Name: lentiviral vector platform for the efficient delivery of epigenome-editing tools into human induced pluripotent stem cell-derived disease models
Uploaded: 2019-03-29T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lentiviral Vector Platform for the Efficient Delivery of Epigenome-editing Tools into Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Disease Models at JoVE.com

Dit werk werd gedeeltelijk gefinancierd door de Kahn Neurotechnology Development Award (naar O.C.) en de nationale instituten van gezondheid/National Institute of Neurological Disorders en beroerte (NIH/NINDS) (R01 NS085011 aan O.C.).

1. de systeemontwerp en Virus productie
<ol><li>Plasmide-ontwerp en constructie Opmerking: De bouw van een alles-in-één LV-gRNA-dCas9-DNMT3A-vector wordt uitgevoerd met behulp van een productie- en expressie expressie-geoptimaliseerde cassette gepubliceerd door Ortinski et al.30. De vector cassette draagt een herhaling van de site van de erkenning van de transcriptiefactor Sp1 en een state-of-the-art schrapping binnen de onvertaalde (U3') een terminal 3' du...

LVs zijn begonnen te ontstaan als het voertuig van keuze voor het bewerken van epigenome, met name in het kader van genetische ziekten, vooral vanwege hun vermogen om (i) geschikt voor efficiënt transduce de grote DNA-nettoladingen en (ii) een breed scala van verdelen en nondividing cellen. De werkzaamheid van de grote verpakking van de LVs is vooral gunstig voor de toepassingen waarbij verpakking van de CRISPR/dCas9-systemen die zijn oversized. Vanuit dit perspectief vertegenwoordigen LVs de platform-of-choice voor de ...

Meerdere epigenome-bewerken platformen zijn onlangs ontwikkeld te richten op een DNA-sequenties in de regio's waarmee gene expression1,2. De gemaakte epigenome-bewerkingsgereedschap zijn ontworpen om (i) het reguleren van transcriptie, (ii) veranderen posttranslationele histone modificaties, (iii) wijzigen methylation van DNA en (iv) het moduleren van regelgevende element interacties. De aanpak van het verankeren van de transcriptie/chromatine modifiers om een gedeactiveerde (dode) Cas9 (dCas9) verhoogd van eerder ontwikkelde epigenome-bewerken platforms, zoals zink eiwitten (ZFPs) en transcriptie activator-achtige effectoren (verhalen), vinger herbergen een potente transcriptionele effector domein (ED) gesmolten aan het ontworpen DNA-bindende domein (DBD)3. De resultaten van het gewenste fenotype zoals activering of repressie wordt gedefinieerd door het effector molecuul verankerd aan de endogene loci (Figuur 1). Als u wilt maken van programmeerbare transcriptionele activators, zijn dCas9/gRNA modules gekoppeld aan VP164,5,6 (figuur 1A), een virale activering domein dat Pol II en de algemene transcriptie machines werft. De wijziging van dit systeem heeft VP64, een tetrameer van VP16 domeinen, die een nog robuustere activering tarief5,-6bieden: opgenomen. Het systeem heeft met succes gewerkt codering en noncoding regio's activeren door zich te richten initiatiefnemers en regelgevende elementen. Nog belangrijker is, hoewel VP64 moleculen niet rechtstreeks de structuur van de chromatine in de target-regio wijzigen, werft het chromatine modifiers dat resultaten in depositie van de actieve (euchromatine) merken bindt, met inbegrip van H3/H4 acetylation en H3-K4 di / Tri-methylering5,6. Naast VP64, heeft de p65-subunit van de menselijke NF-recombination complex is vastgebonden aan de dCas9/gRNA module7. Interessant, het binden van deze effectoren aan de regio's stroomopwaarts van transcriptie start sites (TSSs) en binnen initiatiefnemers resulteert in een sterke gen-inductie. VP64 en p65 effectoren kunnen echter ook de activatory effecten uitoefenen terwijl het wordt gekoppeld aan de regio's gelegen stroomafwaarts van TSSs en op de versterkers van de distale7,8. Om een meer robuuste transcriptionele antwoord ontlokken, moeten meerdere dCas9-VP64 of dCas9-p65-fusies worden aangeworven naar een enkel doel locus9,10. Als zodanig, heeft de recente ontwikkeling van volgende-generatie activators, die meerdere effector domeinen door een enkele dCas9-gRNA-complex, zoals SunTag werven, geleid tot een sterkere activering vermogen te vergelijken met dCas9-VP64 fusion tegenhangers11 , 12. een verbeterde transcriptionele activering is verkregen door middel van de fusie van VP64, p65 en Rta (VPR), een domein van de transactivation van de gamma-infectieziekte, aan de C-terminus van dCas913 (figuur 1A). Vergelijkbare CRISPR/dCas9-systemen hebben ontwikkeld voor doelgroepen gerichte repressie (figuur 1B).
Endogene gene repressie kan worden bereikt met gemanipuleerde onderdrukker fusies via allerlei mechanismen (figuur 1B). Is gebleken dat CRISPR/dCas9 systemen, gekoppeld aan de onderdrukker DBD (zelfs zonder een effector domein/s), efficiënt genexpressie zwijgen kunnen terwijl vastgebonden aan een promotor of stroomopwaarts/stroomafwaarts-TSS regio's3,6 ,14. De gevolgen voor de transcriptie wordt veroorzaakt door de sterische inmenging van transcription factor binding en RNA polymerase verwerking. Echter zijn uitgebreidere benaderingen nodig, zoals gene repressie door de sterische hinder alleen vaak niet voor robuuste silencing volstaat. De recente ontwikkeling van de volgende generatie van geluiddempers op basis van CRISPR/dCas9 systemen uitvoering transcriptionele onderdrukker domeinen (TRDs), histone modifiers (H3-K9 di-/ tri-methylering, H3-K27 di-/ tri-methylering; H3-K36 di-/ tri-methylering, H3/H4 deacetylation), en methylation van DNA (CpG) leidde tot de bouw van epigenetische hulpmiddelen waardoor meer robuuste silencing effecten4,5,15,16, 17,18,19,20. Het is aangetoond dat de aanwerving van deze epigenetische modifiers tot het DNA dat kan leiden tot de vorming van meer gesloten en gecondenseerde chromatine, die meestal een meer potente silencing resultaat21,22te genereren. De meest voorkomende silencing domein gebruikt met DBDs is de Krüppel-geassocieerde vak (KRAB)4,5. De aanwerving van de factor is gebleken om te corresponderen met de chromatine wijzigingen; de mechanismen van deze wijzigingen zijn echter nog opgehelderd16,17,18. Onlangs is gebleken dat de lokalisatie van KRAB aan DNA kan de bevordering van de vergadering van de Histon methyltransferase SETDB1 en de Histon deacetylation (HDAC) NuRD complexen, suggereren de mogelijkheid dat deze interacties de vorming van bemiddelen condensatie van de chromatine en transcriptionele silencing3,13. Als een alternatieve benadering, kunnen effector domeinen worden gesmolten tot DBDs maken van een aangepaste epigenetische silencing eiwit. Dit systeem katalyseert direct repressieve DNA merken of Histon modificaties.
Onlangs, heeft het gebruik van synthetische CRISPR/dCas9 systemen vastgebonden aan het DNMT3A enzym is voorzien voor transcriptionele deactivering. DNMT3A katalyseert methylation van DNA die transcriptionele onderdrukking tijdens de vorming van heterochromatin op de endogene gene initiatiefnemers en andere regelgevende gebieden (figuur 1B)18,20 oefent. McDonald et al.18 en20 van de Vojta et al. waren de eerste auteurs om te melden dat methylation van DNA kan worden gebruikt voor epigenome-gen zwijgen of repressie, waaruit blijkt dat de plasmide-geleverd dCas9-DNMT3A fusiesysteem krachtiger kunt verbeteren Cytosine methylering rond de TSS18,20. McDonald en collega's aangetoond dat de werkgelegenheid van de strategie kan leiden tot een aanzienlijke vermindering (ongeveer 40%) in een tumor suppressor gen niveaus CDKN2A mRNA18. Ook toont gericht op de regio unmethylated promotor van de BACH of IL6ST genen verhoogde CpG methylering die heeft zijn gecorreleerd met een dubbele afname de gen expressie20. Onze lab heeft onlangs het gebruik van methylation van DNA voor de pathologische uitkomsten van SNCA overexpressie (Figuur 2)23verzachtende voorzien. De strategie is gebaseerd op selectieve verbetering in methylation van DNA binnen de SNCA intron 1 regio, zoals het voorheen werd gerapporteerd als hypomethylated in PD en dementie met Lewy organen (DLB) hersenen24,25, 26. Deze hypomethylation is gekoppeld aan SNCA overexpressie, waardoor een aantrekkelijk doelwit voor therapeutische interventie24,27,28. We toonden onlangs een laag niveau van methylation van DNA in de SNCA intron 1 regio hiPSC afkomstige Dopaminerge NPC's verkregen uit een PD-patiënt met de SNCA verdrievoudiging23. Het voordeel van deze experimentele model is dat de NPC's kunnen krachtig in de cultuur doorgegeven of onderscheid gemaakt volwassen neuronen tussen, waardoor een efficiënte screening genetische factoren die cellulaire fenotypen bemiddelen, met inbegrip van oxidatieve te identificeren stress en apoptosis29. Dit modelsysteem maakt bovendien wetenschappers te recapituleren de ontwikkelingstoxiciteit gebeurtenissen die vóór aanvang van de symptomen in patiënten plaatsvonden. Daarnaast vertegenwoordigen hiPSC afkomstige NPC's een geweldig hulpmiddel voor het testen van de trajecten van het cellulaire en moleculaire genexpressie is gekoppeld. Nog belangrijker is, kunnen hiPSC afkomstige NPC's gecombineerd met state-of-the-art CRISPR/Cas9-epigenome technologie sterk bevordert de ontwikkeling van 'next-generation drugs' voor vele neurodegeneratieve ziekten.
Verklein pathologische niveaus van SNCA meningsuiting en ontwikkelden we onlangs een lentivirus gebaseerde systeem die een fusieproteïne dCas9-DNMT3A en gRNA tot specifiek doelwit CpG methylering binnen de SNCA intron 1 (figuur 2A)23. Dit protocol zal lentivirale vector (LV) ontwerp en productie in detail worden beschreven. LVs vertegenwoordigen een doeltreffend middel voor het leveren van CRISPR/dCas9 onderdelen voor verschillende redenen, namelijk (i) hun vermogen om te voeren omvangrijk DNA inserts, (ii) een hoog rendement van een breed scala van cellen, met inbegrip van zowel de nondividing als de scheidslijn cellen30 transducing , en (iii) hun vermogen voor het opwekken van minimale cytotoxische en immunogene reacties. Onlangs, we de LV-systeem toegepast op hiPSC afkomstige Dopaminerge neuronen van een patiënt met de verdrievoudiging van het SNCA locus en aangetoond dat het therapeutisch potentieel van LVs voor de levering van epigenome-bewerken methylering tools23 ( Figuur 2B). Inderdaad, een LV-gRNA/dCas9-DNMT3A-systeem zorgt ervoor dat een aanzienlijke toename in methylation van DNA op de SNCA intron 1 regio. Deze stijging komt overeen met de vermindering van de niveaus van SNCA mRNA en eiwit23. Bovendien redt SNCA Downregulatie PD-gerelateerde fenotypen in de SNCA verdrievoudiging/hiPSC-afgeleid Dopaminerge neuronen (bijvoorbeeld mitochondriale ROS productie en cel levensvatbaarheid)23. Nog belangrijker is, we laten zien dat de vermindering in SNCA expressie door de LV-gRNA-dCas9-DMNT3A-systeem geschikt is voor het omkeren van de fenotypen die kenmerkend voor hiPSC afkomstige Dopaminerge neuronen van een PD-patiënt die het droegen SNCA verdrievoudiging, zoals mitochondriale ROS productie en cel levensvatbaarheid23. Het doel van dit protocol is 1) te schetsen van het protocol van de productie en de concentratie van een geoptimaliseerde LV-platform voor het genereren van virale preparaten hoge-tittered en 2) voor het beschrijven van de differentiatie van hiPSCs naar NPC's patroon om te worden volwassen Dopaminerge neuronen31,32 en de karakterisatie van de niveaus van de methylering van de gerichte regio binnen SNCA intron 1.
Lentivirale platformen hebben een groot voordeel ten opzichte van het meest populaire platform van de vector, namelijk adeno-geassocieerde vectoren (AAVs), die is van de eerstgenoemde mogelijkheid voor grotere genetische inzetstukken33,34. AAVs kan worden opgesteld tegen aanzienlijk hogere opbrengsten maar een lage verpakking capaciteit bezitten (< 4.8 kb), het gebruik ervan voor het leveren van alles-in-één CRISPR/Cas9 systemen in gevaar te brengen. Dus, lijkt het dat het LVs zou de platform-van-keuze in de toepassingen die betrokken zijn bij de levering van CRISPR/dCas9 hulpmiddelen. Het protocol hier geschetst zal dus een waardevol instrument voor onderzoekers verlangend te het effectief bewerken van epigenome componenten te leveren aan de cellen en organen. Het protocol verder schetst de strategie om te vergroten de mogelijkheden van het productie- en expressie van de vectoren via een wijziging in cis van de elementen in de vector expressie cassette30,35. De strategie is gebaseerd op de roman systeem ontwikkeld en studeerde in ons lab en wijst op haar vermogen om te produceren van virale deeltjes in de range van 1010 virale eenheden (VU) /mL30,35.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima XPN-80 Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A99839</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;M filter unit, 1L</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45-&#956;m filter unit, 500mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100mm TC-Treated Culture Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mm TC-Treated Cell Culture dishes with 20 mm Grid</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aggrewell 800</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>34811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allegra 25R tabletop centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>369434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACS</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>338960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical bottom ultracentrifugation tubes</td>
			<td>Seton Scientific</td>
			<td>5067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tube adapters</td>
			<td>Seton Scientific</td>
			<td>PN 4230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Cell Imaging Slides</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30742060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-binding 96-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3366</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted fluorescence microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DM IRB2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit (50)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reversible Strainer</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>27215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW32Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>369650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR&#174; Disposable Serological Pipets, Glass, Nonpyrogenic</td>
			<td>VWR</td>
			<td>93000-694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR&#174; Vacuum Filtration Systems</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89220-694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xMark&#8482; Microplate Absorbance plate reader</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1681150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human embryonic kidney 293T (HEK 293T) cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>7920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Adherence Rinsing Solution</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>7010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-FOXA2 Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab60721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Nestin Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab18102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-antimycotic solution, 100X</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5955-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X), minus vitamin A</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B9879 - BES</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Albumin Fraction V (7.5% solution)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15260037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>72052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Matrigel hESC-Qualified Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>08-774-552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cosmic Calf Serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30087.04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-719</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNeasy Blood &#38; Tissue Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EpiTect PCR Control DNA Set</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>596945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ DNA Methylation Kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D5001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G1800-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15750078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentle Cell Dissociation Reagent</td>
			<td>stemCell Technologies</td>
			<td>7174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Recombinant bFGF</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>78003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Recombinant&#160;EGF</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>78006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Recombinant Shh (C24II)</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>78065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>85850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17502001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Essential Amino Acid (NEAA)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30087.04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyroMark PCR Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>978703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 media</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>72232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S8636-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STEMdiff&#160;Neural Induction Medium</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>5835</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STEMdiff Neural Progenitor Freezing Medium</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>5838</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Assay FOXA2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Hs00232764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Assay GAPDH</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Hs99999905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Assay Nestin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Hs04187831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Assay OCT4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Hs04260367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Assay PPIA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Hs99999904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA 0.05%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y27632</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>72302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p24 ELISA reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal anti-p24 antibody</td>
			<td>NIH AIDS Research and Reference Reagent Program</td>
			<td>3537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit horseradish peroxidase IgG</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>12-348</td>
			<td>Working concentration 1:1500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum, Sterile, 10mL</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9023</td>
			<td>Working concentration 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIV-1 standards</td>
			<td>NIH AIDS Research and Reference Reagent Program</td>
			<td>SP968F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal mouse serum, Sterile, 500mL</td>
			<td>Equitech-Bio</td>
			<td>SM30-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal rabbit anti-p24 antibody</td>
			<td>NIH AIDS Research and Reference Reagent Program</td>
			<td>SP451T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMB peroxidase substrate</td>
			<td>KPL</td>
			<td>5120-0076</td>
			<td>Working concentration 1:10,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMD2.G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRSV-Rev</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>52961</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>psPAX2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction enzymes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BsmBI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0580S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BsrGI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0575S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRV</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0195S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KpnI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0142S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PacI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0547S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SphI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0182S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lentiviral vector platform for the efficient delivery of epigenome-editing tools into human induced pluripotent stem cell-derived disease models

Het gebruik van hiPSC-afgeleide cellen vormt een waardevolle aanpak voor het bestuderen van menselijke neurodegeneratieve ziekten. Hier beschrijven we een geoptimaliseerde protocol voor de differentiatie van hiPSCs die zijn afgeleid van een patiënt met de verdrievoudiging van de alpha-synuclein gen (SNCA) locus in Parkinson's disease (PD)-relevante Dopaminerge neuronale populaties. Accumulatie van bewijsmateriaal blijkt dat hoge niveaus van SNCA oorzakelijke voor de ontwikkeling van PD. erkennende de onvervulde behoefte om nieuwe therapeutische benaderingen voor PD, met name die welke gericht op de regulering van de expressie van de SNCA , wij recent ontwikkelde een CRISPR/dCas9 DNA-methylering-gebaseerde systeem voor epigenetically moduleren SNCA transcriptie door methylatie niveaus op de SNCA intron 1 regelgevende regio verrijken. Te leveren van het systeem, bestaande uit een dode (gedeactiveerd) versie van Cas9 (dCas9), gesmolten met het katalytische domein van de DNA methyltransferase enzym 3A (DNMT3A), een lentivirale vector wordt gebruikt. Dit systeem wordt toegepast op cellen met de verdrievoudiging van het SNCA locus en vermindert de SNCA-mRNA en eiwitniveaus met ongeveer 30% door de gerichte methylation van DNA van SNCA intron 1. De verfijnd Downregulatie van de niveaus van SNCA redt ziekte verband houdende cellulaire fenotypen. In het huidige protocol streven wij naar een stapsgewijze procedure voor het differentiëren van hiPSCs in de neurale voorlopercellen (NPC) en de vestiging en de validatie van pyrosequencing tests voor de beoordeling van het profiel van de methylering in de SNCA beschrijven intron 1. Overzichtsweergave in meer detail de lentivirus-CRISPR/dCas9-systeem dat wordt gebruikt in deze experimenten, wordt dit protocol beschreven hoe produceren, zuiveren en concentreren van lentivirale vectoren en markeer hun geschiktheid voor epigenome - en genoom-editing applicaties met behulp van hiPSCs en NPC's. Het protocol is eenvoudig aan te passen en kan worden gebruikt voor het produceren van hoge titer lentivirussen voor in vitro en in vivo toepassingen.

Validatie van de productie-titers van de vectoren van de LV-dCas9-DNMT3A-GFP/Puro in tegenstelling tot de naïeve GFP tegenhanger
Wij uitgevoerd p24gag ELISA te vergelijken tussen fysieke titers van LV-dCas9-DNMT3A-GFP/Puro met de naïeve GFP/Puro tegenhangers. Representatieve resultaten, gepresenteerd in figuur 5A, tonen aan dat de fysieke opbrengsten van de vectoren, ge...

Watch this Scientific Journal Video about Lentiviral Vector Platform for the Efficient Delivery of Epigenome-editing Tools into Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Disease Models at JoVE.com

Lentiviral Vector Platform for the Efficient Delivery of Epigenome-editing Tools into Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Disease Models

Gerichte DNA epigenome bewerken vertegenwoordigt een krachtige therapeutische aanpak. Dit protocol beschrijft de productie, reiniging en concentratie van de alles-in-één lentivirale vectoren herbergen van de CRISPR-dCas9-DNMT3A-transgenic voor bewerken van epigenome's in menselijke geïnduceerde pluripotente stamcel (hiPSC)-afgeleid van neuronen.

Lentivirale Vector Platform voor de efficiënte levering van Epigenome-bewerkingsgereedschap in mens geïnduceerde pluripotente stamcel afkomstige ziekte modellen

The use of hiPSC-derived cells represents a valuable approach to study human neurodegenerative diseases. Here, we describe an optimized protocol for the ...

Lentiviral vector platform hebben een groot voordeel ten opzichte van de meest populaire vector platform, met name vanwege het vermogen van lentivirale vectoren om grotere genetische insert tegemoet te komen. Het lijkt er dus op dat de lentivirale vector het platform van keuze zou zijn in de toepassing waarbij CRISPR/Cas-gereedschappen worden geleverd. Deze techniek imiteert het natuurlijke regulerende mechanisme van alfa-synuclein expressie die bij verminderde worden geassocieerd met ziekte.Het maakt fine-tuning van het expressieniveau versus robuuste veranderingen in genexpressie mogelijk. Ik zou sterk aanbevelen het valideren van deze of soortgelijke benaderingen met behulp van meerdere gids RNAs voor screening. Er is grote variabiliteit in gids RNA potentie.De enige manier om het te bepalen is er robuuste en uitgebreide screening en validatie. Het ontwikkelde systeem kan eenvoudig worden aangepast aan andere modelsystemen, zoals diermodellen, waaronder knaagdieren en niet-menselijke primaat. Deze follow-up experiment zou kunnen dienen als een proof of concept voor toekomstige klinische studies.Het aantonen van de procedure zal Dr.Ekaterina Ilich, een senior medewerker in mijn lab, gericht op de uitvoering van moleculair klonen procedure voor het creëren van Lentiviral Vector Plasmids in verband met dit project. Ze zal ook de belangrijkste stappen laten zien die betrokken zijn bij de productie van lentivirale vectoren. Ook het aantonen van de procedure zal dr.Lidia Tagliafierro, een postdoc van mijn lab gericht op de differentiatie van menselijke iPS cellen in pathologische relevante cellen.Ze zal de belangrijkste stappen in de oprichting van tests demonstreren om de methylatieprofielen van synuclein intron1 te evalueren. Ahila Sriskanda, een medewerker in mijn lab gericht op de cultuur van de menselijke iPS cel-afgeleide neurale voorloper cellen. Om te beginnen ontwikkelt u het DNMT3A-katalytische domein van de d-Cas9-DNMT3A-GFP door het DNMT3A-gedeelte van de vector te versterken.Na het verteren van de DNMT3A fragment met behulp van een BamH1 beperking enzym. Cloat het in de BamH1 site van de gemodificeerde PBK-301 vector die d-Cas9 draagt en geverifieerd door directe Sanger sequencing, om het zuivere Meissen reporter gen en het resulterende plasmid te vervangen door GFP digest d-Cas9-DNMT3A-P2A pure Meissen en plasmid door FSC 1. Zuiver het vectorfragment met behulp van een gelzuiveringsmethode.Bereid de wisselplaat voor door PBK-201 te verteren met FSC-1. Kloon het FSC 1-fragment in de vector om d-Cas9-DNMT3A-P2A-GFP te maken. Coat 15 centimeter platen met 0,2%gelatine voor de transfectie en wacht 10 minuten.Dan aspirate de gelatine en voeg 22,5 milliliter hoge glucose medium en 2,5 milliliter van eerder gekweekte HEK-293T celsuspensie. Incubeer de platen bij 37 graden Celsius met 5%CO2 tot het bereiken van 70 tot 80%samenvloeiing. Om de plasmid mix voldoende voor 115 centimeter plaat te bereiden gebruik maken van de vier plasmiden beschreven in het manuscript.Voeg 312,5 micro liter calciumchloride toe aan dezelfde buis van 15 milliliter met de plasmiden en breng het uiteindelijke volume op 1,25 milliliter met steriel dubbel gedestilleerd water. voeg voorzichtig 1,25 milliliter van twee X BBM-oplossing drop verstandig aan de buis tijdens het vortexen. Incubeer gedurende 30 minuten op kamertemperatuur.Aspirate het medium uit de cellen en voeg 22,5 milliliter vers bereide hoge glucose DMEM zonder serum. Voeg 2,5 milliliter van het transfectiemengsel verstandig op elke plaat. Draai de platen en incubeer bij 37 graden Celsius met 5%CO2 gedurende twee tot drie uur na incubatie voeg 2,5 milliliter serum per plaat toe om 's nachts 10% verdunning en incubaat te bereiken bij 37 graden Celsius met 5%CO2.Om het virus te oogsten verzamel je de supernatant van alle transfected cellen en trek ze in 50 milliliter conische buizen. Centrifuge op 400 tot 450 g gedurende 10 minuten op kamertemperatuur en vervolgens filteren de supernatant door 0,45 micrometer vacuümfilter eenheid. Maak vervolgens een sacharose gradiënt door de voorbereiding van conische ultra centrifugatie buizen.Voeg voorzichtig de gefilterde supernatant toe aan het verloop door de virale supernatant gelijk te verdelen onder elke ultracentrifugatiebuis die ten minste drie kwart van elke buis vult. Centrifugeren de monsters op 70000 g gedurende twee uur bij 17 graden Celsius. Verzamel voorzichtig 30%tot 60% sacharosefracties in schone buizen voeg koude 1X PBS tot 100 milliliter van het totale volume en pipet meerdere keren te mengen.Voeg voorzichtig vier milliliter van 20% sacharose in 1X PBS toe aan elke buis om het virale preparaat te stratificeren, ga verder door ongeveer 20 tot 25 milliliter van de virale oplossing per buis te pipetten. Breng de buizen zorgvuldig in balans en vercentrifugeren vervolgens twee uur lang op 70000 g bij 17 graden Celsius. Zorgvuldig aanzuigen de resterende vloeistof om volledig te verwijderen van alle vloeistof verlaten van het virus met pellets die nauwelijks zichtbaar zijn als kleine doorschijnende vlekken.Na het legen van de supernatant omkeren de buizen op papieren handdoeken om de resterende vloeistof te laten uitlekken. Voeg 70 micro liter 1X PBS toe aan de eerste buis en laat de pellet grondig opschorten. Breng de vering naar de volgende buis en herhaal met pipetten en overbrengen totdat alle pellets opnieuw zijn opgehangen.Voeg nog eens 50 micro liter 1X PBS toe aan de eerste buis en meng om het te wassen. Breng vervolgens de suspensie over naar de tweede buis om te wassen en verder te gaan met wassen en overbrengen zoals voorheen, wat ongeveer 120 micro liter van de licht melkachtige uiteindelijke suspensie oplevert. Centrifuge op 10000 g gedurende 60 seconden om een duidelijke schorsing te verkrijgen breng de supernatant naar een nieuwe buis en maak vijf micro liter aliquot en bewaar ze op negatieve 80 graden Celsius plaats een Cryovial met MD NPC in 37 graden Celsius warmteblok gedurende twee minuten en breng de ontdooide cellen naar een 15 milliliter conische buis met 10 milliliter van warme DMEM-F12.Centrifuge op 300 g gedurende vijf minuten. Aspirate de supernatant en opnieuw opschorten de cellen in twee milliliter van voorverwarmde complete N2B2 medium. Voeg twee milliliter N2B27 toe aan de celsusopening en plaat twee milliliter cellen in elke put van de eerder bereide BMM gecodeerde zes putplaat.Incubeer de cellen op 37 graden Celsius met 5% CO2 's nachts. Wanneer MD NPC's op 70% samenvloeiing zijn, vermengen ze door twee microliters lentivirusgeleiding RNA d-Cas9-DNMT3A-vectoren toe te voegen en de plaat zachtjes te wervelen. Na het uitbroeden van de cellen onder dezelfde omstandigheden als voorheen gedurende 16 uur vervangen de N2B27 medium 48 uur na de transductie.Voeg N2B27 met vijf microgram per milliliter zuivere Meissen toe om de stabiele MD NPC-lijnen te verkrijgen, laat de cellen drie weken groeien in N2B27 plus pure Meissen om het methylatieprofiel van SNCA intron 1 te karakteriseren. Haal eerst DNA uit elke stabiele transducercellijn met behulp van een DNA-extractiekit en gebruik vervolgens 800 nanogram DNA om een bisulfideconversie uit te voeren met een commercieel beschikbare kit en vervolgens een de bisulfide omgezet DNA naar 20 nanogram per micro liter. Voor de pyro-sequencing analyse bereidt de PCR master mix in een kernvrije buis overdracht van de reactieplaat naar een thermo-cycler en start de PCR.Visualiseer de amplicons met behulp van twee micro liter PCR product met een 30 en bromide kleuring na Agarose gel elektroforese. Voor pyro-sequencing tests gebruikte mengsels van onmethhyleerde en gemethyleerde door sulfide omgezet DNAs en pyro-sequencing reagentia zoals beschreven in het manuscript. Bereken de methylatiewaarden voor elke CPG-site met behulp van pyro-sequencing software fysieke opbrengsten van Lentivirus d-Cas9-DMMT3A-GFP vector en de Naïeve GFP vector gegenereerd met behulp van dit protocol zijn vergelijkbaar.Dit suggereert dat het nut van de geoptimaliseerde vectorbackbone in combinatie met het geoptimaliseerde productieprotocol resulteert in hoge opbrengsten die strakker zijn van de CRISPR-dCas9 vectortransductiesnelheden van de Lentivirus d-Cas9-DNMT3 GFP-vector vier keer lager waren dan die van de Naïeve GFP-vector, wat suggereert dat de verpakkingsefficiëntie van de CRISPR d-Cas9-RNA wordt verminderd. De transductiesnelheden van de Naïeve PURO-vector waren vijf keer hoger in vergelijking met de d-Cas9-DNMT3A-vector. Deze resultaten werden verder bevestigd door gebruik te maken van de Naïeve GFP en d-Cas9-DNMT3A-GFP.De EB gebaseerde protocol hier beschreven maakt de differentiatie van MD NPC's. hiPSCs uitgedrukt plezier potentie marker Oct4, terwijl de MD NPC wordt uitgedrukt zowel Nestin en FoxA2. Zeven pyro-sequencing tests werden ontworpen en gevalideerd voor de kwantificering van de methylatiestatus in de SNCA intron 1.Alle 7 tests werden gevalideerd en toonden lineaire correlatie, met behulp van de gevalideerde tests was het mogelijk om de methylatieniveaus te bepalen op de 23 CPGs in de SNCA intron 1 Het belangrijkste om te onthouden dan het bijwonen van deze procedure is om te werken met cellen die de juiste groei en gezondheid tonen om consistentie tussen experimenten te garanderen. De productie van linzenvectoren die in deze presentatie worden benadrukt, kan gemakkelijk worden aangenomen voor de productie van integralen die antivirussen tekortschieten en ook gemakkelijk kunnen worden opgeschaald om grotere hoeveelheden of meer geconcentreerde vectoren te genereren. Deze techniek kan de weg vrijmaken om de pathogene impact van genen de-regulatie op leeftijdsgebonden, noch de generatieve aandoeningen met inbegrip van de ziekte van Alzheimer en aanverwante dementie te verkennen.Het voordeel van linzenvectoren die zich hier ontwikkelen is dat het geen gevaar is of dat infectieuze linzenvectoren slechts een minimaal effect hebben op de celcyclus, ze zijn een veilig en betrouwbaar leveringsplatform voor gentherapietoepassingen.

Research

JoVE Journal

Genetics

Systemic Delivery of MicroRNA Using Recombinant Adeno-associated Virus Serotype 9 to Treat Neuromuscular Diseases in Rodents

Systemische levering van MicroRNA met behulp van Recombinant Adeno-associated Virus Serotype 9 voor de behandeling van neuromusculaire ziekten bij knaagdieren

RNA interference via the endogenous miRNA pathway regulates gene expression by controlling protein synthesis through post-transcriptional gene silencing. ...

An Array-based Comparative Genomic Hybridization Platform for Efficient Detection of Copy Number Variations in Fast Neutron-induced Medicago truncatula Mutants

An Array-based Comparative Genomic Hybridization Platform for Efficient Detection of Copy Number Variations in Fast Neutron-induced Medicago truncatula Mutants

Een Array gebaseerde vergelijkende Genomic hybridisatie Platform voor de efficiënte opsporing van kopie-nummer variaties in snelle neutronen geïnduceerde Medicago truncatula mutanten

Mutants are invaluable genetic resources for gene function studies. To generate mutant collections, three types of mutagens can be utilized, including ...

A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells

Een Protocol voor de productie van Integrase-deficiënte lentivirale vectoren voor CRISPR/Cas9-gemedieerde Gene knock-out in cellen verdelen

Lentiviral vectors are an ideal choice for delivering gene-editing components to cells due to their capacity for stably transducing a broad range of cells ...

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Embryo Microinjection en transplantatie techniek voor Nasonia vitripennis genoom manipulatie

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Hoogefficiënte Gene verstoring van lymfkliertest en menselijke hematopoïetische voorlopercellen door CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

Lentiviral Mediated Production of Transgenic Mice: A Simple and Highly Efficient Method for Direct Study of Founders

Lentivirale gemedieerde productie van transgene muizen: een eenvoudige en zeer efficiënte methode voor directe studie van oprichters

For almost 40 years, pronuclear DNA injection represents the standard method to generate transgenic mice with random integration of transgenes. Such a ...

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

Isolatie, karakterisering en MicroRNA gebaseerde genetische modificatie van stamcellen van menselijke tandheelkundige follikel

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

Endogene eiwit Tagging in mens geïnduceerde pluripotente stamcellen met behulp van CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

Isolating, Sequencing and Analyzing Extracellular MicroRNAs from Human Mesenchymal Stem Cells

Isoleren, Sequencing en analyseren van extracellulaire MicroRNAs van menselijke mesenchymale stamcellen

Extracellular and circulating RNAs (exRNA) are produced by many cell types of the body and exist in numerous bodily fluids such as saliva, plasma, serum, ...

Lentiviral Mediated Gene Silencing in Human Pseudoislet Prepared in Low Attachment Plates

Lentivirale gemedieerde gen-uitschakeling in humaan pseudo-eilandje bereid in lage bevestigings platen

Various genetic tools are available to modulate genes in pancreatic islets of rodents to dissect function of islet genes for diabetes research. However, ...