Name: lentiviral vector platform for the efficient delivery of epigenome-editing tools into human induced pluripotent stem cell-derived disease models
Uploaded: 2019-03-29T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lentiviral Vector Platform for the Efficient Delivery of Epigenome-editing Tools into Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Disease Models at JoVE.com

Questo lavoro è stato finanziato in parte dal Kahn neurotecnologie Development Award (di O.C.) e istituti di salute nazionale Istituto nazionale dei disordini neurologici e colpo (NINDS/NIH) (R01 NS085011 di O.C.).

1. sistema progettazione e produzione di Virus
<ol><li>Costruzione e progettazione di plasmide Nota: La costruzione di un vettore di LV-gRNA-dCas9-DNMT3A all-in-one viene eseguita utilizzando una produzione- e cassetta di espressione espressione-ottimizzata pubblicato da Ortinski et al.30. La cassetta di vettore trasporta una ripetizione del sito riconoscimento del fattore di trascrizione Sp1 e un'omissione di state-of-the-art all'interno il non tradotte (U3'...

LVs hanno cominciato ad emergere come il veicolo della scelta per l'editing di epigenoma, soprattutto nel contesto delle malattie genetiche, principalmente dovuto la loro capacità di (i) di ospitare grandi carichi utili di DNA e (ii) trasducono efficientemente una vasta gamma di divisione e cellule nondividing. L'efficacia di grande imballaggio del LVs è particolarmente utile per le applicazioni che coinvolgono imballaggio dei sistemi CRISPR/dCas9 che sono di grandi dimensioni. Da questa prospettiva, LVs rappresentano ...

Più piattaforme di editing-epigenome sono stati recentemente sviluppati per indirizzare eventuali sequenze di DNA nelle regioni che controllano l'espressione genica1,2. Gli strumenti di editing epigenome creati sono progettati per (i) regolare la trascrizione, (ii) modificare le modifiche post-traduzionali degli istoni, (iii) modificare la metilazione del DNA e (iv) modulano interazioni elemento regolatore. L'approccio di ancorare i modificatori di trascrizione/cromatina a un Cas9 (morto) disattivato (dCas9) generato da precedentemente sviluppati piattaforme epigenome di editing, come lo zinco dito proteine (ZFPs) e gli effettori di simil-attivatore di trascrizione (racconti), che harboring un dominio effector trascrizionale potente (ED) fuso a progettato dominio legante il DNA (DBD)3. I risultati del fenotipo desiderato come l'attivazione o la repressione è definito dalla molecola effettore ancorata ai loci endogene (Figura 1). Per creare attivatori trascrizionali programmabili, dCas9/gRNA moduli sono collegati a VP164,5,6 (Figura 1A), un dominio di attivazione virale che reclute Pol II ed il macchinario della trascrizione generale. La modifica di questo sistema ha incluso VP64, un tetramero di VP16 domini, fornendo un ancora più robusto attivazione tasso5,6. Il sistema è stato impiegato con successo per attivare le regioni codificanti e non codificanti mirando ai promotori ed elementi regolatori. Cosa importante, anche se VP64 molecole non modificano direttamente la struttura della cromatina della regione di destinazione, recluta i modificatori di cromatina che legano i risultati nella deposizione dei marchi attivo (l'eucromatina), tra cui come H3/H4 acetilazione e H3-K4 di / Tri-metilazione5,6. Oltre a VP64, la subunità p65 del complesso NF-κB umano ha stata legata alla dCas9/gRNA modulo7. È interessante notare che, il tethering di questi effettori per le regioni a Monte dei siti di inizio di trascrizione (TSSs) e all'interno di promotori si traduce in un'induzione genica forte. Tuttavia, VP64 e p65 effettori possono anche esercitare gli effetti attivatori pur essendo legata alle regioni situate a valle di TSSs e a distale rinforzatori7,8. Per suscitare una risposta trascrizionale più robusta, più fusioni dCas9-VP64 o dCas9-p65 devono essere assunti per un bersaglio singolo locus9,10. Come tale, il recente sviluppo di attivatori di prossima generazione, che reclutano domini effettrici multipli da un singolo dCas9-gRNA complesso, ad esempio SunTag, ha provocato una più forte capacità di attivazione confronto tra al dCas9-VP64 fusione controparti11 , 12. un'attivazione trascrizionale migliore è stato ottenuto mediante la fusione di VP64, p65 e Rta (VPR), un dominio di transattivazione da gamma-herpesvirus, fino al C-terminale di dCas913 (Figura 1A). Simili sistemi di CRISPR/dCas9 sono stati sviluppati per la repressione di target-specifici (Figura 1B).
Repressione del gene endogeno può essere raggiunto con fusioni derivati dal repressore attraverso una varietà di meccanismi (Figura 1B). È stato dimostrato che CRISPR/dCas9 sistemi, collegati al repressore DBD (anche senza un dominio effector/s), in modo efficiente possono tacere l'espressione genica mentre legato ad un promotore o a Monte/a valle-TSS regioni3,6 ,14. Gli effetti sulla trascrizione è causato dall'interferenza sterica del legame del fattore di trascrizione ed elaborazione di RNA polimerasi. Tuttavia, sono necessari approcci più completi, come repressione genica di sterico da solo spesso non è sufficiente per il silenziamento robusto. Il recente sviluppo della prossima generazione di silenziatori basati su sistemi CRISPR/dCas9 che trasportano domini di repressore trascrizionale (TRDs), i modificatori dell'istone (H3-K9 di-/ tri-metilazione, H3-K27 di-/ tri-metilazione; H3-K36 di-/ tri-metilazione, H3/H4 deacetilazione) e portato alla costruzione di strumenti epigenetici che permette più robusto silenziamento effetti4,5,15,16, la metilazione del DNA (CpG) 17,18,19,20. È stato dimostrato che l'assunzione di questi modificatori epigenetici al DNA può condurre alla formazione di più cromatina condensata e chiusa, che genera tipicamente un più potente silenziamento risultato21,22. Il dominio più comunemente silenziamento utilizzato con DBDs è la casella associata Krüppel (KRAB)4,5. L'assunzione del fattore è stata dimostrata per la corrispondenza con le modifiche della cromatina; Tuttavia, i meccanismi di queste modifiche sono ancora di essere chiarito16,17,18. Recentemente, è stato dimostrato che la localizzazione di KRAB al DNA possa promuovere l'Assemblea dell'istone metiltransferasi SETDB1 e i complessi di NuRD istone deacetilazione (HDAC), suggerendo la possibilità che queste interazioni mediano la formazione di condensazione della cromatina e trascrizione silenziante3,13. Come approccio alternativo, domini dell'effettore possono essere fusa a DBDs per creare una proteina di silenziamento epigenetica personalizzata. Questo sistema catalizza direttamente repressiva DNA marchi o modificazioni istoniche.
Recentemente, l'uso di sistemi CRISPR/dCas9 sintetici legato all'enzima di DNMT3A è stato reimpiegato per inattivazione trascrizionale. DNMT3a catalizza la metilazione del DNA che esercita la repressione trascrizionale durante la formazione dell'eterocromatina su promotori di geni endogeni e altre regioni regolarici (Figura 1B)18,20. McDonald et al.18 e Vojta et al.20 sono stati i primi autori a riferire che la metilazione del DNA può essere utilizzata per epigenome-genico o repressione, dimostrando che il sistema di fusione di plasmide-consegnato dCas9-DNMT3A potentemente può migliorare metilazione della citosina intorno il TSS18,20. McDonald e colleghe hanno dimostrato che l'occupazione della strategia può provocare una riduzione significativa (circa il 40%) in un gene oncosoppressore, CDKN2A mRNA livelli18. Allo stesso modo, targeting della regione non metilato promotore dei geni BACH o IL6ST Mostra aumentata metilazione di CpG che è stata correlata con una riduzione di duplice nell' espressione genica20. Il nostro laboratorio ha recentemente riproposto l'uso di metilazione del DNA per l'attenuazione dei risultati patologici di SNCA sovraespressione (Figura 2)23. La strategia si basa sul potenziamento selettivo nella metilazione del DNA all'interno della regione di introne 1 SNCA , come precedentemente è stato segnalato per essere ipometilato nel PD e demenza con Lewy (DLB) corpi cervelli24,25, 26. Questo hypomethylation è stato collegato alla sovraespressione di SNCA , offrendo così un obiettivo attraente per intervento terapeutico24,27,28. Recentemente abbiamo mostrato un basso livello di metilazione del DNA nel SNCA introne 1 regione in dopaminergici hiPSC-derivati NPC ottenute da un paziente del Palladio con la triplicazione di SNCA 23. Il vantaggio di questo modello sperimentale è che gli NPC possono essere robustamente propagati nella cultura o ulteriormente differenziati nei neuroni maturi, che consente uno screening efficace identificare i fattori genetici che mediano fenotipi cellulari, tra cui ossidativo lo stress e l'apoptosi29. Inoltre, questo sistema modello permette agli scienziati di ricapitolare gli eventi inerenti allo sviluppo che si sono verificati prima dell'insorgenza dei sintomi nei pazienti. Inoltre, hiPSC-derivati NPC rappresentano un ottimo strumento per testare le vie cellulari e molecolari connesse con l'espressione genica. D'importanza, hiPSC-derivati NPC abbinato alla tecnologia state-of-the-art CRISPR/Cas9-epigenome può facilitare notevolmente lo sviluppo di "farmaci di nuova generazione" per molte malattie neurodegenerative.
Per ridurre i livelli patologici di SNCA espressione, abbiamo recentemente sviluppato un sistema basato su lentivirus che trasportano una proteina di fusione dCas9-DNMT3A e gRNA specificamente metilazione di CpG di destinazione all'interno del SNCA introne 1 (Figura 2A)23. Questo protocollo descriverà vettore lentivirale (LV) progettazione e produzione in dettaglio. LVs rappresentano un mezzo efficace di fornire componenti di CRISPR/dCas9 per diversi motivi, vale a dire (i) la loro capacità di trasportare ingombrante DNA inserti, (ii) un'alta efficienza di trasduzione un'ampia gamma di cellule, compreso le cellule di divisione sia nondividing30 e (iii) loro capacità di indurre risposte citotossiche e immunogeniche minimale. Recentemente, abbiamo applicato il sistema di LV a neuroni dopaminergici hiPSC-derivato da un paziente con la triplicazione del locus SNCA e dimostrato il potenziale terapeutico di LVs per la consegna di editing epigenome metilazione23 ( degli strumenti Figura 2B). Infatti, un sistema di LV-gRNA/dCas9-DNMT3A provoca un significativo aumento nella metilazione del DNA alla regione dell'introne 1 SNCA . Questo aumento corrisponde con la riduzione dei livelli di mRNA e proteina SNCA 23. Inoltre, SNCA downregulation Salva fenotipi PD-relative nel SNCA triplicazione/hiPSC-derivato dopaminergico neuroni (ad esempio, mitocondriale ROS produzione e cella vitalità)23. Cosa importante, abbiamo dimostrato che la riduzione dell'espressione di SNCA dal sistema LV-gRNA-dCas9-DMNT3A è in grado di invertire i fenotipi che sono caratteristici per i neuroni dopaminergici hiPSC-derivato da un paziente di PD che ha trasportato il SNCA triplicazione, quali mitocondriale ROS produzione e cellula attuabilità23. L'obiettivo del presente protocollo è 1) per delineare il protocollo di produzione e la concentrazione di una piattaforma ottimizzata di LV per la generazione di alta-risero preparati virali e 2) per descrivere la differenziazione di hiPSCs in NPC modellato per diventare maturo dopaminergici neuroni31,32 e la caratterizzazione dei livelli di metilazione della regione mirata all'interno di SNCA introne 1.
Lentivirali piattaforme hanno un vantaggio importante sopra la piattaforma più popolare di vettore, vale a dire adeno-associato vettori (AAVs), che è capacità l'ex di ospitare grandi inserti genetici33,34. Adenoassociati possono essere generate in rendimenti significativamente più elevati ma possiedono una capacità di confezionamento basso (< 4,8 kb), compromettendo il loro uso per la distribuzione di sistemi CRISPR/Cas9 all-in-one. Così, sembra che il LVs sarebbe la piattaforma di scelta nelle applicazioni coinvolte nella fornitura di strumenti CRISPR/dCas9. Pertanto, il protocollo descritto qui sarà uno strumento prezioso per i ricercatori desiderosi di fornire in modo efficace modifica epigenome componenti di cellule e organi. Il protocollo ulteriormente delinea la strategia per aumentare le capacità di produzione ed espressione dei vettori tramite una modifica in cis degli elementi all'interno del vettore espressione cassetta30,35. La strategia si basa sul romanzo sistema sviluppato e studiato nel nostro laboratorio ed evidenzia la sua capacità di produrre particelle virali nella gamma di 1010 unità virali (VU) / ml30,35.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima XPN-80 Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A99839</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;M filter unit, 1L</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45-&#956;m filter unit, 500mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100mm TC-Treated Culture Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mm TC-Treated Cell Culture dishes with 20 mm Grid</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aggrewell 800</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>34811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allegra 25R tabletop centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>369434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACS</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>338960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical bottom ultracentrifugation tubes</td>
			<td>Seton Scientific</td>
			<td>5067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tube adapters</td>
			<td>Seton Scientific</td>
			<td>PN 4230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Cell Imaging Slides</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30742060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-binding 96-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3366</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted fluorescence microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DM IRB2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit (50)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reversible Strainer</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>27215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW32Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>369650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR&#174; Disposable Serological Pipets, Glass, Nonpyrogenic</td>
			<td>VWR</td>
			<td>93000-694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR&#174; Vacuum Filtration Systems</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89220-694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xMark&#8482; Microplate Absorbance plate reader</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1681150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human embryonic kidney 293T (HEK 293T) cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>7920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Adherence Rinsing Solution</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>7010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-FOXA2 Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab60721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Nestin Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab18102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-antimycotic solution, 100X</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5955-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X), minus vitamin A</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B9879 - BES</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Albumin Fraction V (7.5% solution)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15260037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>72052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Matrigel hESC-Qualified Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>08-774-552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cosmic Calf Serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30087.04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-719</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNeasy Blood &#38; Tissue Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EpiTect PCR Control DNA Set</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>596945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ DNA Methylation Kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D5001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G1800-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15750078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentle Cell Dissociation Reagent</td>
			<td>stemCell Technologies</td>
			<td>7174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Recombinant bFGF</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>78003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Recombinant&#160;EGF</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>78006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Recombinant Shh (C24II)</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>78065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>85850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17502001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Essential Amino Acid (NEAA)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30087.04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyroMark PCR Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>978703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 media</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>72232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S8636-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STEMdiff&#160;Neural Induction Medium</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>5835</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STEMdiff Neural Progenitor Freezing Medium</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>5838</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Assay FOXA2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Hs00232764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Assay GAPDH</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Hs99999905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Assay Nestin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Hs04187831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Assay OCT4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Hs04260367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Assay PPIA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Hs99999904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA 0.05%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y27632</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>72302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p24 ELISA reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal anti-p24 antibody</td>
			<td>NIH AIDS Research and Reference Reagent Program</td>
			<td>3537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit horseradish peroxidase IgG</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>12-348</td>
			<td>Working concentration 1:1500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum, Sterile, 10mL</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9023</td>
			<td>Working concentration 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIV-1 standards</td>
			<td>NIH AIDS Research and Reference Reagent Program</td>
			<td>SP968F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal mouse serum, Sterile, 500mL</td>
			<td>Equitech-Bio</td>
			<td>SM30-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal rabbit anti-p24 antibody</td>
			<td>NIH AIDS Research and Reference Reagent Program</td>
			<td>SP451T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMB peroxidase substrate</td>
			<td>KPL</td>
			<td>5120-0076</td>
			<td>Working concentration 1:10,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMD2.G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRSV-Rev</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>52961</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>psPAX2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction enzymes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BsmBI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0580S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BsrGI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0575S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRV</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0195S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KpnI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0142S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PacI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0547S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SphI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0182S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lentiviral vector platform for the efficient delivery of epigenome-editing tools into human induced pluripotent stem cell-derived disease models

L'uso di cellule derivate da hiPSC rappresenta un valido approccio per lo studio di malattie neurodegenerative umane. Qui, descriviamo un protocollo ottimizzato per la differenziazione di hiPSCs derivata da un paziente con la triplicazione del luogo del gene (SNCA) dell'alfa-synuclein nel morbo di Parkinson (PD)-popolazioni neuronali dopaminergici pertinenti. Raccogliendo la prova ha dimostrato che alti livelli di SNCA sono causativi per lo sviluppo del PD. riconoscere l'insoddisfatte necessario stabilire nuovi approcci terapeutici per PD, specialmente quelli targeting per la regolazione dell'espressione di SNCA , abbiamo recentemente ha sviluppato un sistema CRISPR/dCas9-DNA-metilazione-based per epigeneticamente modulano la trascrizione di SNCA arricchendo i livelli di metilazione presso la regione regolatrice di SNCA introne 1. A consegnare il sistema, costituito da un morto (disattivato) versione di Cas9 (dCas9) fuso con il dominio catalitico del 3A enzima DNA metiltransferasi (DNMT3A), viene utilizzato un vettore lentivirale. Questo sistema viene applicato alle celle con la triplicazione del locus SNCA e riduce la SNCA-mRNA e livelli della proteina di circa il 30% attraverso la metilazione del DNA mirato di SNCA introne 1. Il fine-tuned downregulation dei livelli SNCA Salva fenotipi cellulari correlati alla malattia. Il protocollo attuale, ci proponiamo di descrivere una procedura dettagliata per la differenziazione hiPSCs nella cellule progenitrici neurali (NPC) l'istituzione e la convalida di pyrosequencing saggi per la valutazione del profilo di metilazione in SNCA introne 1. Per strutturare in modo più dettagliato il sistema di lentivirus-CRISPR/dCas9 utilizzato in questi esperimenti, questo protocollo descrive come produrre, purificare e concentrare vettori lentivirali e per evidenziare la loro idoneità per applicazioni epigenome - e -editing genomico utilizzando hiPSCs e NPC. Il protocollo è facilmente adattabile e può essere usato per produrre lentivirus di alto titolo per applicazioni in vitro e in vivo.

Convalida dei titoli di produzione dei vettori LV-dCas9-DNMT3A-GFP/Puro rispetto alla controparte GFP ingenuo
Abbiamo effettuato p24gag ELISA da confrontare tra titoli fisici di LV-dCas9-DNMT3A-GFP/Puro con le controparti GFP/Puro ingenuo. Risultati rappresentativi, presentati in Figura 5A, dimostrano che rese fisiche dei vettori, generati utilizzando il protocollo descri...

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Lentiviral Vector Platform for the Efficient Delivery of Epigenome-editing Tools into Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Disease Models

Mirati epigenome DNA modifica rappresenta un approccio terapeutico potente. Questo protocollo descrive la produzione, purificazione e concentrazione di vettori lentivirali all-in-one che harboring il transgene CRISPR-dCas9-DNMT3A per applicazioni di modifica epigenome in cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC)-derivato di neuroni.

Piattaforma di vettore lentivirale per la consegna efficiente di strumenti di editing Epigenome nelle umane indotte da modelli di malattia derivati da cellule staminali pluripotenti

The use of hiPSC-derived cells represents a valuable approach to study human neurodegenerative diseases. Here, we describe an optimized protocol for the ...

La piattaforma vettoriale lentivirale ha un grande vantaggio rispetto alla piattaforma vettoriale più popolare, in particolare a causa della capacità dei vettori lentivirali di ospitare inserti genetici più grandi. Pertanto, sembra che il vettore lentivirale sarebbe la piattaforma preferita nell'applicazione che prevede la consegna di strumenti CRISPR / Cas. Questa tecnica imita il meccanismo regolatore naturale dell'espressione alfa-sinuleina che quando è compromessa è associata a malattia.Permette la messa a punto del livello di espressione rispetto ai robusti cambiamenti nell'espressione genica. Consiglio vivamente di convalidare questo o approcci simili utilizzando più RNA guida per lo screening. C'è una grande variabilità nella potenza dell'RNA guida.L'unico modo per determinarlo è lo screening e la convalida robusti e completi. Il sistema sviluppato può essere facilmente adattato ad altri sistemi modello come modelli animali tra cui primati roditori e non umani. Questi esperimenti di follow-up potrebbero servire da prova di concetto per futuri studi clinici.A dimostrare la procedura sarà la Dott.ssa Ekaterina Ilich, membro senior dello staff del mio laboratorio, focalizzata sull'esecuzione della procedura di clonazione molecolare per la creazione di Plasmidi Vettoriali Lentivirali relativi a questo progetto. Dimostrerà anche i passaggi chiave coinvolti nella produzione lentivirale vector. A dimostrare la procedura sarà anche la Dott.ssa Lidia Tagliafierro, un postdoc del mio laboratorio incentrato sulla differenziazione delle cellule iPS umane in cellule patologiche rilevanti.Dimostrerà i passaggi chiave nella creazione di saggi per valutare i profili di metilazione della synucleina intron1. Ahila Sriskanda, un membro dello staff del mio laboratorio che si concentra sulla cultura delle cellule progenitrici neurali derivate dalle cellule iPS umane. Per iniziare, sviluppare il dominio catalitico DNMT3A dal d-Cas9-DNMT3A-GFP amplificando la porzione DNMT3A del vettore.Dopo aver digerito il frammento DNMT3A usando un enzima di restrizione BamH1. Cloat nel sito BamH1 del vettore PBK-301 modificato che trasporta d-Cas9 e verificato dal sequenziamento diretto di Sanger, per sostituire il gene reporter Meissen puro e il plasmide risultante con GFP digerire d-Cas9-DNMT3A-P2A puro Meissen e plasmide con FSC 1. Purificare il frammento vettoriale usando un metodo di purificazione del gel.Preparare l'inserto digerendo PBK-201 con FSC-1. Clonare il frammento FSC 1 nel vettore per creare d-Cas9-DNMT3A-P2A-GFP. Rivestire piatti da 15 centimetri con gelatina allo 0,2% per la trasfezione e attendere 10 minuti.Quindi aspirare la gelatina e aggiungere 22,5 millilitri di mezzo ad alto contenuto di glucosio e 2,5 millilitri di sospensione cellulare HEK-293T precedentemente coltivata. Incubare le piastre a 37 gradi Celsius con 5%CO2 fino a raggiungere il 70-80% di confluenza. Per preparare la miscela plasmide sufficiente per la piastra di 115 centimetri utilizzare i quattro plasmidi descritti nel manoscritto.Aggiungere 312,5 micro litri di un cloruro di calcio molare allo stesso tubo da 15 millilitri con i plasmidi e portare il volume finale a 1,25 millilitri utilizzando acqua sterile a doppia distillazione. aggiungere delicatamente 1,25 millilitri di due soluzione X BBM cadere saggiamente sul tubo durante il vortice. Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente.Aspirare il mezzo dalle cellule e aggiungere 22,5 millilitri di DMEM ad alto glucosio appena preparato senza siero. Aggiungere 2,5 millilitri della miscela di trasfezione cadere saggiamente su ogni piatto. Ruotare le piastre e incubare a 37 gradi Celsius con 5%CO2 per due o tre ore dopo l'incubazione aggiungere 2,5 millilitri di siero per piastra per ottenere il 10% di diluizione e incubare durante la notte a 37 gradi Celsius con 5%CO2.Per raccogliere il virus raccogliere il supernatante da tutte le cellule trasfette e tirarle in tubi conici da 50 millilitri. Centrifugare a 400-450 g per 10 minuti a temperatura ambiente e quindi filtrare il supernatante attraverso un filtro sottovuoto da 0,45 micrometri. Successivamente creare un gradiente di saccarosio preparando tubi conici ultra centrifugati.Aggiungere con cura il supernatante filtrato al gradiente distribuendo equamente il supernatante virale tra ogni tubo ultra centrifugato riempiendo almeno tre quarti di ciascun tubo. Centrifugare i campioni a 70000 g per due ore a 17 gradi Celsius. Raccogliere delicatamente dal 30% al 60% di frazioni di saccarosio in tubi puliti aggiungere PBS 1X freddo fino a 100 millilitri di volume totale e pipetta più volte da mescolare.Aggiungere con cura quattro millilitri di saccarosio al 20% in 1X PBS a ciascun tubo per stratificare la preparazione virale continuare pipettando circa 20-25 millilitri della soluzione virale per ogni tubo. Bilanciare accuratamente i tubi e quindi centrifugare a 70000 g per due ore a 17 gradi Celsius. Aspirare con cura il liquido rimanente per rimuovere completamente tutto il liquido lasciando il virus contenente pellet che sono appena visibili come piccole macchie traslucide.Dopo aver svuotato il supernatante invertire i tubi su tovaglioli di carta per consentire al liquido rimanente di drenare. Aggiungere 70 micro litri di 1X PBS al primo tubo e pipettare accuratamente per sospendere di nuovo il pellet. Trasferire la sospensione sul tubo successivo e ripetere con pipettazione e trasferimento fino a quando tutti i pellet non vengono ri-sospesi.Aggiungere altri 50 micro litri di 1X PBS al primo tubo e mescolare per lavarlo. Quindi trasferire la sospensione sul secondo tubo per lavare e continuare con il lavaggio e il trasferimento come in precedenza, producendo circa 120 micro litri della sospensione finale leggermente lattiosa. Centrifugare a 10000 g per 60 secondi per ottenere una sospensione chiara trasferire il supernatante su un nuovo tubo e rendere aliquota di cinque micro litri e conservarli a -80 gradi Celsius posizionare un Cryovial con MD NPC in un blocco termico di 37 gradi Celsius per due minuti e trasferire le celle scongelate in un tubo conico da 15 millilitri con 10 millilitri di DMEM-F12 caldo.Centrifuga a 300 g per cinque minuti. Aspirare il supernatante e sospendere di nuovo le cellule in due millilitri di mezzo N2B2 completo prerimpito. Aggiungere due millilitri di N2B27 alla sospensione cellulare e placcare due millilitri di cellule in ogni pozzo della piastra di pozzo precedentemente preparata con codice BMM.Incubare le cellule a 37 gradi Celsius con 5%CO2 durante la notte. Quando gli NPC MD sono al 70% di confluenza, trasdurli aggiungendo due micro litri di vettori di guida del lentivirus RNA d-Cas9-DNMT3A e ruotare delicatamente la piastra. Dopo aver incubato le cellule alle stesse condizioni di prima per 16 ore sostituire il mezzo N2B27 48 ore dopo la trasduzione.Aggiungere N2B27 con cinque microgrammi per millilitro di Meissen puro per ottenere le linee NPC MD stabili, far crescere le cellule per tre settimane in N2B27 più Meissen puro per caratterizzare il profilo di metilazione dell'introne SNCA 1. Prima estrarre il DNA da ogni linea cellulare del trasduttore stabile utilizzando un kit di estrazione del DNA, quindi utilizzare 800 nanogrammi di DNA per eseguire una conversione di bisolffuro con un kit disponibile in commercio e quindi un DNA convertito in 20 nanogrammi per micro litro. Per l'analisi piro-sequenziamento preparare la miscela master PCR in un tubo privo di nucleo trasferire la piastra di reazione a un termociclore e avviare la PCR.Visualizza gli ampliconi usando due micro litri di prodotto PCR con una colorazione a 30 e bromuro a seguito dell'elettroforesi del gel di Agarosio. Per i saggi piro-sequenzianti si usavano miscele di DNA convertiti con solfuro e reagenti piro-sequenzianti come descritto nel manoscritto. Calcolare i valori di metilazione per ogni sito CPG utilizzando le rese fisiche del software di piro-sequenziamento del vettore Lentivirus d-Cas9-DMMT3A-GFP e il vettore NAIVE GFP generato utilizzando questo protocollo sono comparabili.Ciò suggerisce che l'utilità della dorsale vettoriale ottimizzata combinata con il protocollo di produzione ottimizzato si traduce in rese elevate più strette dei tassi di trasduzione dei vettori CRISPR-dCas9 del vettore GFP Lentivirus d-Cas9-DNMT3 quattro volte inferiori a quelli del vettore NAIVE GFP suggerendo che l'efficienza di imballaggio del CRISPR d-Cas9-RNA è ridotta. I tassi di trasduzione del vettore PURO ingenuo erano cinque volte superiori rispetto al vettore d-Cas9-DNMT3A. Questi risultati sono stati ulteriormente confermati utilizzando naive GFP e d-Cas9-DNMT3A-GFP.Il protocollo basato su EB qui descritto consente la differenziazione dei PNG MD. hiPSC espresso piacere marcatore di potenza Oct4 mentre l'MD NPC è espresso sia Nestin che FoxA2. Sette test di piro-sequenziamento sono stati progettati e convalidati per la quantificazione dello stato di metilazione nell'introne 1 della SNCA.Tutti e 7 i test sono stati convalidati e hanno mostrato una correlazione lineare, utilizzando i test convalidati è stato possibile determinare i livelli di metilazione ai 23 CG nell'introne 1 della SNCA La cosa più importante da ricordare rispetto alla partecipazione a questa procedura è lavorare con cellule che mostrano una crescita e una salute adeguate per garantire coerenza tra gli esperimenti. La produzione di vettori lenticchie evidenziati in questa presentazione può essere facilmente adottata alla produzione di integrali carenti anti-virus che è anche può essere facilmente scalata fino a generare quantità maggiori o vettori più concentrati. Questa tecnica può aprire la strada all'esplorazione dell'impatto patogeno dei geni che si derenovono sull'età o sui disturbi generativi tra cui il morbo di Alzheimer e le relative demenze.Il vantaggio dei vettori lenticchie che si sviluppano qui è che non è pericoloso o non i vettori lenticchie infettivi hanno solo un effetto minimo sul ciclo cellulare, sono una piattaforma di somministrazione sicura e affidabile per applicazioni di terapia genica.

Research

JoVE Journal

Genetics

Systemic Delivery of MicroRNA Using Recombinant Adeno-associated Virus Serotype 9 to Treat Neuromuscular Diseases in Rodents

Consegna sistemica di MicroRNA usando ricombinanti Virus Adeno-associato sierotipo 9 per trattare malattie neuromuscolari in roditori

RNA interference via the endogenous miRNA pathway regulates gene expression by controlling protein synthesis through post-transcriptional gene silencing. ...

Ricerca

Genetica

An Array-based Comparative Genomic Hybridization Platform for Efficient Detection of Copy Number Variations in Fast Neutron-induced Medicago truncatula Mutants

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Una basata su Array Comparative Genomic ibridazione piattaforma per efficiente rilevamento di copia numero variazioni nei mutanti veloce neutrone-indotta Medicago truncatula

Mutants are invaluable genetic resources for gene function studies. To generate mutant collections, three types of mutagens can be utilized, including ...

A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells

Un protocollo per la produzione di vettori lentivirali integrasi-carenti per CRISPR/Cas9-mediata Knockout del Gene nelle cellule in divisione

Lentiviral vectors are an ideal choice for delivering gene-editing components to cells due to their capacity for stably transducing a broad range of cells ...

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

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Microinjection di embrione e tecnica di trapianto per la manipolazione del genoma di Nasonia vitripennis

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex ...

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Rottura del Gene altamente efficiente di cellule progenitrici ematopoietiche Murine ed umane di CRISPR/Cas9

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To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

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Proteina endogena Tagging in umani hanno indotto le cellule staminali pluripotenti utilizzando CRISPR/Cas9

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Lentiviral Mediated Gene Silencing in Human Pseudoislet Prepared in Low Attachment Plates

Lentiviral mediato gene silenziamento in pseudoislet umano preparato in piastre a basso attaccamento

Various genetic tools are available to modulate genes in pancreatic islets of rodents to dissect function of islet genes for diabetes research. However, ...