Name: lentiviral vector platform for the efficient delivery of epigenome-editing tools into human induced pluripotent stem cell-derived disease models
Uploaded: 2019-03-29T14:30:00
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Diese Arbeit wurde teilweise von den Kahn Neurotechnologie Development Award (für OC) und die nationalen Institute der Gesundheit/National Institute of Neurological Disorders und Schlaganfall (NIH/NINDS) finanziert (R01 NS085011, OC).

1. Entwicklung und Produktion von Virus
<ol><li>Plasmid-Design und Konstruktion Hinweis: Der Bau von einem all-in-One-LV-gRNA-dCas9-DNMT3A-Vektor erfolgt mithilfe einer Produktions- und Ausdruck optimiert Expressionskassette von Ortinski Et Al.30veröffentlicht. Die Vektor-Kassette trägt eine Wiederholung des Standortes Anerkennung der Transkriptionsfaktor Sp1 und eine State-of-the-Art-Löschung innerhalb der unübersetzte (U3 ") und Umgebung: eine 3' Long t...

LVs haben damit begonnen, als das Fahrzeug der Wahl für das Epigenom bearbeiten, vor allem im Zusammenhang mit genetischen Erkrankungen entstehen, vor allem wegen ihrer Fähigkeit, (i) Platz für große DNA-Nutzlasten und (Ii) effizient transduzieren eine Vielzahl von Teilen und nondividing Zellen. Die große Verpackung Wirksamkeit der LVs ist besonders vorteilhaft für die Anwendungen, bei denen Verpackung der CRISPR/dCas9-Systeme, die übergroß sind. Aus dieser Perspektive stellen LVs die Plattform der Wahl für die ...

Mehreren Epigenom-editing-Plattformen wurden vor kurzem entwickelt, um jede DNA-Sequenzen in den Regionen abzielen, die gen-Expression-1,-2zu kontrollieren. Die erstellten Epigenom-editing-Tools sollen (i) Transkription regulieren, (Ii) Änderungen posttranslationale Histon-Modifikationen, (Iii) ändern DNA-Methylierung und (iv) modulieren regulatorisches Element Interaktionen. Der Ansatz, die Transkription/Chromatin-Modifizierer auf eine deaktivierte (tot) Cas9 zu verankern (dCas9) von zuvor entwickelten Epigenom-editing-Plattformen, z. B. Zink angehoben finger Proteine (ZFPs) und Transkription Aktivator-ähnlichen Effektoren (Geschichten) beherbergen eine potente transkriptionelle Effektor-Domäne verschmolzen (ED) mit der gestalteten DNA-bindende Domäne (DBD)3. Die Ergebnisse der gewünschten Phänotyp wie Aktivierung oder Unterdrückung zeichnet sich durch die Effektor-Molekül an der endogenen Loci (Abbildung 1) verankert. Um programmierbare transcriptional Aktivatoren zu erstellen, sind dCas9/gRNA Module mit VP164,5,6 (Abbildung 1A), einer viralen Aktivierungsdomäne verknüpft, die Pol-II und die allgemeine Transkriptionsmaschinerie rekrutiert. Die Änderung dieses Systems hat VP64, ein Tetramer VP16 Domains, bietet eine noch robustere Aktivierung Rate5,6enthalten. Das System wurde erfolgreich eingesetzt, um Codierung und nichtkodierende Regionen zu aktivieren, indem Sie auf Förderer und regulatorischen Elemente. Wichtig ist, auch wenn VP64 Moleküle der Chromatinstruktur in der Zielregion nicht direkt ändern, es Rekruten Chromatin-Modifikatoren, die Ergebnisse im Ablagerung der aktiven (Euchromatin) Marken, unter anderem als H3/H4 Acetylierung und H3-K4 di binden / Tri-Methylierung5,6. Neben VP64 hat der p65-Untereinheit des menschlichen NF-κB-Komplexes zur dCas9/gRNA Modul7angebunden worden. Interessanterweise führt die Anbindehaltung von diese Effektoren für die Regionen stromaufwärts der Transkription Start Seiten (TSK) und innerhalb von Promotoren einen starken gen Induktion. Dennoch können VP64 und p65 Effektoren auch die activatory Wirkungen ausüben, während der Verbindung mit den Regionen flussabwärts von TSK und am distalen Geschmacksverstärker7,8. Eine robustere transcriptional Antwort zu entlocken, müssen mehrere dCas9-VP64 oder dCas9-p65 Fusionen in ein einzelnes Ziel Locus9,10eingestellt werden. So führte die jüngste Entwicklung der nächsten Generation Aktivatoren, die mehrere Effektor Domains durch einen einzigen dCas9-gRNA Komplex, wie SunTag, rekrutieren eine stärkere Aktivierung Fähigkeit im Vergleich zu dCas9-VP64 Fusion Kollegen11 , 12. eine verbesserte transkriptionelle Aktivierung erzielt wurde, durch die Verschmelzung von VP64, p65 und Rta (VPR), einer Domäne werden von Gamma-Herpesviren an den C-Terminus des dCas913 (Abb. 1A). Ähnliche CRISPR/dCas9-Systeme wurden für Target-spezifische Unterdrückung (Abbildung 1 b) entwickelt.
Endogenen gen Unterdrückung kann mit veränderter Repressor Fusionen durch eine Vielzahl von Mechanismen (Abbildung 1 b) erreicht werden. Es hat sich gezeigt, dass CRISPR/dCas9 Systeme, verbunden mit der Repressor DBD (auch ohne ein Effektor-Domäne/s), effizient Genexpression während angebunden, um einen Promotor oder upstream/downstream-TSS Regionen3,6 Schweigen kann ,14. Die Auswirkungen auf die Transkription wird durch die sterische Einmischung der Transkription Faktor Bindung und RNA-Polymerase Verarbeitung verursacht. Dennoch sind umfassendere Ansätze notwendig, da gen Unterdrückung durch sterische Behinderung allein oft nicht ausreicht für robuste zum Schweigen zu bringen. Die jüngste Entwicklung der nächsten Generation von Schalldämpfern auf Basis CRISPR/dCas9 Systeme tragen transkriptioneller Repressor Domänen (TRDs), Histon Modifikatoren (H3-K9 - di / Tri-Methylierung, H3-K27 di-/ Tri-Methylierung; H3-K36 di-/ Tri-Methylierung, H3/H4 Deacetylation), und führte zum Bau von epigenetischen Tools ermöglicht stabilere Effekte4,5,15,16, zum Schweigen zu bringen (CpG) DNA-Methylierung 17,18,19,20. Es wurde nachgewiesen, dass die Rekrutierung von diese epigenetischen Modifikatoren der DNA führen zur Bildung von mehr geschlossen und verkürzte Chromatin, die in der Regel ein potenter Stummschaltungs-Ergebnis21,22erzeugen. Die am häufigsten Stummschaltungs-Domäne mit DBDs verwendet ist der Krüppel-assoziierten Box (Krabbe)4,5. Die Einstellung des Faktors nachgewiesen Chromatin Änderungen entsprechen; Allerdings sind die Mechanismen dieser Modifikationen noch aufgeklärt16,17,18sein. Vor kurzem hat sich gezeigt, dass die Lokalisierung von KRAB DNA die Montage von Histon-Methyltransferase SETDB1 und die Histon Deacetylation (HDAC) NuRD-komplexe fördern kann, die Möglichkeit, die diese Interaktionen die Bildung von vermitteln Chromatin-Kondensation und transcriptional silencing3,13. Als ein alternativer Ansatz können Effektor Domänen, DBDs, erstellen Sie eine benutzerdefinierte epigenetische silencing Protein fusioniert werden. Dieses System katalysiert direkt repressive DNA-Spuren oder Histon-Modifikationen.
Vor kurzem hat die Verwendung von synthetischen CRISPR/dCas9-Systeme angebunden an das Enzym DNMT3A transkriptionelle Deaktivierung zweckentfremdet worden. DNMT3A katalysiert DNA-Methylierung, die transkriptionelle Repression während der Bildung von Heterochromatin auf endogene gen Promotoren und anderen regulatorischen Regionen (Abbildung 1 b)18,20ausübt. McDonald Et Al.18 und Vojta Et Al.20 waren die ersten Autoren berichten, dass DNA-Methylierung verwendet werden kann, für Epigenom-Gen-silencing oder Unterdrückung, nachzuweisen, dass das Plasmid geliefert dCas9-DNMT3A-Fusion-System potent verbessern können Cytosin Methylierung um die TSS-18,-20. McDonald und Kollegen gezeigt, dass die Beschäftigung der Strategie von einer signifikanten Reduktion (ca. 40 %) führen kann in einem Tumor-Suppressor-gen Level CDKN2A mRNA18. Ebenso zeigt das unmethylated Promotorregion BACH oder IL6ST Gene targeting erhöhter CpG Methylierung, die mit einem doppelten Rückgang der gen-Expression-20korreliert worden. Unser Labor hat vor kurzem die Verwendung von DNA-Methylierung für die pathologischen Ergebnisse der SNCA Überexpression (Abbildung 2)23mildernde umgewidmet. Die Strategie basiert auf selektiven Verstärkung in der DNA-Methylierung in der SNCA Intron 1 Region, wie es bereits berichtet wurde, zu hypomethyliert bei Morbus Parkinson und Demenz mit Lewy Körpern (DLB) Gehirn24,25, 26. Diese Hypomethylierung ist mit SNCA Überexpression, bietet somit ein attraktives Ziel für therapeutische Intervention24,27,28verbunden worden. Wir zeigten kürzlich einem niedrigen Niveau der DNA-Methylierung in der SNCA Intron 1 Region in HiPSC abgeleitet dopaminergen NPCs aus einem PD-Patienten mit der SNCA Verdreifachung23gewonnen. Der Vorteil dieser experimentellen Modells ist, dass die NPCs können robust in Kultur vermehrt oder weiter in Reife Neuronen ermöglichen eine effiziente Sortierung differenziert, genetische Faktoren zu identifizieren, die zelluläre Phänotypen, einschließlich oxidativen vermitteln Stress und Apoptose29. Darüber hinaus ermöglicht dieses Modellsystem Wissenschaftler, die entwicklungspolitische Ereignisse zu rekapitulieren, die vor dem Einsetzen der Symptome bei Patienten aufgetreten sind. Darüber hinaus vertreten HiPSC abgeleitet NPCs ein großartiges Werkzeug, um die zellulären und molekularen Wege zugeordnete Genexpression zu testen. Wichtig ist, können HiPSC abgeleitet NPCs in Kombination mit State-of-the-Art CRISPR/Cas9-Epigenom Technologie die Entwicklung der "Next-Generation-Drogen" für viele Neurodegenerative Erkrankungen erheblich erleichtern.
Um pathologische Verringerung der SNCA Ausdruck wir kürzlich entwickelt, ein Lentivirus basierendes System mit einem dCas9-DNMT3A Schmelzverfahren Protein und gRNA, speziell Ziel CpG Methylierung innerhalb der SNCA Intron 1 (Abbildung 2A)23. Dieses Protokoll wird Lentivirale Vektor (LV)-Design und Produktion im Detail beschreiben. LVs repräsentieren ein wirksames Mittel zur Bereitstellung von CRISPR/dCas9 Komponenten aus mehreren Gründen, nämlich (i) ihre Fähigkeit, sperrige DNA tragen einfügt, (Ii) einen hohen Wirkungsgrad von transducing eine Vielzahl von Zellen, einschließlich der trennende und nondividing Zellen30 , und (Iii) ihre Fähigkeit, minimale zytotoxische und immunogenen Reaktionen auslösen. Vor kurzem, wir das LV-System auf HiPSC abgeleitet dopaminergen Neuronen eines Patienten mit der Verdreifachung der SNCA Locus angewendet und demonstriert das therapeutische Potenzial von LVs für die Lieferung der Epigenom-Bearbeitung Methylierung Werkzeuge23 ( Abbildung 2 b). In der Tat bewirkt, dass eine LV-gRNA/dCas9-DNMT3A System eine deutliche Steigerung in der DNA-Methylierung bei der SNCA Intron 1 Region. Diese Erhöhung entspricht die Reduktion in der Höhe der SNCA mRNA und Protein23. Außerdem rettet SNCA Herabregulation PD-bezogene Phänotypen in der SNCA Verdreifachung/HiPSC-abgeleitete dopaminergen Neuronen (z. B. mitochondrialen ROS Produktion und Zelle Tragfähigkeit)23. Wichtig ist, haben wir bewiesen, dass der Rückgang der SNCA Ausdruck vom LV-gRNA-dCas9-DMNT3A-System ist in der Lage, die Umkehrung der Phänotypen, die charakteristisch sind für HiPSC abgeleitet dopaminergen Neuronen von einem PD-Patienten, die die durchgeführt SNCA Verdreifachung, z. B. mitochondrialen ROS Produktion und Zelle Lebensfähigkeit23. Das Ziel dieses Protokolls ist (1) das Protokoll der Produktion und Konzentration einer optimierten LV-Plattform für die Erzeugung von qualitativ tittered virale Vorbereitungen zu skizzieren und (2) die Differenzierung des HiPSCs in NPCs zu Reifen dopaminergen gemustert zu beschreiben Neuronen31,32 und die Charakterisierung der Methylierung Ebenen der gezielten Region innerhalb SNCA Intron 1.
Lentivirale Plattformen haben einen großen Vorteil über die beliebteste Plattform der Vektor, nämlich Adeno-assoziierten Vektoren (Flugabwehrpanzer), die das ehemalige Fähigkeit, größere genetische Einsätze33,34unterzubringen ist. Flugabwehrpanzer auf deutlich höhere Erträge generiert werden können, sondern besitzen eine niedrige Verpackungsleistung (< 4,8 kb), gefährden ihre Verwendung für die Bereitstellung von all-in-One CRISPR/Cas9 Systeme. So scheint es, dass die LVs die Plattform der Wahl in den Anwendungen an der Lieferung beteiligten CRISPR/dCas9 Werkzeuge wäre. Daher werden die hier beschriebene Protokoll ein wertvolles Werkzeug für die Forscher in dem Wunsch, effektiv Epigenom-Bearbeiten von Komponenten zu den Zellen und Organen liefern. Das Protokoll weiter skizziert die Strategie, um die Produktion und Ausdruck der Vektoren über eine Änderung in der GUS der Elemente innerhalb der Vektor Ausdruck Kassette30,35zu verbessern. Die Strategie basiert auf dem Roman System entwickelt und in unserem Labor untersucht und zeigt seine Fähigkeit auf virale Partikel im Bereich von 1010 virale Einheiten (VU) /mL30,35zu produzieren.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima XPN-80 Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A99839</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;M filter unit, 1L</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45-&#956;m filter unit, 500mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100mm TC-Treated Culture Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mm TC-Treated Cell Culture dishes with 20 mm Grid</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aggrewell 800</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>34811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allegra 25R tabletop centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>369434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACS</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>338960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical bottom ultracentrifugation tubes</td>
			<td>Seton Scientific</td>
			<td>5067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tube adapters</td>
			<td>Seton Scientific</td>
			<td>PN 4230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Cell Imaging Slides</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30742060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-binding 96-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3366</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted fluorescence microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DM IRB2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit (50)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reversible Strainer</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>27215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW32Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>369650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR&#174; Disposable Serological Pipets, Glass, Nonpyrogenic</td>
			<td>VWR</td>
			<td>93000-694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR&#174; Vacuum Filtration Systems</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89220-694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xMark&#8482; Microplate Absorbance plate reader</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1681150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human embryonic kidney 293T (HEK 293T) cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>7920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Adherence Rinsing Solution</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>7010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-FOXA2 Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab60721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Nestin Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab18102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-antimycotic solution, 100X</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5955-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X), minus vitamin A</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B9879 - BES</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Albumin Fraction V (7.5% solution)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15260037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>72052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Matrigel hESC-Qualified Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>08-774-552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cosmic Calf Serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30087.04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-719</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNeasy Blood &#38; Tissue Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EpiTect PCR Control DNA Set</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>596945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ DNA Methylation Kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D5001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G1800-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15750078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentle Cell Dissociation Reagent</td>
			<td>stemCell Technologies</td>
			<td>7174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Recombinant bFGF</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>78003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Recombinant&#160;EGF</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>78006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Recombinant Shh (C24II)</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>78065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>85850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17502001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Essential Amino Acid (NEAA)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30087.04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyroMark PCR Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>978703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 media</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>72232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S8636-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STEMdiff&#160;Neural Induction Medium</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>5835</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STEMdiff Neural Progenitor Freezing Medium</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>5838</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Assay FOXA2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Hs00232764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Assay GAPDH</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Hs99999905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Assay Nestin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Hs04187831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Assay OCT4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Hs04260367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Assay PPIA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Hs99999904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA 0.05%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y27632</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>72302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p24 ELISA reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal anti-p24 antibody</td>
			<td>NIH AIDS Research and Reference Reagent Program</td>
			<td>3537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit horseradish peroxidase IgG</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>12-348</td>
			<td>Working concentration 1:1500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum, Sterile, 10mL</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9023</td>
			<td>Working concentration 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIV-1 standards</td>
			<td>NIH AIDS Research and Reference Reagent Program</td>
			<td>SP968F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal mouse serum, Sterile, 500mL</td>
			<td>Equitech-Bio</td>
			<td>SM30-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal rabbit anti-p24 antibody</td>
			<td>NIH AIDS Research and Reference Reagent Program</td>
			<td>SP451T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMB peroxidase substrate</td>
			<td>KPL</td>
			<td>5120-0076</td>
			<td>Working concentration 1:10,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMD2.G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRSV-Rev</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>52961</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>psPAX2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction enzymes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BsmBI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0580S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BsrGI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0575S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRV</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0195S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KpnI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0142S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PacI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0547S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SphI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0182S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lentiviral vector platform for the efficient delivery of epigenome-editing tools into human induced pluripotent stem cell-derived disease models

Die Verwendung von HiPSC abgeleitete Zellen stellt einen wertvollen Ansatz zur menschlichen neurodegenerativen Krankheiten zu studieren. Hier beschreiben wir ein optimiertes Protokoll für die Differenzierung von HiPSCs abgeleitet von einem Patienten mit der Parkinson-Krankheit (PD) die Verdreifachung der Alpha-Synuclein Gens (SNCA) Locus-relevanten dopaminergen neuronalen Populationen. Beweise sammeln hat gezeigt, dass hohe Konzentrationen von SNCA ursächlich für die Entwicklung der PD erkennen die ungedeckten neue therapeutische Ansätze für PD, vor allem die Ausrichtung auf die Regulierung der SNCA Ausdruck, schaffen müssen wir vor kurzem entwickelt ein CRISPR/dCas9-DNA-Methylierung-basiertes System zur epigenetisch modulieren SNCA Transkription durch Methylierung Ebenen auf der SNCA Intron 1 regulatorischen Region zu bereichern. Das System, bestehend aus einem Toten liefern (deaktiviert) Version des Cas9 (dCas9) fusioniert mit der katalytischen Domäne des DNA-Methyltransferase Enzym 3A (DNMT3A), Lentivirale Vektor verwendet. Dieses System gilt für Zellen mit der Verdreifachung der SNCA -Locus und reduziert die SNCA-mRNA und Protein-Spiegel um ca. 30 % durch die gezielte DNA-Methylierung der SNCA Intron 1. Die fein abgestimmte Herabregulation der SNCA Ebenen rettet krankheitsbezogenen zelluläre Phänotypen. Das aktuelle Protokoll wollen wir eine schrittweise Anleitung zur Differenzierung von HiPSCs in neurale Vorläuferzellen (NPCs) und die Etablierung und Validierung von Pyrosequenzierung Assays für die Auswertung des Profils Methylierung in der SNCA beschreiben Intron 1. Um im Detail die Lentivirus-CRISPR/dCas9-System in diesen Experimenten verwendeten umreißen, beschreibt dieses Protokoll zu produzieren, zu reinigen und Lentivirale Vektoren zu konzentrieren und ihre Eignung für Epigenom und Genom-Bearbeitung Anwendungen mit hervorheben HiPSCs und NPCs. Das Protokoll ist leicht anpassbar und kann verwendet werden, um hohe Titer Lentiviren für in-vitro- und in-vivo Anwendungen zu produzieren.

Validierung der Produktion Titer der LV-dCas9-DNMT3A-GLP/Puro Vektoren im Vergleich zu den naiven GFP Gegenstück
Wir führten p24gag ELISA zwischen physischen Titer von LV-dCas9-DNMT3A-GLP/Puro mit den naiven GFP/Puro Kollegen zu vergleichen. Repräsentative Ergebnisse in Abbildung 5A, zeigen, dass körperliche Erträge der Vektoren, erzeugt unter Verwendung des Protokol...

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Lentiviral Vector Platform for the Efficient Delivery of Epigenome-editing Tools into Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Disease Models

Gezielte DNA Epigenom Bearbeitung stellt eine leistungsstarke Therapieansatz. Dieses Protokoll beschreibt die Produktion, Reinigung und Konzentration der all-in-One Lentivirale Vektoren beherbergen das CRISPR-dCas9-DNMT3A Transgen für Epigenom-editing-Anwendungen in menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (HiPSC)-Neuronen abgeleitet.

Lentivirale Vektor-Plattform für die effiziente Bereitstellung von Epigenom-editing-Tools in menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen abgeleitet Krankheitsmodelle

The use of hiPSC-derived cells represents a valuable approach to study human neurodegenerative diseases. Here, we describe an optimized protocol for the ...

LentiviralE Vektorplattform haben einen großen Vorteil gegenüber der beliebtesten Vektorplattform, insbesondere wegen der Fähigkeit von lentiviralen Vektoren, größere genetische Einsätze aufzunehmen. So scheint es, dass der lentivirale Vektor die Plattform der Wahl in der Anwendung wäre, die die Lieferung von CRISPR/Cas-Tools beinhaltet. Diese Technik imitiert den natürlichen Regulierungsmechanismus der Alpha-Synuclein-Expression, die, wenn sie beeinträchtigt sind, mit Krankheiten verbunden sind.Es ermöglicht eine Feinabstimmung der Expressionsebene im Vergleich zu robusten Veränderungen in der Genexpression. Ich würde dringend empfehlen, diese oder ähnliche Ansätze mit mehreren Guide RNAs für das Screening zu validieren. Es gibt eine große Variabilität in der Rna-Potenz des Führers.Die einzige Möglichkeit, es zu bestimmen, ist ein robustes und umfassendes Screening und Validierung. Das entwickelte System kann leicht an andere Modellsysteme wie Tiermodelle wie Nagetier und nichtmenschliche Primaten angepasst werden. Diese Folgeexperimente könnten als Beweis für zukünftige klinische Studien dienen.Demonstriert wird das Verfahren von Dr.Ekaterina Ilich, einer leitenden Mitarbeiterin meines Labors, die sich auf die Durchführung des molekularen Klonverfahrens zur Herstellung von Lentiviral Vector Plasmiden im Zusammenhang mit diesem Projekt konzentriert. Sie wird auch die wichtigsten Schritte bei der Herstellung von Lentiviral Vector demonstrieren. Ebenfalls das Verfahren demonstrieren wird Dr.Lidia Tagliafierro, ein Postdoc aus meinem Labor, der sich auf die Differenzierung menschlicher iPS-Zellen in pathologisch relevante Zellen konzentriert.Sie wird die wichtigsten Schritte zur Erstellung von Assays zur Bewertung der Methylierungsprofile von Synuclein intron1 demonstrieren. Ahila Sriskanda, eine Mitarbeiterin in meinem Labor, die sich auf die Kultur menschlicher iPS-Zell-abgeleiteter neuronaler Vorläuferzellen konzentriert. Entwickeln Sie zunächst die Katalysedomäne DNMT3A aus dem d-Cas9-DNMT3A-GFP, indem Sie den DNMT3A-Teil des Vektors verstärken.Nach der Verdauung des DNMT3A-Fragments mit einem BamH1-Restriktionsenzym. Cloat es in die BamH1-Stelle des modifizierten PBK-301 Vektors tragen d-Cas9 und durch direkte Sanger-Sequenzierung verifiziert, um das reine Meiden-Reporter-Gen und das resultierende Plasmid mit GFP digest d-Cas9-DNMT3A-P2A reines Meiden und Plasmid mit FSC 1 zu ersetzen. Reinigen Sie das Vektorfragment mit einer Gelreinigungsmethode.Bereiten Sie den Einsatz vor, indem Sie PBK-201 mit FSC-1 verdauen. Klonen Sie das FSC 1-Fragment in den Vektor, um d-Cas9-DNMT3A-P2A-GFP zu erstellen. 15 Zentimeter Platten mit 0,2% Gelatine für die Transfektion beschichten und 10 Minuten warten.Dann die Gelatine aspirieren und 22,5 Milliliter hochglukosemedium und 2,5 Milliliter zuvor kultivierte HEK-293T Zellsuspension hinzufügen. Inkubieren Sie die Platten bei 37 Grad Celsius mit 5% CO2 bis zu 70 bis 80% Zusammenfluss. Um die Plasmidmischung vorzubereiten, die für 115 Zentimeter Platte ausreicht, verwenden Sie die vier plasmiden, die im Manuskript beschrieben sind.Fügen Sie 312,5 Mikroliter eines Molaren-Calciumchlorids mit den Plasmiden in die gleiche 15-Milliliter-Röhre und bringen Sie das Endvolumen mit sterilem Doppeldestilliertem Wasser auf 1,25 Milliliter. fügen Sie vorsichtig 1,25 Milliliter von zwei X BBM Lösung fallen weise auf die Röhre während des Wirbelns. 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.Das Medium aus den Zellen absaugen und 22,5 Milliliter frisch zubereitetes DMEM mit hoher Glukose ohne Serum hinzufügen. Fügen Sie 2,5 Milliliter der Transfektionsmischung tropfen weise auf jede Platte. Wirbeln Sie die Platten und inkubieren bei 37 Grad Celsius mit 5%CO2 für zwei bis drei Stunden nach der Inkubation fügen Sie 2,5 Milliliter Serum pro Platte, um 10% Verdünnung zu erreichen und über Nacht bei 37 Grad Celsius mit 5%CO2 inkubieren.Um das Virus zu ernten, sammeln Sie den Überstand aus allen transfizierten Zellen und ziehen Sie sie in 50 Milliliter konische Röhren. Zentrifuge bei 400 bis 450 g für 10 Minuten bei Raumtemperatur und filtert dann den Überstand durch 0,45 Mikrometer Vakuumfiltereinheit. Als nächstes erstellen Sie einen Saccharosegradienten durch die Vorbereitung konischer Ultrazentrifugationsrohre.Fügen Sie den gefilterten Überstand vorsichtig zum Gradienten hinzu, indem Sie den viralen Überstand gleichmäßig auf jedes Ultrazentrifugationsrohr verteilen, das mindestens drei Viertel jedes Rohres füllt. Zentrifugieren Sie die Proben bei 70000 g für zwei Stunden bei 17 Grad Celsius. Sammeln Sie 30% bis 60% Saccharose-Fraktionen vorsichtig in saubere Rohre fügen kalte 1X PBS bis zu 100 Milliliter Gesamtvolumen und Pipette mehrmals zu mischen.Fügen Sie vorsichtig vier Milliliter 20%Saccharose in 1X PBS zu jeder Röhre hinzu, um die virale Zubereitung zu schichten, indem Sie etwa 20 bis 25 Milliliter der viralen Lösung pro Röhre pipetieren. Die Rohre vorsichtig balancieren und dann bei 70000 g zwei Stunden bei 17 Grad Celsius zentrieren. Sorgsam die restliche Flüssigkeit ansaugen, um die gesamte Flüssigkeit vollständig zu entfernen, sodass das Virus Pellets enthält, die als kleine transluzente Flecken kaum sichtbar sind.Nach dem Entleeren des Überstandes invertieren Sie die Rohre auf Papiertüchern, damit die restliche Flüssigkeit abfließen kann. Fügen Sie 70 Mikroliter 1X PBS in das erste Rohr und gründlich Pipette, um das Pellet wieder aufzuhängen. Übertragen Sie die Suspension auf das nächste Rohr und wiederholen Sie sie mit Pipettierung und Übertragung, bis alle Pellets wieder aufgehängt sind.Fügen Sie dem ersten Rohr weitere 50 Mikroliter 1X PBS hinzu und mischen Sie es, um es zu waschen. Dann die Suspension auf das zweite Rohr zum Waschen und weiterwaschen und wie bisher übertragen, ergibt sich ca. 120 Mikroliter der leicht milchigen Endsuspension. Zentrifuge bei 10000 g für 60 Sekunden, um eine klare Suspension zu erhalten, übertragen Sie den Überstand auf ein neues Rohr und machen Fünf Mikroliter aliquot und speichern Sie sie bei negativen 80 Grad Celsius legen Sie einen Cryovial mit MD NPC in 37 Grad Celsius Wärmeblock für zwei Minuten und übertragen Sie die aufgetauten Zellen auf ein 15 Milliliter konisches Rohr mit 10 Milliliter n warmen DMEM-F12.Zentrifuge bei 300 g für fünf Minuten. Aspirieren Sie den Überstand und suspendieren Sie die Zellen in zwei Millilitern vorgewärmtem vollständigen N2B2-Medium. Fügen Sie zwei Milliliter N2B27 in die Zellsuspension und Platte zwei Milliliter Zellen in jedem Brunnen der zuvor vorbereiteten BMM kodiert sechs WellPlatte.Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius mit 5% CO2 über Nacht. Wenn MD-NPCs bei 70 % Konfluss sind, transducieren Sie sie, indem Sie zwei Mikroliter Lentivirus-Führungs-RNA d-Cas9-DNMT3A-Vektoren hinzufügen und die Platte sanft wirbeln. Nach der Inkubation der Zellen unter den gleichen Bedingungen wie zuvor für 16 Stunden ersetzen Sie die N2B27 Medium 48 Stunden nach der Transduktion.Fügen Sie N2B27 mit fünf Mikrogramm pro Milliliter reinen Meiden hinzu, um die stabilen MD-NPC-Linien zu erhalten, wachsen Sie die Zellen für drei Wochen in N2B27 plus reinem Meiden, um das Methylierungsprofil von SNCA intron 1 zu charakterisieren. Extrahieren Sie zunächst DNA aus jeder stabilen Transducer-Zelllinie mit einem DNA-Extraktionskit, dann verwenden Sie 800 Nanogramm DNA, um eine Bisulfidumwandlung mit einem handelsüblichen Kit durchzuführen, und dann wandelte ein Bisulfid DNA in 20 Nanogramm pro Mikroliter um. Für die Pyro-Sequenzierungsanalyse bereiten Sie den PCR-Master-Mix in einem Kernfreirohr vor, übertragen Sie die Reaktionsplatte auf einen Thermocycler und starten Sie die PCR.Visualisieren Sie die Amplicons mit zwei MikroliterPCR-Produkt mit einer 30- und Bromidfärbung nach Agarose-Gelelektrophorese. Für pyrosequenzierende Assays wurden Mischungen von nicht methyliert und methyliert durch Sulfid umgewandelte DNAs und Pyrosequenzierungsreagenzien verwendet, wie im Manuskript beschrieben. Berechnen Sie die Methylierungswerte für jeden CPG-Standort mit pyrosequenzierenden Software physikalischen Erträgen von Lentivirus d-Cas9-DMMT3A-GFP Vektor und der Naive GFP Vektor mit diesem Protokoll generiert sind vergleichbar.Dies deutet darauf hin, dass der Nutzen des optimierten Vektor-Backbones in Kombination mit dem optimierten Produktionsprotokoll zu hohen Erträgen führt, die der CRISPR-dCas9-Vektortransduktionsraten des Lentivirus d-Cas9-DNMT3 GFP-Vektors um das Vierfache unter denen des Naive GFP-Vektors liegen, was darauf hindeutet, dass die Verpackungseffizienz der CRISPR d-Cas9-RNA reduziert wird. Die Transduktionsraten des Naive PURO Vektors waren fünfmal höher als der d-Cas9-DNMT3A-Vektor. Diese Ergebnisse wurden durch die Verwendung des Naive GFP und d-Cas9-DNMT3A-GFP weiter bestätigt.Das hier beschriebene EB-basierte Protokoll ermöglicht die Differenzierung von MD-NPCs. hiPSCs drückten Dengen-Potenzmarker Oct4 aus, während der MD NPC sowohl Nestin als auch FoxA2 exprimiert wird. Sieben Pyrosequenzierungs-Assays wurden für die Quantifizierung des Methylierungsstatus im SNCA-Intron 1 konzipiert und validiert.Alle 7 Assays wurden validiert und zeigten eine lineare Korrelation, wobei es mit den validierten Assays möglich war, die Methylierungswerte an den 23 CPGs im SNCA intron 1 zu bestimmen. Die Produktion von Linsenvektoren, die in dieser Präsentation hervorgehoben werden, kann leicht zur Produktion von Integralen mit mangelhaften Viren übernommen werden, die auch leicht skaliert werden können, um größere Mengen oder konzentriertere Vektoren zu erzeugen. Diese Technik kann den Weg ebnen, um die pathogenen Auswirkungen der Deregulation von Genen auf das Alter oder die generativen Erkrankungen einschließlich der Alzheimer-Krankheit und damit zusammenhängende Demenzerkrankungen zu erforschen.Der Vorteil von Linsenvektoren, die hier entstehen, ist, dass es nicht gefahroder oder nicht infektiöse Linsenvektoren haben nur minimale Auswirkungen auf den Zellzyklus sie sind sicher und zuverlässige Bereitstellungplattform für Gentherapie-Anwendungen.

Research

JoVE Journal

Genetics

Systemic Delivery of MicroRNA Using Recombinant Adeno-associated Virus Serotype 9 to Treat Neuromuscular Diseases in Rodents

Systemische Lieferung von MicroRNA mit rekombinanten Adeno-assoziierten Virus Serotyp 9 zur Behandlung von neuromuskulärer Erkrankungen bei Nagern

RNA interference via the endogenous miRNA pathway regulates gene expression by controlling protein synthesis through post-transcriptional gene silencing. ...

Forschung

Genetik

An Array-based Comparative Genomic Hybridization Platform for Efficient Detection of Copy Number Variations in Fast Neutron-induced Medicago truncatula Mutants

An Array-based Comparative Genomic Hybridization Platform for Efficient Detection of Copy Number Variations in Fast Neutron-induced Medicago truncatula Mutants

Eine Array-basierte Comparative genomische Hybridisierung Plattform für effiziente Erkennung der Kopie Zahl Variationen in schnellen Neutronen induziert Medicago Truncatula Mutanten

Mutants are invaluable genetic resources for gene function studies. To generate mutant collections, three types of mutagens can be utilized, including ...

A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells

Ein Protokoll für die Produktion der Integrase-defizienten Lentivirale Vektoren für CRISPR/Cas9-vermittelte Gen Knockout in teilenden Zellen

Lentiviral vectors are an ideal choice for delivering gene-editing components to cells due to their capacity for stably transducing a broad range of cells ...

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Embryo Mikroinjektion und Transplantation Technik für Nasonia Vitripennis Genom Manipulation

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Hocheffiziente gen Störung der murinen und menschlichen hämatopoetischen Vorläuferzellen von CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

Lentiviral Mediated Production of Transgenic Mice: A Simple and Highly Efficient Method for Direct Study of Founders

Lentivirale vermittelte Produktion von transgenen Mäusen: eine einfache und hocheffiziente Methode für die direkte Untersuchung der Gründer

For almost 40 years, pronuclear DNA injection represents the standard method to generate transgenic mice with random integration of transgenes. Such a ...

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

Isolierung, Charakterisierung und RNA-basierte gentechnische Veränderung von menschlichen Dental follikelstimulierendes Stammzellen

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

Endogene Protein Tagging in menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen mit CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

Isolating, Sequencing and Analyzing Extracellular MicroRNAs from Human Mesenchymal Stem Cells

Isolieren, Sequenzierung und Analyse von extrazellulären MicroRNAs aus humanen mesenchymalen Stammzellen

Extracellular and circulating RNAs (exRNA) are produced by many cell types of the body and exist in numerous bodily fluids such as saliva, plasma, serum, ...

Lentiviral Mediated Gene Silencing in Human Pseudoislet Prepared in Low Attachment Plates

Lentiviral vermittelte Gen-Silencing in humanem Pseudoislet in niedrigen Befestigungsplatten zubereitet

Various genetic tools are available to modulate genes in pancreatic islets of rodents to dissect function of islet genes for diabetes research. However, ...