Name: lentiviral vector platform for the efficient delivery of epigenome-editing tools into human induced pluripotent stem cell-derived disease models
Uploaded: 2019-03-29T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lentiviral Vector Platform for the Efficient Delivery of Epigenome-editing Tools into Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Disease Models at JoVE.com

עבודה זו הייתה מומן בחלקו על ידי בפרס הפיתוח Neurotechnology קאהן (כדי האו. סי) ואת נבחרת מוסדות של בריאות/לאומי המכון של הפרעות נוירולוגיות שבץ (NIH/NINDS) (NS085011 R01 כדי האו. סי).

1. מערכת העיצוב והייצור וירוס
<ol><li>פלסמיד עיצוב ובנייה הערה: הבנייה של וקטור LV-gRNA-dCas9-DNMT3A ה-all-in-one מתבצע באמצעות הפקה- ואת קלטת ביטוי ממוטב ביטוי שפורסמו על-ידי Ortinski et al.30. בקלטת וקטור נושא שידור חוזר של האתר זיהוי של גורם שעתוק Sp1 ומחיקה של המדינה-of-the-art בתוך לא...

הזינו אותו החלו להסתמן כמו הרכב של epigenome עריכה, במיוחד בהקשר של מחלות גנטיות, בעיקר בגלל היכולת שלהם (i) להכיל מטענים דנ א גדולים ו- (ii) מגלי ביעילות מגוון רחב של חלוקת תאים nondividing. היעילות אריזה גדולה של אותו מועיל במיוחד עבור יישומים הכוללים אריזות של מערכות CRISPR/dCas9 אשר גדולות מדי. מנקודת מבט ?...

פלטפורמות מרובות לעריכת epigenome פותחו לאחרונה להתמקד על כל רצפי DNA אזורים ששולטים ג'ין ביטוי1,2. הכלים לעריכת epigenome שנוצר מתוכננים (i) להסדיר שעתוק, (ii) לשנות שינוי היסטון posttranslational, (iii) לשנות מתילציה DNA, (iv) לווסת את רכיב אינטראקציות. הגישה כדי לעגן את מכפילי תמלול/כרומטין Cas9 (מת) שהפעלתם בוטלה (dCas9) מופעל מבעבר מפותח לעריכת epigenome פלטפורמות, כגון אבץ אצבע חלבונים (ZFPs) ו effectors כמו מפעיל שעתוק (אגדות), מחסה תחום אפקטור תעתיק חזק (אד) התמזגו לתחום ה-DNA מחייב מעוצב (DBD)3. התוצאות של פנוטיפ הרצויה כגון הפעלה או דיכוי מוגדרת על-ידי המולקולה אפקטור מעוגנת את לוקוסים אנדוגני (איור 1). כדי ליצור activators תעתיק לתכנות, dCas9/gRNA מודולים מקושרים VP164,5,6 (איור 1 א'), תחום הפעלה ויראלי מגייס Pol II והמנגנון שעתוק כללי. השינוי של מערכת זו כללה VP64, tetramer של תחומים VP16, מתן אפילו יותר חזקה הפעלת קצב5,6. המערכת כבר מועסקים בהצלחה להפעיל קידוד ואזורים noncoding על ידי מיקוד היזמים ואלמנטים רגולטוריות. חשוב, אף-על-פי מולקולות VP64 ישירות אל תשנה את הכרומטין באזור היעד, היא מגייסת מכפילי כרומטין אשר מאגד תוצאות בעדות של הסימנים פעיל (euchromatin), כולל acetylation H3/H4, H3-K4 di / tri-מתילציה5,6. בנוסף VP64, יחידת משנה p65 של המתחם NF-κB האנושי יש כבר קשור את מודול dCas9/gRNA7. מעניין, קשירה של אלה effectors לאזורים במעלה הזרם של שעתוק התחלה אתרים (אזעקת דייט) ובתוך היזמים תוצאות אינדוקציה גנים חזקים. למרות זאת, effectors VP64 ו p65 שיכולים להפעיל גם את ההשפעות activatory תוך כדי להיות מקושר לאזורים ממוקם במורד הזרם של אזעקת דייט, משפרי דיסטלי7,8. כדי מביאות לתגובה תעתיק עמיד יותר, מספר dCas9-VP64 או dCas9-p65 fusions צריך להתגייס על יעד בודד לוקוס9,10. ככזה, ההתפתחות האחרונה של מפעילים הדור הבא, אשר לגייס תחומים אפקטור מרובים על-ידי מורכבת dCas9 יחיד-gRNA, כגון SunTag, הביא חזק הפעלה יכולת השוואה בין dCas9-VP64 פיוז'ן עמיתיהם11 , 12. תעתיק הפעלה משופרת התקבל באמצעות היתוך גרעיני של VP64, p65 Rta (VPR), transactivation לתחום של גמא-herpesviruses, קצה קרבוקסילי של dCas913 (איור 1 א'). מערכות CRISPR/dCas9 דומות התפתחו במטרה הדיכוי (איור 1B).
ג'ין אנדוגני דיכוי יכולה להיות מושגת עם fusions מדכא. שבולם שעברו הנדסה לאחור באמצעות מגוון רחב של מנגנונים (איור 1B). הוכח כי מערכות CRISPR/dCas9, לקשר את מדכא. שבולם DBD (אפילו בלי אפקטור תחום/s), ביעילות תסתמי כבר ביטוי גנים בעוד קשור יזם או נגד הזרם/במורד הזרם-TSS אזורים3,6 ,14. ההשפעות על שעתוק נגרמת על ידי הפרעה הסטריים של איגוד פקטור שעתוק ועיבוד RNA פולימראז. עם זאת, גישות מקיף יותר נדרשים, כמו ג'ין דיכוי מאת לבד הסטריים מכשלה הוא לעתים קרובות לא מספיק בשביל להשתיק חזקים. ההתפתחות האחרונה של הדור הבא של משתיקי קול בהתבסס על מערכות CRISPR/dCas9 נושא מדכא. שבולם תעתיק תחומים (TRDs), מכפילי היסטון (H3-K9 di-/ tri-מתילציה, H3-K27 di-/ tri-מתילציה; H3-K36 di-/ tri-מתילציה, H3/H4 deacetylation), ואת מתילציה DNA (CpG) הוביל את בניית כלים epigenetic ומאפשר עמידים יותר להשתיק אפקטים4,5,15,16, 17,18,19,20. זה הוכח, כי הגיוס של אלה epigenetic מכפילי ה-DNA עשוי להוביל להיווצרות עוד כרומטין סגור, והם מרוכז, אשר בדרך כלל להפיק יותר חזק שתיקה התוצאה21,22. התחום שתיקה הנפוץ ביותר בשימוש עם DBDs הוא4,Krüppel-הקשורים תיבת (קראב)5. הגיוס של הגורם הוכח כדי להתכתב עם כרומטין השינויים; ובכל זאת, המנגנון של שינויים אלה הם עדיין להיות מבואר16,17,18. לאחרונה, הוכח כי הלוקליזציה של קראב ל- DNA יכול לקדם את מכלול של methyltransferase היסטון את SETDB1, את מתחמי NuRD deacetylation (HDAC) היסטון, מציעה את האפשרות כי אינטראקציות אלה לתווך את היווצרות עיבוי כרומטין, תעתיק שתיקה3,13. כגישה חלופית, אפקטור תחומים יכול להיות דבוקה DBDs ליצירת חלבון שתיקה epigenetic מותאם אישית. מערכת זו מזרז ישירות דכאניים סימוני הדנ א או שינויים היסטון.
לאחרונה, השימוש במערכות CRISPR/dCas9 סינתטי קשור האנזים DNMT3A יש כבר לשנות את ייעודו עבור הביטול תעתיק. DNMT3A מזרז מתילציה DNA זה מפעילה דיכוי גנים ברמת השעתוק במהלך היווצרות של הטרוכרומטין על היזמים ג'ין אנדוגני, אחרים אזורים רגולטוריות (איור 1B)18,20. מקדונלד ואח18 ו- Vojta et al.20 היו המחברים הראשונים לדווח על כך שניתן להשתמש מתילציה DNA epigenome-ג'ין להחרשת או דיכוי, הממחיש המערכת פיוז'ן המועבר פלסמיד dCas9-DNMT3A יכול לשפר מנע בעוצמה ציטוזין מתילציה סביב ה TSS18,20. מקדונלד ועמיתים הפגינו התעסוקה של האסטרטגיה עלולה לגרום לירידה משמעותית (כ-40%) בגן מדכאי, רמות ה-mRNA CDKN2A 18. באופן דומה, פילוח האזור מקדם unmethylated של גנים באך או IL6ST מראה מתילציה CpG מוגבר זה היה בקורלציה עם הפחתה כפולה של ביטוי גנים20. המעבדה שלנו יש לאחרונה לשנות את ייעודו השימוש מתילציה DNA attenuating התוצאה פתולוגית של SNCA ביטוי (איור 2)23. האסטרטגיה מבוססת על שיפור סלקטיבי מתילציה DNA בתוך אזור אינטרון 1 SNCA , כפי שדווח בעבר להיות hypomethylated PD, דמנציה עם לוי גופים (DLB) המוח24,25, 26. Hypomethylation זה נקשר ביטוי SNCA , ובכך מציעים ליעד אטרקטיבי עבור התערבות טיפולית24,27,28. אנחנו לאחרונה הראו רמה נמוכה של מתילציה DNA אינטרון SNCA 1, אזור hiPSC, נגזר וכולינרגיים NPCs המתקבל מטופל PD עם triplication SNCA 23. היתרון של מודל ניסיוני זה היא כי NPCs ניתן robustly מופצות בתרבות או נוסף הבדיל לתוך נוירונים בוגרים, הפעלת של סינון יעיל לזהות גורמים גנטיים המתווכות פנוטיפים הסלולר, כולל חמצוני מתח, אפופטוזיס29. יתר על כן, מערכת מודל זה מאפשר למדענים לסכם את האירועים התפתחותית זו לפני תחילת סימפטום בחולים. בנוסף, נגזר hiPSC NPCs מייצגים כלי נהדר כדי לבדוק את המסלולים תאית ומולקולרית המשויך ביטוי גנים. חשוב, NPCs נגזר hiPSC, בשילוב עם טכנולוגיית CRISPR/Cas9-epigenome המדינה-of-the-art יכול מאוד להקל על הפיתוח של "הדור הבא סמים" למחלות ניווניות רבות.
כדי להפחית את רמות פתולוגי של ביטוי SNCA, שפיתחנו לאחרונה מערכת מבוססת lentivirus נושא של חלבון כימרי dCas9-DNMT3A ו- gRNA כדי במיוחד היעד מתילציה CpG בתוך אינטרון SNCA 1 (איור 2 א)23. פרוטוקול זה יתאר וקטור lentiviral (LV) עיצוב וייצור בפירוט. הזינו אותו מייצגים אמצעי יעיל להעברת רכיבים CRISPR/dCas9 מכמה סיבות, כלומר מוסיף (i) את יכולת לשאת DNA מגושם, (ii) יעילות גבוהה של מגוון רחב של תאים, כולל תאים החלוקה והן nondividing30 transducing , וכן (iii) את היכולת שלהם זירוז תגובות ציטוטוקסיות ו immunogenic מינימלי. לאחרונה, אנחנו שהוחל מערכת LV נוירונים דופאמין hiPSC, נגזר מן המטופל עם triplication של מיקומה SNCA והפגינו את הפוטנציאל הטיפולי של אותו למסירה של עריכת epigenome מתילציה כלים23 ( איור 2B). ואכן, מערכת LV-gRNA/dCas9-DNMT3A גורמת עלייה משמעותית מתילציה DNA-האזור אינטרון 1 SNCA . גידול זה מתכתב עם הירידה ברמות של mRNA, חלבון SNCA 23. יתר על כן, SNCA downregulation מציל הקשורות PD פנוטיפים ב- SNCA triplication/hiPSC-derived וכולינרגיים נוירונים (למשל, מיטוכונדריאלי ROS ייצור ותא הכדאיות)23. חשוב לציין, הפגנו כי ההפחתה בביטוי SNCA על ידי מערכת LV-gRNA-dCas9-DMNT3A הוא מסוגל היפוך על הפנוטיפים האופייניים של נוירונים דופאמין hiPSC, נגזר מן המטופל PD שביצע את SNCA triplication, כגון מיטוכונדריאלי ROS ייצור ותא הכדאיות23. המטרה של פרוטוקול זה הוא 1) כדי לחלק לרמות הפרוטוקול של הפקה וריכוז של פלטפורמת LV ממוטב ליצירה צייץ בשיא ההכנות נגיפי ו 2) כדי לתאר את הבידול של hiPSCs לתוך NPCs בדוגמת להפוך וכולינרגיים בוגרת נוירונים31,32 , אפיון רמות מתילציה של האזור יישוב בתוך אינטרון SNCA 1.
פלטפורמות lentiviral יש יתרון גדול על פלטפורמת וקטור הפופולרי ביותר, כלומר adeno-הקשורים וקטורים (AAVs), אשר הוא היכולת של לשעבר להכיל מוסיף גנטי גדול33,34. AAVs ניתן ליצור תשואות גבוהות באופן משמעותי, אבל בעלי קיבולת אריזה נמוך (< 4.8 kb), להתפשר על השימוש בהם לצורך אספקת מערכות CRISPR/Cas9 ה-all-in-one. לפיכך, נראה כי אותו יהיה הפלטפורמה-של-הבחירה ביישומי מעורב אספקה של כלים CRISPR/dCas9. לכן, פרוטוקול שמפורטות כאן יהיה כלי רב ערך עבור חוקרים שרוצים להעביר ביעילות רכיבים לעריכת epigenome תאים ואיברים. פי הפרוטוקול, מתאר את האסטרטגיה כדי להגדיל את יכולות הייצור וביטוי של הווקטורים באמצעות שינוי ב- cis הרכיבים בתוך30,35קלטת ביטוי וקטור. האסטרטגיה מבוססת על הרומן מערכת שפותחה למד במעבדה שלנו ואני מדגיש את היכולת שלה לייצר חלקיקים נגיפיים בטווח של 1010 יחידות ויראלי (וו) /mL30,35.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima XPN-80 Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A99839</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;M filter unit, 1L</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45-&#956;m filter unit, 500mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100mm TC-Treated Culture Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mm TC-Treated Cell Culture dishes with 20 mm Grid</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aggrewell 800</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>34811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allegra 25R tabletop centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>369434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACS</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>338960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical bottom ultracentrifugation tubes</td>
			<td>Seton Scientific</td>
			<td>5067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tube adapters</td>
			<td>Seton Scientific</td>
			<td>PN 4230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Cell Imaging Slides</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30742060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-binding 96-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3366</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted fluorescence microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DM IRB2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit (50)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reversible Strainer</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>27215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW32Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>369650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR&#174; Disposable Serological Pipets, Glass, Nonpyrogenic</td>
			<td>VWR</td>
			<td>93000-694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR&#174; Vacuum Filtration Systems</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89220-694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xMark&#8482; Microplate Absorbance plate reader</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1681150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human embryonic kidney 293T (HEK 293T) cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>7920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Adherence Rinsing Solution</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>7010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-FOXA2 Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab60721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Nestin Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab18102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-antimycotic solution, 100X</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5955-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X), minus vitamin A</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B9879 - BES</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Albumin Fraction V (7.5% solution)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15260037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>72052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Matrigel hESC-Qualified Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>08-774-552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cosmic Calf Serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30087.04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-719</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNeasy Blood &#38; Tissue Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EpiTect PCR Control DNA Set</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>596945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ DNA Methylation Kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D5001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G1800-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15750078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentle Cell Dissociation Reagent</td>
			<td>stemCell Technologies</td>
			<td>7174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Recombinant bFGF</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>78003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Recombinant&#160;EGF</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>78006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Recombinant Shh (C24II)</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>78065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>85850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17502001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Essential Amino Acid (NEAA)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30087.04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyroMark PCR Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>978703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 media</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>72232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S8636-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STEMdiff&#160;Neural Induction Medium</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>5835</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STEMdiff Neural Progenitor Freezing Medium</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>5838</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Assay FOXA2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Hs00232764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Assay GAPDH</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Hs99999905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Assay Nestin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Hs04187831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Assay OCT4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Hs04260367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Assay PPIA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Hs99999904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA 0.05%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y27632</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>72302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p24 ELISA reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal anti-p24 antibody</td>
			<td>NIH AIDS Research and Reference Reagent Program</td>
			<td>3537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit horseradish peroxidase IgG</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>12-348</td>
			<td>Working concentration 1:1500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum, Sterile, 10mL</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9023</td>
			<td>Working concentration 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIV-1 standards</td>
			<td>NIH AIDS Research and Reference Reagent Program</td>
			<td>SP968F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal mouse serum, Sterile, 500mL</td>
			<td>Equitech-Bio</td>
			<td>SM30-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal rabbit anti-p24 antibody</td>
			<td>NIH AIDS Research and Reference Reagent Program</td>
			<td>SP451T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMB peroxidase substrate</td>
			<td>KPL</td>
			<td>5120-0076</td>
			<td>Working concentration 1:10,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMD2.G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRSV-Rev</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>52961</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>psPAX2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction enzymes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BsmBI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0580S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BsrGI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0575S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRV</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0195S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KpnI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0142S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PacI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0547S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SphI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0182S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lentiviral vector platform for the efficient delivery of epigenome-editing tools into human induced pluripotent stem cell-derived disease models

השימוש של תאים hiPSC, נגזר מייצג בגישה יקר ללמוד מחלות ניווניות אנושי. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול ממוטב עבור הבידול של hiPSCs נגזר מטופל עם triplication של אלפא-synuclein ג'ין (SNCA) מיקומה לתוך מחלת פרקינסון (PD)-אוכלוסיות עצביים וכולינרגיים הרלוונטיים. לצבירת ראיות הראה כי רמות גבוהות של SNCA הם סיבתי לפיתוח של הכרה PD. קליניות צריכים לייסד רומן גישות טיפוליות עבור PD, במיוחד אלה מיקוד ברגולציה של ביטוי SNCA , אנחנו לאחרונה פיתחה מערכת CRISPR/dCas9-מתילציה-מבוסס DNA epigenetically לווסת שעתוק SNCA על ידי העשרת רמות מתילציה האזור רגולטוריות אינטרון 1 SNCA . כדי לספק את המערכת, המורכב מת (שהפעלתם בוטלה) הגירסה של Cas9 (dCas9) התמזגו עם המחשבים קטליטי של 3A אנזים methyltransferase ה-DNA (DNMT3A), וקטור lentiviral משמש. מערכת זו חלה על תאים המכילים triplication של לוקוס SNCA ומקטין את SNCA-mRNA ואת רמות החלבון בכ 30% באמצעות מתילציה DNA יישוב של אינטרון SNCA 1. Downregulation מכויל של רמות SNCA מציל הקשורים למחלות פנוטיפים הסלולר. בפרוטוקול הנוכחי, אנו שואפים לתאר את הליך שלב אחר שלב עבור המבדילים hiPSCs לתוך ובתאים עצבית (NPCs) ואת הממסד אימות של מבחני pyrosequencing על ההערכה של הפרופיל מתילציה SNCA אינטרון 1. חלוקה לרמות ביתר פירוט את המערכת lentivirus-CRISPR/dCas9 שימוש בניסויים אלה, פרוטוקול זה מתאר כיצד לייצר ולטהר, להתרכז וקטורים lentiviral כדי לסמן להתאמתם עבור epigenome ואת הגנום-יישומים לעריכת באמצעות hiPSCs ו- NPCs. הפרוטוקול ניתנת להתאמה בקלות והוא יכול לשמש כדי לייצר כייל נוגדנים גבוה lentiviruses ליישומים במבחנה ויוו.

אימות של titers הייצור של הווקטורים LV-dCas9-DNMT3A-GFP/פורו בהשוואה לכנף GFP תמים
אנו לבצע p24מחסום פה אליסה כדי להשוות בין titers הפיזי של LV-dCas9-DNMT3A-GFP/פורו עם עמיתיהם GFP/פורו תמימה. התוצאות נציג, המוצגים באיור 5A, מדגימים כי ה?...

Watch this Scientific Journal Video about Lentiviral Vector Platform for the Efficient Delivery of Epigenome-editing Tools into Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Disease Models at JoVE.com

Lentiviral Vector Platform for the Efficient Delivery of Epigenome-editing Tools into Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Disease Models

לפלח epigenome DNA עריכה מייצג גישה טיפולית רב-עוצמה. פרוטוקול זה מתאר את הייצור, טיהור, הריכוז של ה-all-in-one וקטורים lentiviral מסתירים את transgene CRISPR-dCas9-DNMT3A עבור יישומים לעריכת epigenome בתא גזע pluripotent המושרה אנושי (hiPSC)-נגזר נוירונים.

וקטור lentiviral פלטפורמה למסירה יעיל של כלי עריכת Epigenome לתוך האדם המושרה מודלים המחלה נגזר תאי גזע Pluripotent

The use of hiPSC-derived cells represents a valuable approach to study human neurodegenerative diseases. Here, we describe an optimized protocol for the ...

פלטפורמת וקטור Lentiviral יש יתרון גדול על פני פלטפורמת וקטור הפופולרי ביותר, במיוחד בגלל היכולת של וקטורים lentiviral להכיל הכנסה גנטית גדולה יותר. לכן, נראה כי וקטור lentiviral יהיה הפלטפורמה של בחירה ביישום כרוך באספקה של כלי CRISPR / Cas. טכניקה זו מחקה את המנגנון הרגולטורי הטבעי של ביטוי אלפא-סינוקליין אשר כאשר לקוי קשורים למחלות.זה מאפשר כוונון עדין של רמת הביטוי לעומת שינויים חזקים בביטוי גנים. אני ממליץ בחום לאמת גישות אלה או דומות באמצעות RNAs מדריך מרובים להקרנה. יש שונות רבה בעוצמת RNA מדריך.הדרך היחידה לקבוע את זה היא שיש סינון ואימות חזקים ומקיפים. ניתן להתאים בקלות את המערכת המפותחת למערכות מודל אחרות כגון מודלים של בעלי חיים, כולל מכרסמים ופרימטים לא אנושיים. ניסוי מעקב זה יכול לשמש כהוכחה לתפיסה למחקרים קליניים עתידיים.הדגמת ההליך תהיה ד"ר יקטרינה איליצ'יץ', חברת צוות בכירה במעבדה שלי, המתמקדת בביצוע הליך שיבוט מולקולרי ליצירת פלסמידים וקטורים Lentiviral הקשורים לפרויקט זה. היא גם תדגים את הצעדים המרכזיים הכרוכים בייצור וקטור Lentiviral. כמו כן ידגים את ההליך ד"ר לידיה Tagliafierro, פוסטדוק מהמעבדה שלי התמקדות ההידור של תאי iPS אנושיים לתאים רלוונטיים פתולוגיים.היא תדגים את הצעדים המרכזיים בהקמת מסיסים כדי להעריך את פרופילי המתילציה של סינוקליין intron1. אהילה סריקנדה, חברת צוות במעבדה שלי שמתמקדת בתרבות של תאי אב עצביים אנושיים שמקורם בתאי IPS. כדי להתחיל, לפתח את התחום הקטיטי DNMT3A מן d-Cas9-DNMT3A-GFP על ידי הגברת החלק DNMT3A של הווקטור.לאחר עיכול שבר DNMT3A באמצעות אנזים הגבלת BamH1. להלביש אותו לתוך אתר BamH1 של וקטור PBK-301 שונה נושאת d-Cas9 ואומת על ידי רצף סנגר ישיר, כדי להחליף את הגן הכתב Meissen טהור ואת הפלסמיד וכתוצאה מכך עם תקציר GFP d-Cas9-DNMT3A-P2A טהור Meissen ופלסמיד עם FSC 1. מטהרים את שבר הווקטור בשיטת טיהור ג'ל.הכן את ההוספה על ידי עיכול PBK-201 עם FSC-1. שכפל את קטע FSC 1 לווקטור כדי ליצור d-Cas9-DNMT3A-P2A-GFP. מעיל 15 ס"מ צלחות עם 0.2% ג'לטין עבור transfection ולחכות 10 דקות.לאחר מכן שאפו את הג'לטין והוסיפו 22.5 מיליליטר של מדיום גלוקוז גבוה ו-2.5 מיליליטר של השעיית תאי HEK-293T בתרבות בעבר. הדגירה את הצלחות ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2 עד להגיע 70 עד 80% confluence. כדי להכין את תערובת הפלסמיד מספיקה לצלחת של 115 ס"מ השתמש בארבעת הפלסמידים המתוארים בכתב היד.הוסף 312.5 ליטרים של כלוריד סידן טוחן אחד לאותו צינור 15 מיליליטר עם פלסמיד ולהביא את הנפח הסופי ל 1.25 מיליליטר באמצעות מים מזוקקים כפול סטרילי. הוסיפו בעדינות 1.25 מיליליטר של שתי תתינות X BBM לצינור תוך כדי מערבולת. דגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.שאפו את המדיום מהתאים והוסיפו 22.5 מיליליטר של DMEM גלוקוז גבוה שהוכן טרי ללא סרום. מוסיפים 2.5 מיליליטר של תערובת transfection טיפה חכם לכל צלחת. מערבלים את הצלחות והדלגות ב-37 מעלות צלזיוס עם 5%CO2 במשך שעתיים עד שלוש שעות לאחר הדגירה מוסיפים 2.5 מיליליטר סרום לצלחת כדי להשיג 10% דילול ודגירה לילה ב-37 מעלות צלזיוס עם 5%CO2.כדי לקצור את הנגיף לאסוף את supernatant מכל התאים מגולפים ולמשוך אותם 50 צינורות חרוט מיליליטר. צנטריפוגה ב 400 כדי 450 גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר ולאחר מכן לסנן את supernatant דרך יחידת מסנן ואקום מיקרומטר 0.45. הבא ליצור שיפוע סוכרוז על ידי הכנת צינורות צנטריפוגה אולטרה חרוטיים.בזהירות להוסיף את supernatant מסונן לשיפוע על ידי הפצה שווה של supernatant ויראלי בין כל צינור צנטריפוגה אולטרה מילוי לפחות שלושה רבעים של כל צינור. צנטריפוגה הדגימות ב 70000 גרם במשך שעתיים ב 17 מעלות צלזיוס. לאסוף בעדינות 30%-60% שברי סוכרוז לתוך צינורות נקיים להוסיף קר 1X PBS עד 100 מיליליטר של נפח הכולל פיפס מספר פעמים לערבב.בזהירות להוסיף ארבעה מיליליטר של 20% סוכרוז ב 1X PBS לכל צינור כדי לרביט את ההכנה הנגיפית להמשיך על ידי צינורות כ 20 עד 25 מיליליטר של הפתרון הנגיפי לכל צינור. בזהירות לאזן את הצינורות ולאחר מכן צנטריפוגה ב 70000 גרם במשך שעתיים ב 17 מעלות צלזיוס. בזהירות שאף את הנוזל הנותר כדי להסיר לחלוטין את כל הנוזל עוזב את הנגיף המכיל כדורי אשר בקושי גלויים כתמים שקופים קטנים.לאחר ריקון העל טבעי להפוך את הצינורות על מגבות נייר כדי לאפשר את הנוזל הנותר לנקז. הוסף 70 מיקרו ליטר של PBS 1X לצינור הראשון ביסודיות פיפטה להשעות מחדש את גלולה. מעבירים את ההשעיה לצינור הבא וחוזרים עם צינורות והעברה עד שכל הכדורים מושעים מחדש.מוסיפים 50 מיקרו ליטרים נוספים של PBS 1X לצינור הראשון ומערבבים לשטוף אותו. לאחר מכן להעביר את ההשעיה לצינור השני לשטוף ולהמשיך עם כביסה והעברה כמו קודם לכן, מניב כ 120 מיקרו ליטר של ההשעיה הסופית חלבי מעט. צנטריפוגה ב 10000 גרם במשך 60 שניות כדי לקבל השעיה ברורה להעביר את supernatant לצינור חדש ולעשות חמישה מיקרו ליטר aliquot ולאחסן אותם שלילי 80 מעלות צלזיוס מקום Cryov חיוג עם MD NPC לתוך בלוק חום 37 מעלות צלזיוס במשך שתי דקות ולהעביר את התאים המופשרים לצינור חרוט 15 מיליליטר עם 10 מיליליטר של DMEM-F12 חם.צנטריפוגה ב-300 גרם לחמש דקות. שאפו את העל-טבעי והשעו מחדש את התאים בשני מיליליטר של מדיום N2B2 מלא מחומם מראש. הוסף שני מיליליטר של N2B27 לתליית התא וצלחת שני מיליליטר של תאים בכל באר של BMM שהוכן בעבר שישה צלחת היטב.דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2 לילה. כאשר MD NPCs הם ב 70%confluence, להתגמש אותם על ידי הוספת שני מיקרו ליטרים של מדריך lentivirus RNA d-Cas9-DNMT3A וקטורים בעדינות לסובב את הצלחת. לאחר הדגירה של התאים באותם תנאים כמו קודם לכן במשך 16 שעות להחליף את N2B27 בינוני 48 שעות לאחר ההעתקה.הוסף N2B27 עם חמישה מיקרוגרם למיליליטר של מייסן טהור כדי להשיג את קווי MD NPC יציבים, לגדל את התאים במשך שלושה שבועות N2B27 בתוספת Meissen טהור לאפיין את פרופיל מתילציה של SNCA אינטרון 1. ראשית לחלץ DNA מכל קו תא מתמר יציב באמצעות ערכת מיצוי DNA, לאחר מכן להשתמש 800 ננוגרם של DNA לבצע המרה bisulfide עם ערכה מסחרית זמינה ולאחר מכן DNA מומר bisulfide ל 20 ננוגרם לליטר מיקרו. לניתוח רצף pyro להכין את התערובת הראשית PCR בגרעין צינור חינם להעביר את צלחת התגובה לתרמו-cycler ולהתחיל את PCR.דמיינו את האמפליקונים באמצעות שני מיקרו ליטרים של מוצר PCR עם 30 וכתמי ברומיד בעקבות אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז. עבור מסיאי רצף פירו השתמשו בתערובות של מתילציה ומתילציה על ידי DNAs מומרים סולפידים וריגנטים רצף פירו כמתואר בכתב היד. חשב את ערכי המתילציה עבור כל אתר CPG באמצעות תפוקות פיזיות של תוכנת רצף pyro של Lentivirus d-Cas9-DMMT3A-GFP וקטור GFP נאיבי שנוצר באמצעות פרוטוקול זה דומים.הדבר מצביע על כך שהתועלת של עמוד השדרה הווקטורי הממוטב בשילוב עם תוצאות פרוטוקול הייצור הממוטבות בתשואות גבוהות יותר של וקטור CRISPR-dCas9 וקטורים של וקטור Lentivirus d-Cas9-DNMT3 GFP וקטור היה נמוך פי ארבעה מזה של וקטור GFP נאיבי מציע כי יעילות האריזה של CRISPR d-Cas9-RNA מופחת. שיעורי התמרה של וקטור PURO נאיבי היו גבוהים פי חמישה בהשוואה לווקטור d-Cas9-DNMT3A. תוצאות אלה אושרו עוד יותר באמצעות GFP נאיבי ו d-Cas9-DNMT3A-GFP.הפרוטוקול מבוסס EB המתואר כאן מאפשר בידול של MD NPCs. hiPSCs הביעו סמן עוצמה הנאה אוקטובר4 בעוד NPC MD מבוטא הן נסטין ו FoxA2. שבעה מסיונות רצף פירו תוכננו ו אומתו לכימות מצב המתילציה ב- SNCA intron 1.כל 7 הראיות אומתו והראו מתאם ליניארי, באמצעות הראיה מאומתת ניתן היה לקבוע את רמות המתילציה ב 23 CPGs ב SNCA intron 1 הדבר החשוב ביותר לזכור מאשר השתתפות בהליך זה הוא לעבוד עם תאים להראות צמיחה נכונה ובריאות כדי להבטיח עקביות על פני ניסויים. הייצור של וקטורים עדשים מודגש במצגת זו ניתן לאמץ בקלות לייצור של אינטגרלים נגד וירוסים לקוי זה גם ניתן לשנות בקלות כדי ליצור כמויות גדולות יותר או וקטורים מרוכזים יותר. טכניקה זו יכולה לסלול את הדרך לחקור את ההשפעה הפתוגנית של גנים דה ויסות על גיל הקשורים ולא הפרעות גרניות כולל מחלת אלצהיימר ודמנציות הקשורות.היתרון של וקטורים עדשים לפתח כאן הוא שזה לא סכנה או לא וקטורים עדשים זיהומיות יש רק השפעה מינימלית על מחזור התא הם בטוחים ואמין פלטפורמת משלוח עבור יישומים ריפוי גנטי.

Research

JoVE Journal

Genetics

Systemic Delivery of MicroRNA Using Recombinant Adeno-associated Virus Serotype 9 to Treat Neuromuscular Diseases in Rodents

משלוח מערכתית של MicroRNA באמצעות וירוס רקומביננטי Adeno-הקשורים Serotype 9 לטיפול מחלות נוירומוסקולריות אצל מכרסמים

RNA interference via the endogenous miRNA pathway regulates gene expression by controlling protein synthesis through post-transcriptional gene silencing. ...

An Array-based Comparative Genomic Hybridization Platform for Efficient Detection of Copy Number Variations in Fast Neutron-induced Medicago truncatula Mutants

An Array-based Comparative Genomic Hybridization Platform for Efficient Detection of Copy Number Variations in Fast Neutron-induced Medicago truncatula Mutants

מבוסס על מערך השוואתי גנומית הכלאה פלטפורמה יעילה לזיהוי של עותק מספר וריאציות במוטציות מהר ניוטרון-induced אספסת truncatula

Mutants are invaluable genetic resources for gene function studies. To generate mutant collections, three types of mutagens can be utilized, including ...

A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells

פרוטוקול עבור הייצור של וקטורים Lentiviral חשוכת-Integrase עבור CRISPR/Cas9-מתווכת נוקאאוט גנטי חלוקת תאים

Lentiviral vectors are an ideal choice for delivering gene-editing components to cells due to their capacity for stably transducing a broad range of cells ...

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

העובר Microinjection, טכניקת ההשתלה מניפולציה הגנום Nasonia vitripennis

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

שיבוש גנטי יעילים ביותר מאתר ואנושי Hematopoietic ובתאים מאת CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

Lentiviral Mediated Production of Transgenic Mice: A Simple and Highly Efficient Method for Direct Study of Founders

Lentiviral מתווכת הייצור של העכברים הטרנסגניים: שיטה פשוטה ויעילה מאוד עבור לימוד ישיר של המייסדים

For almost 40 years, pronuclear DNA injection represents the standard method to generate transgenic mice with random integration of transgenes. Such a ...

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

בידוד, אפיון, ההנדסה הגנטית מבוסס-MicroRNA, בתאי גזע אנושיים זקיק שיניים

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

חלבון אנדוגני תיוג-אנוש המושרה בתאי גזע Pluripotent באמצעות CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

Isolating, Sequencing and Analyzing Extracellular MicroRNAs from Human Mesenchymal Stem Cells

בידוד, קביעת רצף וניתוח מיקרו Rna חוץ-תאי של גזע Mesenchymal אנושי

Extracellular and circulating RNAs (exRNA) are produced by many cell types of the body and exist in numerous bodily fluids such as saliva, plasma, serum, ...

Lentiviral Mediated Gene Silencing in Human Pseudoislet Prepared in Low Attachment Plates

לנטינגינה ג'ין מתווכת השתקה האדם פסאודו איון מוכן לוחות מצורף נמוך

Various genetic tools are available to modulate genes in pancreatic islets of rodents to dissect function of islet genes for diabetes research. However, ...