Name: lentiviral vector platform for the efficient delivery of epigenome-editing tools into human induced pluripotent stem cell-derived disease models
Uploaded: 2019-03-29T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lentiviral Vector Platform for the Efficient Delivery of Epigenome-editing Tools into Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Disease Models at JoVE.com

Ce travail a été financé en partie par le prix de développement de neurotechnologie Kahn (au décret) et la National instituts de santé/National Institute of Neurological Disorders et Stroke (NINDS/NIH) (R01 NS085011 à O.C.).

1. conception et Production de Virus
<ol><li>Construction et conception de plasmide Remarque : La construction d’un vecteur de LV-gRNA-dCas9-DNMT3A all-in-one est effectuée au moyen d’une production- et cassette d’expression expression-optimisée publiés par Ortinski et al.,30. La cassette de vector porte une répétition du site reconnaissance du facteur de transcription Sp1 et une suppression de l’état-of-the-art dans le non traduites (U3') rég...

LVs ont commencé à émerger en tant que véhicule de choix pour l’épigénome édition, surtout dans le contexte des maladies génétiques, principalement en raison de leur capacité à (i) accueillir grandes charges utiles de l’ADN et (ii) transduce efficacement un large éventail de diviser et les cellules ne se divisant pas. L’efficacité de grand emballage de la VL est particulièrement utile pour les applications impliquant des emballages des systèmes CRISPR/dCas9 qui sont surdimensionnés. Dans cette persp...

Plusieurs plates-formes d’édition épigénome ont été récemment mis au point pour cibler toutes les séquences d’ADN dans les régions qui contrôlent l’expression de gène1,2. Les outils de retouche épigénome créés sont conçus pour (i) règlent la transcription, (ii) modifier les modifications post-traductionnelles histone, (iii) modifier la méthylation de l’ADN et (iv) modulent les interactions élément régulateur. L’approche d’ancrer les modificateurs de transcription/chromatine à un Cas9 (morts) désactivé (dCas9) proviendraient précédemment développés plates-formes édition épigénome comme zinc finger protéines (ZFP) et transcription activator comme effecteurs (contes), héberger un domaine effecteur transcriptionnelle puissant (ED) fondue vers le domaine de liaison à l’ADN conçu (DBD)3. Les résultats du phénotype désiré tels que l’activation ou la répression est défini par la molécule effectrice ancrée aux loci endogène (Figure 1). Pour créer des activateurs transcriptional programmables, dCas9/gRNA modules sont liés à VP164,5,6 (Figure 1 a), un domaine d’activation virale qui recrute Pol II et la machinerie de transcription généraux. La modification de ce système a inclus VP64, un tétramère de domaines VP16, fournissant une encore plus robustes activation tarifaire5,6. Le système a été avec succès employé pour activer des régions codantes et non codantes en ciblant des promoteurs et des éléments de régulation. Ce qui est important, même si les molécules de VP64 ne modifient pas directement la structure de la chromatine dans la région de la cible, il recrute les modificateurs de la chromatine qui lie les résultats dans les dépôts des marques actives (euchromatine), y compris comme l’acétylation H3/H4 et H3-K4 di / tri-méthylation5,6. En plus de la VP64, la sous-unité p65 de NF-κB humain complexe a été attachée à la dCas9/gRNA module7. Fait intéressant, l’attachement de ces effecteurs dans les régions en amont des sites de début de transcription (TSSs) et au sein des promoteurs se traduit par une induction forte gène. Néanmoins, VP64 et p65 Effecteurs peuvent aussi exercer les effets activatrices tout en étant liés aux régions situées en aval du TSSs et exhausteurs distale7,8. Pour obtenir une réponse transcriptionnelle plus robuste, multiples fusions dCas9-VP64 ou dCas9-p65 doivent être recrutés à une cible unique locus9,10. Par conséquent, le développement récent des activateurs de nouvelle génération, qui recrutent plusieurs domaines effecteurs par un complexe unique dCas9-gRNA, tels que SunTag, a donné lieu à une plus forte capacité activation comparant à dCas9-VP64 fusion homologues11 , 12. une meilleure activation de la transcription a été obtenue par la fusion de VP64, p65 et Rta (VPR), un domaine de transactivation de gamma-virus de l’herpès, à l’extrémité C-terminale de la dCas913 (Figure 1 a). Des systèmes similaires de CRISPR/dCas9 ont été développés pour répression spécifique à la cible (Figure 1 b).
Répression génique endogène peut être réalisée avec les fusions de répresseur machiné par le biais de divers mécanismes (Figure 1 b). Il a été démontré que les systèmes CRISPR/dCas9, liés à la répresseur DBD (même sans un domaine effecteur/s), peuvent taire efficacement l’expression des gènes tandis qu’attachés à un promoteur ou en amont/en aval-TSS régions3,6 ,14. Les effets sur la transcription est causé par l’interférence stérique de la liaison de facteur de transcription et de la transformation de l’ARN polymérase. Néanmoins, des approches plus globales sont nécessaires, car la répression génique par stérique seul n’est souvent pas suffisante pour silencieux d’échappement robuste. Le développement récent de la prochaine génération de silencieux basées sur des systèmes CRISPR/dCas9 transportant des domaines répresseur transcriptionnel (DRT), modificateurs d’histone (H3-K9 di-/ tri-méthylation, H3-K27 di-/ tri-méthylation ; H3-K36 di-/ tri-méthylation, H3/H4 désacétylation) et la méthylation de l’ADN (CpG) a conduit à la construction d’outils épigénétiques permettant plus robustes pour faire taire les effets4,5,15,16, 17,18,19,20. Il a été démontré que le recrutement de ces modificateurs épigénétiques de l’ADN peut conduire à la formation de plus la chromatine condensée et fermée, qui génèrent habituellement un plus puissant silencieux issue21,22. Le plus souvent silencieux domaine utilisé avec DBDs est la boîte Krüppel-associés (KRAB)4,5. Le recrutement du facteur a été démontré pour correspondre avec les modifications de la chromatine ; Néanmoins, les mécanismes de ces modifications doivent encore être élucidé16,17,18. Récemment, il a été démontré que la localisation de KRAB à l’ADN peut promouvoir l’Assemblée de l’histone-méthyltransférase SETDB1 et les complexes de NuRD histone désacétylation (HDAC), ce qui suggère la possibilité que ces interactions médient la formation de condensation de la chromatine et transcriptionnelle silencieux3,13. Comme approche alternative, domaines Effecteurs peuvent être fusionnés à DBDs à créer une protéine silencieux épigénétique personnalisée. Ce système directement catalyse répressif ADN marques ou modifications d’histone.
Récemment, l’utilisation de systèmes CRISPR/dCas9 synthétiques attaché à l’enzyme DNMT3A a été réaffectée transcriptionnelle de désactivation. DNMT3A catalyse la méthylation de l’ADN qui exerce une répression transcriptionnelle tout au long de la formation de l’hétérochromatine sur les promoteurs de gènes endogènes et autres régions régulatrices (Figure 1 b)18,20. McDonald et al.,18 et20 de la Vojta et coll. ont été les premiers auteurs de déclarer que la méthylation de l’ADN peut être utilisée pour épigénome-gene silencing ou de répression, ce qui démontre que le système de fusion de plasmide-prononcé dCas9-DNMT3A peut renforcer puissamment méthylation de la cytosine autour les TSS18,20. McDonald et ses collaborateurs ont démontré que l’emploi de la stratégie peut-être aboutir à une réduction significative (environ 40 %) un gène suppresseur de la tumeur, CDKN2A ARNm du niveau18. De même, ciblant la région non méthylé promoteur des gènes BACH ou IL6ST montre méthylation accrue de CpG qui a été corrélée avec une diminution de double dans l' expression de gène20. Notre laboratoire a récemment réaffecté l’utilisation de méthylation de l’ADN pour atténuer les résultats pathologiques du SNCA surexpression (Figure 2)23. La stratégie repose sur l’amélioration sélective dans la méthylation de l’ADN dans la région d’intron 1 SNCA , comme il a été signalé auparavant comme hypométhylés en PD et démence avec Lewy organes (DLB) cerveaux24,25, 26. Cette hypométhylation a été liée à la surexpression SNCA , offrant ainsi une cible attractive pour une intervention thérapeutique24,27,28. Nous avons récemment montré un faible niveau de méthylation de l’ADN dans l’intron SNCA 1 région hiPSC dérivés dopaminergiques PNJs obtenus chez un patient de PD avec le SNCA triplication23. L’avantage de ce modèle expérimental est que les PNJ peuvent être robuste propagées en culture ou encore se différencient en neurones matures, ce qui permet un dépistage efficace identifier les facteurs génétiques qui véhiculent des phénotypes cellulaires, y compris oxydant stress et apoptose29. En outre, ce système modèle permet aux scientifiques de récapituler les événements du développement qui a eu lieu avant l’apparition des symptômes chez les patients. En outre, les dérivés hiPSC PNJ représente un excellent outil pour tester les voies moléculaires et cellulaires associées à l’expression des gènes. Ce qui est important, dérivés hiPSC PNJ combinée à la technologie CRISPR/Cas9-épigénome state-of-the-art peut faciliter considérablement le développement de « médicaments de nouvelle génération » pour beaucoup de maladies neurodégénératives.
Pour réduire les niveaux pathologiques d’expression SNCA, nous avons récemment mis au point un système de lentivirus portant une protéine de fusion dCas9-DNMT3A et gRNA à spécifiquement la méthylation CpG cible au sein de l’intron SNCA 1 (Figure 2 a)23. Ce protocole décrit vecteur lentiviral (LV) conception et réalisation en détail. LVs représentent un moyen efficace de prestation des modules CRISPR/dCas9 pour plusieurs raisons, à savoir (i) leur capacité à effectuer de volumineux ADN insère, (ii) un rendement élevé de transduction d’un large éventail de cellules, y compris les cellules ne se divisant pas tant démarcation30 et (iii) leur capacité à induire des réponses cytotoxiques et immunogènes minimales. Récemment, nous avons appliqué le système de LV de neurones dopaminergiques hiPSC dérivé d’un patient ayant la triplication du locus SNCA et démontré le potentiel thérapeutique de LVs pour la livraison de l’épigénome-édition méthylation outils23 ( Figure 2 b). En effet, un système de LV-gRNA/dCas9-DNMT3A provoque une augmentation significative dans la méthylation de l’ADN à la région d’intron 1 SNCA . Cette augmentation correspond à la réduction des niveaux d’ARNm et protéines SNCA 23. En outre, SNCA downregulation sauve des phénotypes liés PD dans les SNCA triplication/hiPSC-dérivés dopaminergiques neurones (c'est-à-dire mitochondrial ROS production et cellulaires la viabilité)23. Ce qui est important, nous avons démontré que la réduction SNCA expression par le système de LV-gRNA-dCas9-DMNT3A est capable d’inverser les phénotypes qui sont caractéristiques des neurones dopaminergiques dérivés hiPSC provenant d’un patient de PD qui portaient la SNCA triples emplois, tels que mitochondries ROS production et cellule viabilité23. Le but du présent protocole est 1) pour décrire le protocole de production et de la concentration d’une plate-forme de LV optimisée pour générer des préparations virales haute-titrés et 2) pour décrire la différenciation des hiPSCs en PNJ modelé pour devenir mature dopaminergique neurones31,32 et la caractérisation des niveaux méthylation de la région ciblée au sein de l’intron SNCA 1.
Plates-formes des gènes ont un avantage majeur sur la plus populaire plateforme de vecteur, à savoir virus adeno-associé vecteurs (AAVs), qui est la capacité de ce dernier pour accueillir les plus grands inserts génétique33,34. AAVs peuvent être générés à des rendements significativement plus élevés mais possèdent une capacité d’empaquetage faible (< 4,8 kb), compromettre leur utilisation pour fournir des systèmes CRISPR/Cas9 all-in-one. Il semble donc que la VL serait la plateforme de choix dans les applications impliquées dans la fourniture d’outils CRISPR/dCas9. Par conséquent, le protocole décrit ici sera un outil précieux pour les chercheurs souhaitant dispenser efficacement l’épigénome-montage de composants aux organes et cellules. De plus, le protocole décrit la stratégie visant à accroître les capacités de production et d’expression des vecteurs via une modification en cis des éléments dans le vecteur expression cassette30,35. La stratégie est basée sur le roman système mis au point dans notre laboratoire et études met en évidence sa capacité à produire des particules virales dans la gamme de 1010 unités virale (VU) / ml30,,35.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima XPN-80 Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A99839</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;M filter unit, 1L</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45-&#956;m filter unit, 500mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100mm TC-Treated Culture Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mm TC-Treated Cell Culture dishes with 20 mm Grid</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aggrewell 800</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>34811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allegra 25R tabletop centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>369434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACS</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>338960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical bottom ultracentrifugation tubes</td>
			<td>Seton Scientific</td>
			<td>5067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tube adapters</td>
			<td>Seton Scientific</td>
			<td>PN 4230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Cell Imaging Slides</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30742060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-binding 96-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3366</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted fluorescence microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DM IRB2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit (50)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reversible Strainer</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>27215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW32Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>369650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR&#174; Disposable Serological Pipets, Glass, Nonpyrogenic</td>
			<td>VWR</td>
			<td>93000-694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR&#174; Vacuum Filtration Systems</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89220-694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xMark&#8482; Microplate Absorbance plate reader</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1681150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human embryonic kidney 293T (HEK 293T) cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>7920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Adherence Rinsing Solution</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>7010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-FOXA2 Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab60721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Nestin Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab18102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-antimycotic solution, 100X</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5955-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X), minus vitamin A</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B9879 - BES</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Albumin Fraction V (7.5% solution)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15260037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>72052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Matrigel hESC-Qualified Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>08-774-552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cosmic Calf Serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30087.04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-719</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNeasy Blood &#38; Tissue Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EpiTect PCR Control DNA Set</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>596945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ DNA Methylation Kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D5001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G1800-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15750078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentle Cell Dissociation Reagent</td>
			<td>stemCell Technologies</td>
			<td>7174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Recombinant bFGF</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>78003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Recombinant&#160;EGF</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>78006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Recombinant Shh (C24II)</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>78065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>85850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17502001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Essential Amino Acid (NEAA)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30087.04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyroMark PCR Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>978703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 media</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>72232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S8636-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STEMdiff&#160;Neural Induction Medium</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>5835</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STEMdiff Neural Progenitor Freezing Medium</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>5838</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Assay FOXA2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Hs00232764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Assay GAPDH</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Hs99999905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Assay Nestin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Hs04187831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Assay OCT4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Hs04260367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Assay PPIA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Hs99999904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA 0.05%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y27632</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>72302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p24 ELISA reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal anti-p24 antibody</td>
			<td>NIH AIDS Research and Reference Reagent Program</td>
			<td>3537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit horseradish peroxidase IgG</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>12-348</td>
			<td>Working concentration 1:1500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum, Sterile, 10mL</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9023</td>
			<td>Working concentration 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIV-1 standards</td>
			<td>NIH AIDS Research and Reference Reagent Program</td>
			<td>SP968F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal mouse serum, Sterile, 500mL</td>
			<td>Equitech-Bio</td>
			<td>SM30-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal rabbit anti-p24 antibody</td>
			<td>NIH AIDS Research and Reference Reagent Program</td>
			<td>SP451T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMB peroxidase substrate</td>
			<td>KPL</td>
			<td>5120-0076</td>
			<td>Working concentration 1:10,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMD2.G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRSV-Rev</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>52961</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>psPAX2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction enzymes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BsmBI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0580S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BsrGI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0575S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRV</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0195S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KpnI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0142S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PacI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0547S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SphI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0182S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lentiviral vector platform for the efficient delivery of epigenome-editing tools into human induced pluripotent stem cell-derived disease models

L’utilisation de cellules dérivées d’hiPSC représente une approche utile pour étudier les maladies neurodégénératives humaines. Nous décrivons ici un protocole optimisé pour la différenciation des hiPSCs provenant d’un patient présentant la triplication du locus du gène (SNCA) d’alpha-synucléine dans la maladie de Parkinson (MP)-les populations neuronales dopaminergiques pertinentes. Accumuler des preuves a montré que des niveaux élevés de SNCA sont responsables pour le développement de PD. reconnaissant la non satisfaits ont besoin d’établir de nouvelles approches thérapeutiques pour PD, en particulier celles qui visent la régulation de l’expression SNCA , nous récemment mis au point un système CRISPR/dCas9-méthylation-basées sur l’ADN pour moduler épigénétiquement SNCA transcription en enrichissant les niveaux méthylation de la région régulatrice de SNCA intron 1. Pour fournir le système, composé d’un mort (désactivée) version de Cas9 (dCas9) a fusionné avec le domaine catalytique de l’ADN méthyltransférase enzyme 3 a (DNMT3A), un vecteur lentiviral est utilisé. Ce système est appliqué aux cellules avec la triplication du locus SNCA et réduit le SNCA-ARNm et protéines d’environ 30 % par le biais de la méthylation de l’ADN ciblée de SNCA intron 1. La diminution de l’expression affinée des niveaux SNCA sauve des phénotypes cellulaires liés à la maladie. Dans le protocole actuel, notre objectif est de décrire une procédure étape par étape afin de différencier les hiPSCs dans les cellules progénitrices neurales (PNJ) et l’établissement et la validation des tests pyrosequencing pour évaluer le profil de méthylation dans le SNCA intron 1. Pour connaître plus en détail le système de lentivirus-CRISPR/dCas9 utilisé dans ces expériences, ce protocole décrit comment produire, purifier et concentrer les vecteurs lentiviraux et de mettre en évidence leurs qualités pour les applications d’édition épigénome et génome utilisant hiPSCs et PNJ. Le protocole est facilement adaptable et peut être utilisé pour produire des lentivirus titre élevé pour les applications in vitro et in vivo.

Valider les titres de la production des vecteurs LV-dCas9-DNMT3A-GFP/Puro par rapport à l’équivalent GFP naïf
Nous avons effectué p24gag ELISA à comparer entre les titres physiques de LV-dCas9-DNMT3A-GFP/Puro avec les homologues GFP/Puro naïf. Les résultats représentatifs, présentés dans la Figure 5 a, démontrent que les rendements physiques des vecteurs, gé...

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Lentiviral Vector Platform for the Efficient Delivery of Epigenome-editing Tools into Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Disease Models

La cible ADN épigénome édition représente une approche thérapeutique efficace. Ce protocole décrit la production, purification et concentration des vecteurs lentiviraux all-in-one, hébergeant le transgène CRISPR-dCas9-DNMT3A pour applications d’édition épigénome dans les cellules souches humaines pluripotentes induites (hiPSC)-dérivé de neurones.

Vecteur lentiviral plate-forme pour la livraison efficace des outils d’édition épigénome dans l’homme induit des modèles de maladies dérivées de cellules souches pluripotentes

The use of hiPSC-derived cells represents a valuable approach to study human neurodegenerative diseases. Here, we describe an optimized protocol for the ...

La plate-forme vectorielle lentivirale a un avantage majeur par rapport à la plate-forme vectorielle la plus populaire, en particulier en raison de la capacité des vecteurs lentiviraux à accueillir un insert génétique plus important. Ainsi, il semble que le vecteur lentiviral serait la plate-forme de choix dans l’application impliquent la livraison d’outils CRISPR/Cas. Cette technique imite le mécanisme réglementaire naturel de l’expression alpha-synucléine qui, lorsqu’elle est altérée, est associée à la maladie.Il permet de peaufiner le niveau d’expression par rapport aux changements robustes dans l’expression des gènes. Je recommanderais fortement de valider cette approche ou d’autres approches similaires en utilisant plusieurs ARN guides pour le dépistage. Il y a une grande variabilité dans la puissance d’ARN de guide.La seule façon de le déterminer est qu’il y ait un dépistage et une validation robustes et complets. Le système développé peut être facilement adapté à d’autres systèmes modèles tels que les modèles animaux, y compris les rongeurs et les primates non humains. Ces expériences de suivi pourraient servir de preuve de concept pour de futures études cliniques.La Dre Ekaterina Ilich, membre du personnel supérieur de mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure de clonage moléculaire pour la création de plasmides vecteurs lentiviraux liés à ce projet. Elle démontrera également les étapes clés de la production de vecteurs lentiviraux. Le Dr Lidia Tagliafierro, postdoc de mon laboratoire qui se concentre sur la différenciation des cellules iPS humaines en cellules pathologiques pertinentes, démontrera également la procédure.Elle démontrera les étapes clés de l’établissement d’analyses pour évaluer les profils de méthylation de synucléine intron1. Ahila Sriskanda, membre du personnel de mon laboratoire qui se concentre sur la culture des cellules progénitrices neurales dérivées des cellules iPS humaines. Pour commencer, développez le domaine catalytique DNMT3A à partir du d-Cas9-DNMT3A-GFP en amplifiant la partie DNMT3A du vecteur.Après avoir digéré le fragment DNMT3A à l’aide d’une enzyme de restriction BamH1. Cloat il dans le site BamH1 du vecteur PBK-301 modifié portant d-Cas9 et vérifié par séquençage direct Sanger, pour remplacer le gène pur journaliste Meissen et le plasmide résultant avec GFP digest d-Cas9-DNMT3A-P2A pure Meissen et plasmide avec FSC 1. Purifier le fragment vectoriel à l’aide d’une méthode de purification du gel.Préparer l’insert en digérant PBK-201 avec FSC-1. Clonez le fragment FSC 1 dans le vecteur pour créer d-Cas9-DNMT3A-P2A-GFP. Enrober les plaques de 15 centimètres de 0,2% de gélatine pour la transfection et attendre 10 minutes.Aspirez ensuite la gélatine et ajoutez 22,5 millilitres de milieu de glucose élevé et 2,5 millilitres de suspension cellulaire HEK-293T précédemment cultivé. Incuber les plaques à 37 degrés Celsius avec 5% de CO2 jusqu’à atteindre 70 à 80% de confluence. Pour préparer le mélange plasmide suffisant pour 115 centimètres plaque utiliser les quatre plasmides décrits dans le manuscrit.Ajouter 312,5 micro litres d’un chlorure de calcium molaire au même tube de 15 millilitres avec les plasmides et porter le volume final à 1,25 millilitres à l’aide d’eau distillée double stérile. ajouter délicatement 1,25 millilitres de deux X BBM solution goutte sage au tube tout en vortex. Incuber pendant 30 minutes à température ambiante.Aspirez le milieu des cellules et ajoutez 22,5 millilitres de DMEM à haute teneur en glucose fraîchement préparé sans sérum. Ajouter 2,5 millilitres du mélange de transfection goutte sage à chaque assiette. Faites tourbillonner les plaques et couvez à 37 degrés Celsius avec 5 % de CO2 pendant deux à trois heures après l’incubation ajoutez 2,5 millilitres de sérum par plaque pour atteindre 10 % de dilution et incuber pendant la nuit à 37 degrés Celsius avec 5 % de CO2.Pour récolter le virus recueillir le supernatant de toutes les cellules transfectées et les tirer dans des tubes coniques de 50 millilitres. Centrifugeuse à 400 à 450 g pendant 10 minutes à température ambiante, puis filtrer le supernatant à travers l’unité de filtre à vide de 0,45 micromètre. Ensuite, créez un gradient saccharose en préparant des tubes coniques ultra centrifugation.Ajoutez soigneusement le supernatant filtré au gradient en distribuant également le supernatant viral parmi chaque tube d’ultra centrifugation remplissant au moins les trois quarts de chaque tube. Centrifuger les échantillons à 70000 g pendant deux heures à 17 degrés Celsius. Recueillir doucement 30% à 60% fractions de saccharose dans des tubes propres ajouter froid 1X PBS jusqu’à 100 millilitres de volume total et pipette plusieurs fois à mélanger.Ajouter soigneusement quatre millilitres de saccharose de 20% en 1X PBS à chaque tube pour stratifier la préparation virale continuer par pipetting environ 20 à 25 millilitres de la solution virale par tube. Équilibrez soigneusement les tubes, puis centrifugez à 70000 g pendant deux heures à 17 degrés Celsius. Aspirez soigneusement le liquide restant pour enlever complètement tout le liquide laissant le virus contenant des granulés qui sont à peine visibles comme de petites taches translucides.Après avoir vidé le supernatant inverser les tubes sur du papier absorbant pour permettre au reste du liquide de s’écouler. Ajouter 70 micro litres de 1X PBS au premier tube et bien pipette pour suspendre à nouveau la pastille. Transférer la suspension dans le tube suivant et répéter avec le pipetage et le transfert jusqu’à ce que toutes les granulés soient re-suspendues.Ajouter 50 micro litres supplémentaires de 1X PBS au premier tube et mélanger pour le laver. Ensuite, transférez la suspension dans le deuxième tube pour la laver et continuer à laver et à transférer comme précédemment, ce qui donne environ 120 micro litres de la suspension finale légèrement laiteuses. Centrifugeuse à 10000 g pendant 60 secondes pour obtenir une suspension claire transférer le supernatant à un nouveau tube et faire cinq micro litre aliquot et les stocker à 80 degrés Celsius négatifs placer un Cryovial avec MD NPC en bloc thermique de 37 degrés Celsius pendant deux minutes et transférer les cellules décongelées à un tube conique de 15 millilitres avec 10 millilitres de chaleur DMEM-F12.Centrifugeuse à 300 g pendant cinq minutes. Aspirez le supernatant et suspendez les cellules en deux millilitres de milieu N2B2 complet préchauffé. Ajouter deux millilitres de N2B27 à la suspension cellulaire et plaquer deux millilitres de cellules dans chaque puits de la plaque bmm précédemment préparée codée six puits.Incuber les cellules à 37 degrés Celsius avec 5% de CO2 pendant la nuit. Lorsque les PNJ md sont à 70% confluent, transduisez-les en ajoutant deux micro litres de vecteurs RNA d-Cas9-DNMT3A guident lentivirus et tourbillonnent doucement la plaque. Après avoir couver les cellules dans les mêmes conditions qu’auparavant pendant 16 heures remplacer le milieu N2B27 48 heures après la transduction.Ajouter N2B27 avec cinq microgrammes par millilitre de Meissen pur pour obtenir les lignées stables md NPC, faire croître les cellules pendant trois semaines en N2B27 plus meissen pur pour caractériser le profil de méthylation de SNCA intron 1. D’abord extraire l’ADN de chaque lignée cellulaire transducteur stable à l’aide d’une trousse d’extraction d’ADN, puis utiliser 800 nanogrammes d’ADN pour effectuer une conversion de bisulfide avec un kit disponible dans le commerce, puis un adn converti en bisulfide en 20 nanogrammes par micro litre. Pour l’analyse pyro-séquençage préparer le mélange maître PCR dans un noyau tube libre transférer la plaque de réaction à un thermo-cycleur et démarrer le PCR.Visualisez les amplicons à l’aide de deux micro litres de produit PCR avec une coloration de 30 et de bromure suite à l’électrophorésie du gel Agarose. Pour les analyses pyro-séquençant, on utilisait des mélanges d’adhérents non méthylés et méthylés par des ADN convertis au sulfide et des reagents pyro-séquençants tels que décrits dans le manuscrit. Calculer les valeurs de méthylation pour chaque site CPG à l’aide d’un logiciel de pyro-séquençage Les rendements physiques du vecteur Lentivirus d-Cas9-DMMT3A-GFP et du vecteur Naïf GFP généré à l’aide de ce protocole sont comparables.Ceci suggère que l’utilité de l’épine dorsale vectorielle optimisée combinée avec le protocole de production optimisé a comme résultat des rendements élevés plus serrés des taux de transduction de vecteurs CRISPR-dCas9 du vecteur de Lentivirus d-Cas9-DNMT3 le vecteur de GFP était quatre fois inférieur à celui du vecteur naïf de GFP suggérant que l’efficacité d’empaquetage du CRISPR d-Cas9-ARN soit réduite. Les taux de transduction du vecteur Naïf PURO étaient cinq fois plus élevés que le vecteur d-Cas9-DNMT3A. Ces résultats ont été confirmés en utilisant le GFP naïf et d-Cas9-DNMT3A-GFP.Le protocole basé sur eb décrit ici permet la différenciation des PNJ. hiPSCs exprimé marqueur de puissance de plaisir Oct4 tandis que le MD NPC est exprimé à la fois Nestin et FoxA2. Sept analyses pyro-séquençant ont été conçues et validées pour la quantification du statut de méthylation dans l’intron 1 de SNCA.Les 7 analyses ont été validées et ont montré une corrélation linéaire, en utilisant les analyses validées, il a été possible de déterminer les niveaux de méthylation aux 23 CPG dans le SNCA intron 1 La chose la plus importante à retenir que d’assister à cette procédure est de travailler avec des cellules qui montrent une croissance et une santé adéquates pour assurer la cohérence entre les expériences. La production de vecteurs de lentilles mis en évidence dans cette présentation peut être facilement adoptée à la production d’intégrales déficientes anti-virus, il est également peut être facilement mis à l’échelle pour générer de plus grandes quantités ou des vecteurs plus concentrés. Cette technique peut ouvrir la voie à l’exploration de l’impact pathogène de la déréglementation des gènes sur les troubles liés à l’âge ni sur les troubles génératifs, y compris la maladie d’Alzheimer et les démences connexes.L’avantage des vecteurs de lentilles se développent ici, c’est que ce n’est pas un danger ou non vecteurs de lentilles infectieuses n’ont qu’un effet minimal sur le cycle cellulaire, ils sont sûr et fiable plate-forme de livraison pour les applications de thérapie génique.

Research

JoVE Journal

Genetics

Systemic Delivery of MicroRNA Using Recombinant Adeno-associated Virus Serotype 9 to Treat Neuromuscular Diseases in Rodents

Délivrance systémique des micro-ARN, à l’aide de Recombinant Adeno-associated Virus sérotype 9 pour traiter des maladies neuromusculaires chez les rongeurs

RNA interference via the endogenous miRNA pathway regulates gene expression by controlling protein synthesis through post-transcriptional gene silencing. ...

Recherche

Génétique

An Array-based Comparative Genomic Hybridization Platform for Efficient Detection of Copy Number Variations in Fast Neutron-induced Medicago truncatula Mutants

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Une tableau comparatif génomique hybridation plate-forme pour détection efficace de copie nombre Variations chez les Mutants induite par neutrons rapides Medicago truncatula

Mutants are invaluable genetic resources for gene function studies. To generate mutant collections, three types of mutagens can be utilized, including ...

A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells

Un protocole pour la Production de vecteurs LENTIVIRAUX intégrase déficient pour CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout dans les cellules en Division

Lentiviral vectors are an ideal choice for delivering gene-editing components to cells due to their capacity for stably transducing a broad range of cells ...

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

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Microinjection de l’embryon et de la Technique de Transplantation pour la Manipulation du génome Nasonia vitripennis

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Perturbation de gène hautement efficace des cellules progénitrices hématopoïétiques murins et humains par CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

Lentiviral Mediated Production of Transgenic Mice: A Simple and Highly Efficient Method for Direct Study of Founders

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For almost 40 years, pronuclear DNA injection represents the standard method to generate transgenic mice with random integration of transgenes. Such a ...

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

Isolement, caractérisation et axée sur les micro-ARN de la Modification génétique des cellules souches humaines follicule dentaire

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

Protéine endogène de marquage dans l’homme induites par les cellules souches pluripotentes à l’aide de CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

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Isoler, séquençage et l’analyse des microARN extracellulaires de cellules souches mésenchymateuses humaines

Extracellular and circulating RNAs (exRNA) are produced by many cell types of the body and exist in numerous bodily fluids such as saliva, plasma, serum, ...

Lentiviral Mediated Gene Silencing in Human Pseudoislet Prepared in Low Attachment Plates

Le silençage du gène médiévirus lentiviral dans le pseudoislet humain préparé dans les plaques à faible attachement

Various genetic tools are available to modulate genes in pancreatic islets of rodents to dissect function of islet genes for diabetes research. However, ...