968F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal mouse serum, Sterile, 500mL</td>
			<td>Equitech-Bio</td>
			<td>SM30-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal rabbit anti-p24 antibody</td>
			<td>NIH AIDS Research and Reference Reagent Program</td>
			<td>SP451T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMB peroxidase substrate</td>
			<td>KPL</td>
			<td>5120-0076</td>
			<td>Working concentration 1:10,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMD2.G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRSV-Rev</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>52961</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>psPAX2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction enzymes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BsmBI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0580S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BsrGI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0575S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRV</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0195S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KpnI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0142S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PacI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0547S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SphI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0182S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lentiviral vector platform for the efficient delivery of epigenome-editing tools into human induced pluripotent stem cell-derived disease models

Brugen af hiPSC-afledte celler repræsenterer en værdifuld fremgangsmåde at studere menneskelige neurodegenerative sygdomme. Her, vi beskriver en optimeret protokol for differentiering af hiPSCs stammer fra en patient med tredobling af alfa-synuclein gen (SNCA) locus i Parkinsons sygdom (PD)-relevante dopaminerge neuronal populationer. Akkumulere beviser har vist, at høje niveauer af SNCA er sygdomsfremkaldende for udviklingen af PD. genkendelse de uopfyldte behov for at etablere nye terapeutiske strategier for PD, navnlig rettet mod regulering af SNCA udtryk, vi for nylig udviklet en CRISPR/dCas9-DNA-methylering-baseret system til at modulere epigenetically SNCA transskription af berigende methylering niveauer på regionen SNCA intron 1 regulerende. Levere system, bestående af et dødt (deaktiveret) version af Cas9 (dCas9) sammensmeltet med DNA methyltransferase enzym 3A katalytiske domæne (DNMT3A), en lentiviral vektor bruges. Dette system er anvendt på celler med tredobling af SNCA locus og reducerer SNCA-mRNA og protein niveauer af omkring 30% gennem den målrettede DNA methylering af SNCA intron 1. Den finjusteret downregulation af SNCA niveauer redder sygdomsrelaterede cellulære fænotyper. I den nuværende protokol, vi sigter mod at beskrive en trinvis procedure for differentiere hiPSCs i neurale stamceller (NPC) og oprettelse og validering af pyrosequencing assays til evaluering af profilen methylering i SNCA intron 1. For at redegøre mere detaljeret for lentivirus-CRISPR/dCas9, der anvendes i disse eksperimenter, beskriver denne protokol, hvordan at producere, rense og koncentrere lentiviral vektorer og fremhæve deres egnethed til epigenome - og genom-redigering applikationer ved hjælp af hiPSCs og NPC'ere. Protokollen er let at tilpasse og kan bruges til at producere høj titer lentiviruses til in vitro- og in vivo applikationer.

Validering af produktionen titers LV-dCas9-DNMT3A-normal god landbrugspraksis/Puro vektorer i forhold til naivt normal god landbrugspraksis modstykke
Vi udførte p24gag ELISA at sammenligne mellem fysiske titers af LV-dCas9-DNMT3A-normal god landbrugspraksis/Puro med naive normal god landbrugspraksis/Puro modstykker. Repræsentative resultater, præsenteret i figur 5A, p?...

Watch this Scientific Journal Video about Lentiviral Vector Platform for the Efficient Delivery of Epigenome-editing Tools into Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Disease Models at JoVE.com

Lentiviral Vector Platform for the Efficient Delivery of Epigenome-editing Tools into Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Disease Models

Målrettet DNA epigenome redigering repræsenterer en kraftfuld terapeutisk tilgang. Denne protokol beskriver produktion, oprensning og koncentration af All-in-one lentiviral vektorer husly CRISPR-dCas9-DNMT3A transgen til epigenome-redigering applikationer i menneskelige inducerede pluripotente stamceller (hiPSC)-afledt neuroner.

Lentiviral vektor Platform for effektiv levering af Epigenome-redigeringsværktøjer i menneskelige induceret pluripotente stamceller-afledt sygdomsmodeller

The use of hiPSC-derived cells represents a valuable approach to study human neurodegenerative diseases. Here, we describe an optimized protocol for the ...

Lentiviral vektor platform har en stor fordel i forhold til de mest populære vektor platform, specielt på grund af evnen til lentiviral vektorer til at rumme større genetiske indsætte. Således ser det ud til, at lentiviral vektor ville være den platform for valg i ansøgningen indebærer levering af CRISPR / Cas værktøjer. Denne teknik efterligne den naturlige regulerende mekanisme af alfa-synuclein udtryk, som når nedsat er forbundet med sygdom.Det giver mulighed for finjustering af udtryksniveauet versus robuste ændringer i genekspression. Jeg vil stærkt anbefale at validere denne eller lignende tilgange ved hjælp af flere guide RNA'er til screening. Der er stor variation i guide RNA potens.Den eneste måde at afgøre det er der robust og omfattende screening og validering. Det udviklede system kan let tilpasses andre modelsystemer såsom dyremodeller, herunder gnavere og ikke-menneskelig primat. Disse opfølgende eksperiment kunne tjene som et proof of concept for fremtidige kliniske undersøgelser.Demonstration af proceduren vil være Dr.Ekaterina Ilich, en ledende medarbejder i mit laboratorium, der fokuserer på udførelse af molekylær kloning procedure for at skabe Lentiviral Vector Plasmids relateret til dette projekt. Hun vil også demonstrere de vigtigste skridt, der er involveret i Lentiviral Vector produktion. Også demonstrere proceduren vil være Dr.Lidia Tagliafierro, en postdoc fra mit laboratorium med fokus på differentiering af menneskelige iPS-celler i patologiske relevante celler.Hun vil demonstrere de vigtigste skridt i etableringen af analyser til at vurdere methylering profiler af synuclein intron1. Ahila Sriskanda, en medarbejder i mit laboratorium med fokus på kulturen i menneskelige iPS celle-afledte neurale stamcelleceller. Til at begynde med skal du udvikle DNMT3A-katalytisk domæne fra d-Cas9-DNMT3A-GFP ved at forstærke DNMT3A-delen af vektoren.Efter at have fordøjet DNMT3A-fragmentet ved hjælp af et BamH1-begrænsningsenzym. Cloat det ind i BamH1 stedet for den modificerede PBK-301 vektor regnskabsmæssige d-Cas9 og verificeret af direkte Sanger sekventering, at erstatte den rene Meissen reporter gen og den deraf følgende plasmid med GFP fordøje d-Cas9-DNMT3A-P2A ren Meissen og plasmid med FSC 1. Rens vektorfragmentet ved hjælp af en gelrensningsmetode.Forbered indsatsen ved at fordøje PBK-201 med FSC-1. Klon FSC 1-fragmentet i vektoren for at skabe d-Cas9-DNMT3A-P2A-GFP. Coat 15 centimeter plader med 0,2% gelatine til transfektion og vente i 10 minutter.Derefter aspirere gelatine og tilsæt 22,5 milliliter høj glukose medium og 2,5 milliliter tidligere dyrket HEK-293T celle suspension. Inkuber pladerne ved 37 grader Celsius med 5% CO2, indtil de når 70 til 80%sammenløb. For at forberede plasmid blandingen tilstrækkelig til 115 centimeter plade bruge de fire plasmider beskrevet i manuskriptet.Der tilsættes 312,5 mikroliter af en molar calciumchlorid til det samme 15 milliliterrør med plasmiderne, og det endelige volumen bringes til 1,25 milliliter ved hjælp af sterilt dobbeltdestilleret vand. forsigtigt tilsættes 1,25 milliliter af to X BBM opløsning dråbe klogt til røret, mens vortexing. Inkuber i 30 minutter ved stuetemperatur.Aspirere mediet fra cellerne og tilsæt 22,5 milliliter frisklavet høj glukose DMEM uden serum. Der tilsættes 2,5 milliliter transfektionsblandingen til hver plade. Hvirvle pladerne og inkubere ved 37 grader Celsius med 5%CO2 i to til tre timer efter inkubation tilføje 2,5 milliliter serum pr plade for at opnå 10% fortynding og inkubere natten over ved 37 grader Celsius med 5% CO2.At høste virus indsamle supernatant fra alle de transficerede celler og trække dem i 50 milliliter koniske rør. Centrifuge ved 400 til 450 g i 10 minutter ved stuetemperatur og derefter filtrere supernatanten gennem 0,45 mikrometer vakuumfilterenhed. Næste skabe en saccharose gradient ved at forberede koniske ultra centrifugering rør.Tilsæt forsigtigt den filtrerede supernatant til gradienten ved at fordele den virale supernatant ligeligt mellem hvert ultracentrifugeringsrør, der fylder mindst tre fjerdedele af hvert rør. Centrifuge prøverne ved 70000 g i to timer ved 17 grader Celsius. Opsaml forsigtigt 30% til 60% saccharosefraktioner i rene rør, tilsættes kold 1X PBS op til 100 milliliter samlet volumen og pipette flere gange for at blande.Der tilsættes forsigtigt fire milliliter 20 % saccharose i 1X PBS til hvert rør for at stratificere den virale præparat fortsætte ved at pipettere ca. 20 til 25 milliliter af den virale opløsning pr. rør. Balance rør og derefter centrifuge ved 70000 g i to timer ved 17 grader Celsius. Modsugning forsigtigt den resterende væske for helt at fjerne al væske, der forlader virus, der indeholder pellets, som knap nok er synlige som små gennemskinnelige pletter.Efter tømning af supernatant vende rørene på papirservietter at tillade den resterende væske at dræne. Tilføj 70 mikro liter 1X PBS til det første rør og grundigt pipette til re-suspendere pellet. Suspensionen overføres til det næste rør, og med pipettering og -overførsel gentages, indtil alle pellets er ophængt igen.Tilføj yderligere 50 mikro liter 1X PBS til det første rør og bland for at vaske det. Derefter overføres suspensionen til det andet rør for at vaske og fortsætte med vask og overførsel som tidligere, hvilket giver ca. 120 mikro liter af den lidt mælkeagtig endelige suspension. Centrifuge ved 10000 g i 60 sekunder for at opnå en klar suspension overføre supernatant til et nyt rør og gøre fem mikro liter aliquot og gemme dem på negative 80 grader Celsius placere en Cryovial med MD NPC i 37 grader Celsius varmeblok i to minutter og overføre de optøede celler til en 15 milliliter konisk rør med 10 milliliter varm DMEM-F12.Centrifuge ved 300 g i fem minutter. Inspirer supernatanten og re-suspendere cellerne i to milliliter forvarmt komplet N2B2 medium. Der tilsættes to milliliter N2B27 til cellesuspensionen og pladen to milliliter celler i hver brønd af den tidligere forberedte BMM kodede seks brøndplade.Inkuber cellerne ved 37 grader Celsius med 5% CO2 natten over. Når MD NPC'ere er ved 70% sammenløb, forgænge dem ved at tilføje to mikro liter lentivirus guide RNA d-Cas9-DNMT3A vektorer og forsigtigt hvirvle pladen. Efter inkubation af cellerne på samme betingelser som tidligere i 16 timer erstatte N2B27 medium 48 timer efter transduktionen.Tilsæt N2B27 med fem mikrogram pr. milliliter ren Meissen for at opnå de stabile MD NPC-linjer, dyrk cellerne i tre uger i N2B27 plus ren Meissen for at karakterisere methyleringsprofilen af SNCA-intron 1. Først udtrække DNA fra hver stabil transducer celle linje ved hjælp af en DNA ekstraktion kit, derefter bruge 800 nanogram DNA til at udføre en bisulfid konvertering med en kommercielt tilgængelig kit og derefter en bisulfid konverteret DNA til 20 nanogram pr mikro liter. Til pyro-sekventeringsanalysen skal PCR-masterblandingen i et kernefrit rør overføre reaktionspladen til en termocyrker og starte PCR.Visualiser ampliconerne ved hjælp af to mikro liter PCR-produkt med en 30- og bromidfarvning efter Agarosegelelektroforese. For pyro-sekventeringsanalyser anvendes blandinger af ikke-methylerede og methylerede med sulfid konverterede DNO'er og pyro-sekventering reagenser som beskrevet i manuskriptet. Beregne methyleringsværdierne for hvert CPG-websted ved hjælp af pyro-sekventeringssoftware fysiske udbytter af Lentivirus d-Cas9-DMMT3A-GFP vektor og Naive GFP vektor genereret ved hjælp af denne protokol er sammenlignelige.Dette tyder på, at nytten af den optimerede vektor backbone kombineret med den optimerede produktion protokol resulterer i høje udbytter strammere af CRISPR-dCas9 vektorer transduktion satser lentivirus d-Cas9-DNMT3 GFP vektor var fire gange lavere end den naive GFP vektor tyder på, at emballagen effektivitet CRISPR d-Cas9-RNA er reduceret. Transduktionsrater for Naive PURO-vektoren var fem gange højere sammenlignet med d-Cas9-DNMT3A-vektoren. Disse resultater blev yderligere bekræftet ved hjælp af Naive GFP og d-Cas9-DNMT3A-GFP.Den EB-baserede protokol, der er beskrevet her, gør det muligt at differentiere MD NPC'er. Syv pyro-sekventeringsanalyser blev konstrueret og valideret med henblik på kvantificering af methyleringsstatus i SNCA-intron 1.Alle 7 analyser blev valideret og viste lineær korrelation, ved hjælp af de validerede analyser var det muligt at bestemme methyleringsniveauerne ved de 23 CPGs i SNCA intron 1 Det vigtigste at huske end at deltage i denne procedure er at arbejde med celler, der viser korrekt vækst og sundhed for at sikre konsistens på tværs af eksperimenter. Produktionen af linser vektorer fremhævet i denne præsentation kan let vedtages til produktion af integraler mangelfuld anti-virus det er også let kan skaleres op til at generere større mængder eller mere koncentrerede vektorer. Denne teknik kan bane vejen for at udforske de patogene virkninger af gener de-regulering på aldersrelaterede eller generative lidelser, herunder Alzheimers sygdom og relaterede demenssygdomme.Fordelen ved linsevektorer udvikle her er, at det ikke er fare eller ikke smitsomme linser vektorer har kun minimal effekt på cellecyklus de er sikre og pålidelige levering platform for genterapi applikationer.

Research

JoVE Journal

Genetics

Systemic Delivery of MicroRNA Using Recombinant Adeno-associated Virus Serotype 9 to Treat Neuromuscular Diseases in Rodents

Systemisk levering af mikroRNA ved hjælp af rekombinante Adeno-associeret Virus Serotype 9 til behandling af neuromuskulære sygdomme i gnavere

RNA interference via the endogenous miRNA pathway regulates gene expression by controlling protein synthesis through post-transcriptional gene silencing. ...

An Array-based Comparative Genomic Hybridization Platform for Efficient Detection of Copy Number Variations in Fast Neutron-induced Medicago truncatula Mutants

An Array-based Comparative Genomic Hybridization Platform for Efficient Detection of Copy Number Variations in Fast Neutron-induced Medicago truncatula Mutants

En Array-baserede komparativ genomisk hybridisering Platform for effektiv påvisning af kopi antal variationer i hurtig Neutron-induceret Medicago truncatula mutanter

Mutants are invaluable genetic resources for gene function studies. To generate mutant collections, three types of mutagens can be utilized, including ...

A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells

En protokol til produktion af Integrase-mangelfuld Lentiviral vektorer for CRISPR/Cas9-medieret gen Knockout i dividere celler

Lentiviral vectors are an ideal choice for delivering gene-editing components to cells due to their capacity for stably transducing a broad range of cells ...

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Embryo mikroinjektion og Transplantation teknik for Nasonia vitripennis genom Manipulation

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Højeffektive gen afbrydelse af Murine og menneskelige hæmatopoietisk stamceller ved CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

Lentiviral Mediated Production of Transgenic Mice: A Simple and Highly Efficient Method for Direct Study of Founders

Lentiviral medieret produktion af Transgene mus: en enkel og meget effektiv metode til direkte undersøgelse af grundlæggerne

For almost 40 years, pronuclear DNA injection represents the standard method to generate transgenic mice with random integration of transgenes. Such a ...

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

Isolation, karakterisering og mikroRNA-baseret genetisk modificering af menneskelige Dental follikel stamceller

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

Endogene Protein Tagging i menneskelige induceret pluripotente stamceller ved hjælp af CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

Isolating, Sequencing and Analyzing Extracellular MicroRNAs from Human Mesenchymal Stem Cells

Isolering, sekventering og analysere ekstracellulære MicroRNA fra humane mesenkymale stamceller

Extracellular and circulating RNAs (exRNA) are produced by many cell types of the body and exist in numerous bodily fluids such as saliva, plasma, serum, ...

Lentiviral Mediated Gene Silencing in Human Pseudoislet Prepared in Low Attachment Plates

Lentiviral medieret genhæmning i humant Pseudoø fremstillet i lave fastgørelses plader

Various genetic tools are available to modulate genes in pancreatic islets of rodents to dissect function of islet genes for diabetes research. However, ...